Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Özet

Burada, izole ve fare peritoneal mast hücreleri yetiştirmek için bir protokol mevcut. Biz de onların fonksiyonel karakterizasyonu için iki protokol tarif: hücre içi ücretsiz Ca^{2 +} toplama ve degranulation tahlil floresan bir görüntüleme dayalı yayımlanan β-hexosaminidase Renkölçer miktar üzerinde.

Özet

Mast hücreleri (MCs), bağışıklık sisteminin bir parçası olarak ana bilgisayar çeşitli patojenlere karşı savunmak ve alerjik bağışıklık yanıtı başlatılması önemli bir rol oynar. MCs aktivasyonu IgE bağlı yüksek afinite IgE reseptör (FcεRI) yanı sıra çeşitli diğer reseptörleri uyarılması yoluyla yüzey cross-linking üzerinden ücretsiz intrasellüler Ca^{2 +} düzeyi yükselişi başlatır ([Ca^{2 +}]_ben) Bu inflamatuar ve alerjik arabulucu yayın teşvik etmektedir. Moleküler bileşenlerin bu sinyal yollar dahil tanımlaması MC işlevi Yönetmeliği anlamak için önemlidir. Bu makalede, biz fare bag doku türü MCs peritoneal lavaj tarafından yalıtım ve periton MCs (PMCs) tarımı için bir iletişim kuralı tanımlamak. MCs kültürleri Bu metodoloji tarafından çeşitli nakavt fare modellerinden proteinler yolları sinyal MC dahil tanımlaması için faydalı bir yaklaşım temsil eder. Buna ek olarak, ayrıca MCs. floresans tabanlı izleme [Ca^{2 +}]_ben içinde sinyal Ca^{2 +} miktar için önemli bir teknik bir güvenilir olduğu gibi tek hücre Fura-2 görüntüleme için bir protokol açıklar ve sık kullanılan yaklaşım olaylar, MC harekete geçirmek için son derece önem taşıyor kalsiyum deposu ile çalışan giriş de dahil olmak üzere sinyal Ca^{2 +} çalışma. MC degranulation analiz için β-hexosaminidase yayın tahlil açıklar. Degranulation kalem MCs. β-hexosaminidase içinde açıklanan tüm üç farklı salgı alt kümeleri için kolayca onun reaksiyonu ile bir colorigenic substrat tarafından sayısal olarak β-hexosaminidase kültür orta serbest miktarı kabul edilir bir microtiter plaka Renkölçer tahlil. Bu son derece tekrarlanabilir teknik düşük maliyetli ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Genel olarak, yüksek bir verim sağlanan iletişim kuralı gösterir tipik MC yüzey işaretleyicileri ifade MCs MCs tipik morfolojik ve fenotipik özellikleri görüntülemek ve secretagogues Ca^{2 +}- son derece tekrarlanabilir yanıt gösteren görüntüleme ve degranulation deneyleri.

Giriş

MCs doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı sırasında önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle, MCs patojenler, bakteri ve parazit gibi öldürülmesi katılmak ve aynı zamanda potansiyel olarak toksik endojen peptidler veya zehirlerini (için gözden geçirme bakın Galli ve ark. 2008¹) bileşenlerinin bozulmasına yol açar. Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık MCs fizyolojik rolü ısıtmalı tartışma konusudur. Bu nedenle, çok sayıda veri tutarsızlıkları farklı MC-eksik fare modelleri ile gerçekleştirilen çalışmalarda Anti²ötesinde immünolojik fonksiyonların MCs sistematik bir yeniden değerlendirme gerektirir. Olgun MCs çoğunlukla doku ve organları deri, akciğer ve bağırsak gibi içinde lokalizedir ve genellikle küçük rakamlarla sadece kan bulunur. MCs hematopoetik öncüleri, MC ataları gibi türetilir ve onların farklılaşma ve hemen hemen tüm bozukluklarına dokular¹microenvironments içinde olgunlaşma tamamlayın. T-hücre kaynaklı faktör interlökin (IL) -3--dan onların hematopoetik ataları³seçmeli olarak canlılığı, yayılmasını önleme ve fare MCs pluripotent nüfusu farklılaşma teşvik etmektedir. Kök hücre faktörü (SCF) dokularda yapısal hücreleri tarafından üretilen ve MC geliştirme, hayatta kalma, göç ve işlev⁴önemli bir rol oynar. Bireysel MCs özelliklerini sentez ve çeşitli proteaz veya proteoglikanlar depolamak için yeteneklerini bağlı olarak farklı olabilir. Farelerde, sözde Bag Doku tipi MCs anatomik lokalizasyon, Morfoloji ve heparin ve proteaz⁵içeriğine göre mukozal MCs dan ayırt edilirler.

MCs, artış ücretsiz sitozolik Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_ben) degranulation ve üretim eikozanoidler, yanı sıra sitokinler sentezi ve transkripsiyon faktörleri yanıt antijen olarak aktivasyonu için vazgeçilmez ve çeşitli secretagogues⁶. Bir büyük aşağı akım bu uyaranlara phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate diacylglycerol (DAG) ve inositol 1,4,5-trisphosphate hidrolize Fosfolifaz C, hedeftir. Protein kinaz C DAG etkinleştirir ve IP3 Ca^{2 +} endoplazmik retikulum üzerinden iyonları serbest bırakır. Bu mağazaların tükenmesi Ca^{2 +} akını işletilen kalsiyum giriş (SOCE) depolamak için önde gelen plazma zarı Ca^{2 +} kanal, üzerinden etkinleştirir. Bu işlem, Ca^{2 +}etkileşim yoluyla uyarılmış-sensör, stromal etkileşim molekülü-1 (Stim1), Orai1⁷ ile yanı sıra geçici reseptör potansiyel kurallı (TRPC) Kanal aktivasyonu aracılığıyla endoplazmik retikulum ' proteinler (için gözden geçirme bkz: Freichel vd. 2014⁸) plazma zarı içinde.

İncelemek için bu kanal, çeşitli farmakolojik fizyolojik rolü (kanal blokerleri uygulanması) veya genetik yaklaşımlar genellikle kullanılır. İkinci durumda, protein ifade bastırılması mRNA (devirme) hedef alarak elde edilir veya genomik DNA düzenleme bir kanal (nakavt) alt birimi oluşturan bir gözenek kodlama bir exon global ya da doku-özel⁹ silme işlemine. Availability-in a kütük parçası bu kanallar için yeterli özgüllük ile sınırlıdır. Buna ek olarak, devirme yaklaşım dikkatli kullanarak, Örneğinkendi etkinliğini kontrolünü gerektirir., Batı analiz leke ve birçok durumda hedeflenen kanal protein için özel antikorlar kullanılamamasıdır tarafından engel oluyor. Böylece, nakavt fare modelleri kullanımını hala böyle analiz için altın standart olarak kabul edilir. Bir tercih edilen vitro MC fonksiyonlar soruşturma için tam olgun bir nüfus olarak izole ex vivo olabilir PMCs ekimi modeldir ( e.g--dan, MCs vitro ayırt karşı., kemik iliği hücreleri)¹⁰ . MC işlevi vitro, FcεRI ve beta-hexosaminidase uyarılması çalışmaya da sık kullanılan kemik iliği türetilmiş MCs ile karşılaştırıldığında (BMMCs), serbest 8-fold ve 100-fold PMCs, sırasıyla arttırılır. Bu makalede, saf bağ dokusu yüksek sayıda kültür 2 hafta MCs, daha fazla çözümleme için yeterli yazdıktan sonra elde etmek için izin veren fare PMCs, tarımı ve yalıtım yöntemi açıklanmaktadır.

Geliştirme ve uygulama genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerin son ilerlemeye rağmen bunların kullanım hala hedef hücrelere gen teslim zorluklar tarafından özellikle, son derece uzmanlaşmış hücreleri gibi birincil kültürlü MCs sınırlıdır. Buna ek olarak, bu grup için [Ca^{2 +}] ölçümleri_ben floresan göstergelerin hala ratiometric boyalar ile yüksek dinamik Aralık yoksun. Bu nedenlerden dolayı_ben ratiometric [Ca^{2 +}] ölçüm için tercih edilen yöntem hala floresan boya "Fura-2"¹¹kullanmaktır.

Şu anda, en sık yaklaşım MC harekete geçirmek değerlendirilmesi için kullanılan. ve degranulation β-hexosaminidase aktivitesinin ölçümdür. Β-hexosaminidase, Alerjik bir arabulucu sabit oranda MCs¹²histamin ile birlikte yayımlanan MC granül bileşenlerden biridir. Β-hexosaminidase Mikroplaka Renkölçer assay olarak kolayca algılanabilir bir colorigenic ürün ölçülebilir bir miktar üretir belirli bir yüzey ile onun reaksiyonu ile kolayca ve doğru bir şekilde ölçülebilir. Bu makalede, bir uygulama PMCs degranulation çeşitli uyaranlara yanıt olarak çözümlenmesi için bu tekniğin bildirilmektedir.

Toplama yüksek benzeşme plasmalemmal IgE reseptör (FcɛRI) bir yayın salgı granül içerik çevreleyen ekstrasellüler alanda önde gelen bir çok yönlü hücre içi sinyal yolu, MCs içinde etkinleştirir. Spesifik antijen ek olarak, birçok diğer bir çekim gücü-ebilmek harekete geçirmek immunomodulatory arabulucu, tamamlayıcı anaphylatoxins gibi çeşitli bir dizi serbest bırakmak için MCs (Örn., C3a ve C5a)¹³, vasoconstrictor peptid endotelin 1 (ET1)¹⁴ , o kadar çok sayıda katyonik maddeler ve pseudoallergic reaksiyonlar provoke uyuşturucu olarak (Örn., icatibant)¹⁵ MRGPRX2¹⁶bağlama yaparak. Hücre içi sinyal yolları MRGPR kaynaklı MCs degranulation ilgili kötü FcɛRI-aracılı hücre içi sinyal ile karşılaştırıldığında karakterizedir; Bu yollar sadece son birkaç yıl¹⁷ sırasında reseptör kimlik¹⁶sonra yoğun bir şekilde incelenecektir başladı. Büyük ölçüde, plazma zarı iyon kanalları MRGPRX2 stimülasyon tarafından takip kalsiyum giriş dahil anlaşılması kalır. Bu nedenle, mevcut makale da hücre içi kalsiyum sinyal üzerinde duruluyor ve MCs degranulation MRGPR agonistleri ile uyarılmış.

Protokol

Tüm hayvan yordamları için bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının (Karlsruhe bölgesel Konseyi tarafından resmen onaylanmış) Alman mevzuat esaslarına göre yapıldı.

1. PMC yalıtım ve yetiştirme mayi lavaj tarafından

1	Buz
2	10 mL şırınga
3	27 G iğneler
4	20 G iğneler
5	Strafor blok ve toplu iğneler
6	Koleksiyon tüpler (50 mL plastik santrifüj tüpleri)
7	% 70 etanol
8	RPMI Orta (soğutulmuş ve buz üzerinde tutulması öncesi)
9	PMC Orta: RPMI orta + % 20 FCS (Fetal buzağı Serum) + %1 penisilin streptomisin çözüm (kalem-Strep)
10	Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz - DPBS (olmadan Ca2 + ve Mg2 +)
11	Kültür şişeler (25 cm)
12	Büyüme faktörleri stok çözümleri (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2.5 μg/mL)
13	Serolojik pipetler (10 mL)
14	Pipetler ipuçları steril (20-200 µL)
15	Hemasitometre
16	Tezgah santrifüj
17	Makas ve forseps
18	CO2 odası fareler için
19	Açık steril hood
20	Kapalı steril hood
21	Hücre inkübatör (37 ° C ve % 5 CO2)
22	Transfer pipetler (20-200 µL)

Tablo 1: Adım 1 için malzemeler.

1. PMC yalıtım mayi lavaj tarafından
   1. Önce hücre izolasyon, Tablo 1' de listelenen malzemeleri hazırlayın.
   2. 8 14 haftalık erkek farelere PMC yalıtım için kullanın. Bir fare CO₂ inhalasyon tarafından ötenazi ve refleks kaybı tarafından ölüm onaylayın. Fare % 70 etanol ile sprey ve iğne (dorsal tarafta aşağı) kullanarak bir köpük blokta düzeltebilirim. Künt kenar makas kullanırken fare ventral cilt kaldırın. Periton boşluğuna zarar vermemek.
      Not: Biz genellikle bu iletişim kuralı bir C57BL/6N suşu genetik geçmişi olan fareler için kullanın.
   3. 7 mL buz gibi RPMI orta ve hava 27 G iğne ile donatılmış bir 10 mL şırınga kullanarak Periton boşluğunda 5 ml enjekte. İğne dikkatle periton itin ve herhangi bir organ sorgulamaktı değil. Bir nokta epididimal yağ bölgede bir organ perforasyonu riskini azaltmak için kullanın.
   4. Enjeksiyon sonra fareyi periton hücreleri RPMI orta ayırmak 1 dk için salla. Fare çok güçlü, iç organlara zarar verme ve periton boşluğuna kan ile bulaşıcı önlemek için sallama.
   5. 10 mL şırınga ile yeni bir 20 G kanül teçhiz tarafından yeniden. İç organları köpük blok devirme ve yavaşça bankta orta aspirasyon diğer taraftan kolaylaştırmak için dokunarak bir tarafa kaydır. 20 G iğne ekleme kadar yükseltin, eğin ve nazikçe ve yavaşça karın sıvı Aspire edin (~0.5 mL/iç organları tarafından tıkanmasını önlemek için s). Kadar sıvı (genellikle 5-6 mL) mümkün olduğunca toplamak.
   6. Ve bir toplama tüp toplanan hücre süspansiyon buza transfer iğne şırıngadan çıkarın. Görünür kan kirlenme ise bir örnek tüp atmak.
   7. ~ 300 x g 5 min için de hücre süspansiyon ile tüpler santrifüj kapasitesi. Steril bir başlık altında süpernatant Aspire edin. Her fare için soğuk (4-10 ° C) 4 ml örnek parçaları birleştirmek PMC orta ve 25 cm² kültür şişesi hücre süspansiyon aktarmak. Büyüme faktörleri IL-3 ve SCF son konsantrasyonları 10 ng/ml ve 30 ng/mL, sırasıyla ekleyin. Bir kuluçka (37 ° C ve % 5 CO₂) hücreleri içeren şişeye koyun ve ~ 48 h için sonraki yordama kadar kuluçkaya.
2. PMC kültür
   1. 2. gün (~ 48 h yalıtım sonra): orta değiştirmek
      1. Kaldırmak için (eritrositler ve ölü hücreleri), süpernatant ve yapışık olmayan hücreleri Aspire şişeye ortamından Pasteur pipet ucu şişeye kenarında yerleştirerek ve şişeye neredeyse yatay tutarak. Önceden ısıtılmış PMC orta fare başına 4 mL ekleyin. Büyüme faktörleri IL-3 Ekle (10 ng/mL) ve SCF (30 ng/mL). Bir kuluçka (37 ° C ve % 5 CO₂) hücreleri içeren şişeye koyun.
   2. 9. gün: hücre bölme
      1. Hücre süspansiyon hücre kültür balonun 50 mL plastik santrifüj tüpüne aktarın. Üç kez 10 önceden ısınmış mL (37 ° C) Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) ile şişeye yıka, plastik santrifüj kapasitesi ile aynı 50 mL müstakil hücrelerde hücre süspansiyon toplama tüp. Bir hemasitometre tarafından hücre konsantrasyonu saymak ve hücrelerin toplam sayısını hesaplamak.
      2. ~ 300 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Önceden ısıtılmış PMC hücre konsantrasyonu 1 x 10⁶ hücre/mL elde etmek için orta (37 ° C) Pelet kurtarmak. Hücre süspansiyon için yeni bir 25 cm² kültür şişesi aktarın. Altına kalarak fibroblastlar ile eski şişesi atmak.
      3. Büyüme faktörleri IL-3 Ekle (10 ng/mL) ve SCF (30 ng/mL) ve bir kuluçka (37 ° C ve % 5 CO₂) hücreleri içeren şişeye koyun.
   3. Gün 12-15: hücre ölçümleri
      1. Eğer herhangi bir deney FcɛRI reseptörlerinin uyarımı ile planlanmış, IgE anti-DNP standart kültür ortamında 300 ng/mL gecede hücrelerle pretreat. Adım 2 adım 3 ile devam.

2. Fluorometrik hücre içi ücretsiz kalsiyum konsantrasyonu ölçümü PMCs

1. Ölçümleri önce Tablo 2' de listelenen malzemeleri hazırlayın. Ayrıca, bir görüntüleme oluşan Kur hazırlayın: floresan mikroskop ters; Amaç: 40 X / 1.3 petrol; Fura 2 filtre ayarlamak; CCD kamera; Uyarma ışık kaynağı; Görüntüleme satın alma programı; Yerçekimi beslenen çözüm uygulama sistemi.

1	PMC (12-15 gün eski) 1 x 106 hücre/mL
2	Concanavalin A
3	Fura-2 AM
4	Pluronic F-127% 20 çözüm
5	Kapak paket fişi gözlük turu; ø 25 mm; No 1
6	DNP-HSA (dinitrophenol-insan serum albümin) hisse senedi çözüm
7	Anti-DNP-antikor (IgE) hisse senedi çözüm
8	Düz alt plaka (12 kuyu)
9	Bileşik 48/80 hisse senedi çözüm
10	De Chambers Imaging kapak
11	Hemasitometre
12	Transfer pipetler (20-200 µL)

Tablo 2: Malzemeler için adım 2.

2. Fura-2 görüntüleme hazırlık
   1. Gerçekleştirmek bir hemasitometre kullanan bir hücre sayısı ve hücre konsantrasyonu 1 x 10⁶ hücre/ml ayarlayın. PMCs kolonileri yavaşça (3-5 defa) 1 mL pipet ucu ile hücre süspansiyon pipetting tarafından bölünmüş.
   2. Bir Ca^{2 +}hazırlamak-HEPES içeren tamponlu tuz solüsyonu (Ca^{2 +}- HBSS) 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES ve 12 mM glikoz oluşur. PH 7.4 ile 3 M NaOH için ayarlayın.
   3. Concanavalin A hazırlamak her 25 mm kaplamalı slaytlarda concanavalin A çözüm (0.1 mg/mL H₂O) pipetting 1 damla tarafından yuvarlak cam steril bir başlık altında. En az 1 dk. için kapak fişleri üzerinde damla bırakın, ardından bir pipet ve kapak paket fişi kuruması için 45 dk. dikkatle basın odası Imaging kauçuk concanavalin tedavi A kapak paket fişi izin çözümle çoğunu kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek) kadar Chambers'ı görüntüleme mikroskobu elde etmek için ekleyin.
      Not: Poly-L-lizin kaplı slaytlar alternatif olarak kullanılabilir.
   4. Floresan Ca^{2 +} boya Fura-2 dağıtılması AM (1 mM) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde. Işıktan korunan bu çözüm saklayın.
   5. Fura-2 seyreltik AM hisse senedi çözümde Ca^{2 +}HBSS-"yükleme tampon" hazırlamak için 5 mikron son bir konsantrasyon için. 5 µL/mL % 20 pluronic F-127 DMSO ile ek.
   6. "Yükleme"ile tampon 500 µL PMC hücre süspansiyon Mix 500 µL. Karışım görüntüleme odasına pipette ve hücreler için 20-30 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
   7. Uygulama sistemi stimülasyon protokolüne göre farklı çözümler ile beslenen yerçekimi ayarlayın. Şırınga 1 40 mL Ca^{2 +}- HBSS çözeltisi ile tamamlamak, 40 mL 100 ng/mL DNP içeren Ca^{2 +}- HBSS çözeltisi ile 2 şırınga, 40 mL 50 µg/mL bileşik 48/80 içeren Ca^{2 +}- HBSS çözeltisi ile 3 şırınga, 4 ile 40 mL şırınga sözde Ca^{2 +}-ücretsiz-HBSS çözüm ve 5 ile sözde Ca^{2 +}40 mL şırınga-ücretsiz-2 µM içeren HBSS çözüm Thapsigargin.
   8. 40 X yüksek diyafram yağı daldırma amaç üzerinde Daldırma yağ küçük bir damla koyarak hazırlamak.
   9. Uygulama sistemi ters mikroskop sahnede monte. Uygulama sistemde yüklü hücrelerle görüntüleme odası koymak ve hareket kayıt sırasında önlemek için güvenli. İletilen ışığı ve hücreleri odaklan.
   10. Hücreleri üç kez yerçekimi beslenen uygulama sistemi kullanılarak Ca^{2 +}- HBSS arabellek ile yıkayın.
   11. Ca^{2 +}hücrelerde kuluçkaya - HBSS Fura-2 için 5 min için PM de-esterleşme.
   12. Hücreleri görüntüleme başlamadan önce bir kez daha durulama, herhangi bir potansiyel olarak kaldırmak için floresan boya sızdırılmış.
3. Hücre görüntüleme
   1. Görüntüleme satın alma programı fizyolojik satın alma modunda başlatın. Kurulum penceresini açmak ve odak ve en iyi satın alma saati ayarlama (hangi-meli var olmak için uyarma 340 ile aynı nm ve 380 nm ve genellikle aralıkları arasında 50-150 ms).
      Not: Fura-2 pozlandırmayı en aza indirmek için boya photobleaching önlemek için herhangi bir ışık dolu hücre.
   2. Bir referans resim ve hücreleri faiz (ROI) bölgeleri olarak işaretleyin. Bir alanda nerede hiçbir hücre varsa ve arka plan olarak tanımlamak son ROI işaretleyin.
   3. Kurulumu tamamlamak ve ölçüm 5 s Alım hızı ile başlar.
      Not: Hücreleri dönüşümlü olarak uyarma, 340 ile hafif vurgulanır nm ve 380 nm ve verilmiş Floresan (> 510 nm) CCD kamera ile toplanacaktır. Floresan sinyallerini F340 nm ve F380 nm gibi (F340 nm/F380 nm) oranı görüntüleri-ecek var olmak göstermek içinde üç pencere eşiği. Bireysel ROIs floresan yoğunluğu zaman ders çizelgeleri değerleri aynı zamanda sürekli olarak gösterilecek demek.
   4. Çözümler deneme tasarımına göre uygun döngüsü numaradan ekleyin:
      1. Antijen kaynaklı ölçü yükselmesine [Ca^{2 +}]_ben, için döngüsü 20 ve döngüsü sonra 150 kaydı durdurmak sonra şırınga 2 çözüm Şekil 2A, 2Bgösterildiği gibi geçerli.
      2. Bileşik 48/80 kaynaklı ayrıcalık yükselmesi [Ca^{2 +}] ölçmek için_i, Şekil 2C, resimli olarak geçerli şırınga 3 çözüm döngüsü 20 ve döngüsü sonra 150 kayıt dur sonra.
      3. Şekil 2' deDgösterildiği gibi SOCE tarafından uyarılmış [Ca^{2 +}]_ben yüksekliğini ölçmek için şırınga 4 çözüm döngüsü 10 sonra uygulamak, şırınga 5 çözüm döngüsü 70 sonra uygulamak, şırınga 4 çözüm döngüsü 120 sonra uygulamak, şırınga 1 çözüm döngüsü sonra 150 uygulamak ve döngüsü 220 sonra kaydı durdurmak.
   5. Ölçüm bitirdikten sonra sonuçları hem uyarma dalga boyu ile ve arka plan düzeltme olmadan yanı sıra ile ve her yatırım getirisi için arka plan düzeltme olmadan oranı değerleri için ölçülen yoğunluklarını içeren bir oranı tabloya dönüştürmek ve her ölçüm süresi noktası. Satın alma programı arka arkaya basın düğmeleri: "Başlat kesici", "tüm mark", "tüm dönüştürmek", "Fizyoloji ölçümleri", "Tamam,"Tamam". Tablolar ve çevrimdışı analiz için görüntü yığınları olarak dosyaları kaydedin.

3. beta-hexosaminidase yayın ölçüm PMCs

1	PMC (12-15 gün eski) 1 x 106 hücre/mL
2	Anti-DNP-antikor (IgE) hisse senedi çözüm
3	DNP HSA hisse senedi çözüm
4	Bileşik 48/80 hisse senedi çözüm
5	Ionomycin
6	96-şey plaka, v şeklinde alt
7	96-şey kaplamalar, düz dipli
8	Plastik santrifüj tüpleri (15 mL)
9	Serolojik pipetler
10	Hücre inkübatör (37 ° C ve % 5 CO2)
11	Tezgah santrifüj
12	Microtiter plaka okuyucu için optik yoğunluk ölçümleri
13	Çok kanallı pipet (20-200 μL)
14	Hemasitometre

Tablo 3: Malzeme için adım 3.

1. Önce ölçümleri, Tablo 3' te listelenen malzemeleri hazırlayın.
   Not: β-hexosaminidase MCs kendi stimülasyon sonra yayımlanan p-nitrophenyl-asetil-D-glucosamine (pNAG) p-nitrophenol ve N-asetil-D-glucosamine hidrolize. β-hexosaminidase örnek miktarı oluşturulacak p-nitrophenol miktarı ile orantılıdır. Çözümün"durdurmak" yüksek pH ortamında, p-nitrophenol tam olarak deprotonated p-nitrophenolat bulunmaktadır ve 405 ışık onun absorbans tarafından algılanan nm.
2. 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 5.6 mM glikoz ve BSA %0,1 içeren Tyrode'nın çözüm hazırlamak. PH 7.4 ile 3 M NaOH için ayarlayın.
3. Lizis çözüm Tyrode'nın çözüm Triton X-100% 1 hacmi ekleyerek hazırlayın.
4. 200 mM glisin oluşan durmak eriyik hazırlamak ve pH NaOH ile 10,7 için ayarlayın.
5. PNAG çözüm (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) çözüm pNAG 0.4 M sitrik asit son konsantrasyonu 4 mm çözülerek hazırlayın.
6. Tahlil için gerekli hücre miktarını hesaplamak (tahlil yinelenen içinde gerçekleştirin). 200.000 PMCs iyi kullanın. 2 kuyu negatif denetimleri (Tyrode'nın çözüm DNP gibi herhangi bir secretagogues veya bileşik 48/80 olmadan) kullanın ve olumlu denetimleri olarak 2 wells (Tyrode'nın çözüm 10 µM ile Ionomycin) her genotip için.
7. Hücreleri 15 mL plastik santrifüj tüpüne transfer Tyrode'nın çözüm ile 15 ml ses seviyesini ve 4 dk. süpernatant Pasteur pipet ile kaldırın ve Tyrode'nın çözüm 2 x 10⁶ hücrelere hücrelerde resuspend için de 200 x g santrifüj kapasitesi /mL.
8. Hücre süspansiyon iyi başına 100 µL bir 96-şey V-alt iyi plaka aktarın. Her şey ( Şekil 3' teAresimli pipetting düzeni göre) 25 µL stimülasyon veya kontrol çözümü ekleyin. 45 dk 37 ° C ve % 5 CO₂için hücreleri kuluçkaya.
9. Reaksiyon on Ice 5 min için 96-şey plaka koyarak durdurmak. Sonra 120 x gde 4 dk 4 ° C'de plaka santrifüj kapasitesi. Bir düz-alt 96-şey plaka için çok kanallı pipet kullanarak süpernatant ile 120 µL aktarmak ve buza koyun. Dikkatli bir şekilde hücre topakları dokunmaktan kaçının, ama tamamen süpernatant Aspire edin.
10. 125 µL lizis arabelleği hücre topakları ekleyin. Oda sıcaklığında 5 min için hücre topakları kuluçkaya ve onları kuluçka sonra tekrarlanan (yaklaşık 5 kat) pipetting tarafından resuspend.
11. Yeni bir düz-alt 96-şey plaka gerekli Wells pNAG çözüm (4 mM) 25 µL pipet. 25 µL her süpernatant her hücrenin lysate 25 µL yanı sıra hazır pNAG çözüm ekleyin.
12. Reaksiyon toplu işlemleri 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Kuluçka sonra durmak eriyik için tepki durdurmak için her şey 150 µL pipet.
13. 405 bir çift dalga boyu ayarı kullanarak Mikroplaka Okuyucu ile plaka analiz nm ile başvuru 630 nm için otomatik arka plan çıkarma. Satın alma programı, tıkırtı belgili tanımlık kutu "Başvuru" ve "Absorbans" program öğesi menüsünü seçin "630 nm" aþaðý açýlan listesinden. Örnekleri optik yoğunluğu çok yüksek ise, remeasuring önce uygun bir seyreltme inceleyebilirsek hazırlayın.
14. β-hexosaminidase açıklamasına göre aşağıdaki denklemi yüzdesini hesaplamak:
    
    Yayın [%] özel beta-hexosaminidase yayın yüzde, bir [süpernatant] arka nerede süpernatant emilimini düzeltilmiş ve arka planın bir [lysate] olduğu karşılık gelen hücre lysate emilimini düzeltildi.

Sonuçlar

PMCs 3 yaban tipi fareler (C57BL/6N) tarafından mayi lavaj izole edildi ve takıma RPMI ortamda daha fazla kültürlü % 1 ile % 20 FCS kalem-Strep büyüme faktörleri (IL-3 10 ng/mL) ve SCF 30 ng/mL steril altında huzurunda koşulları nemlendirilmelidir 37 ° C ve % 5 CO₂. Orta gün 2 ve 9 hücre izolasyon sonra değiştirildi. Hücre morfolojisi iletimi kullanılarak analiz edildi ışık DIC görüntüleme (bkz. Şekil 1A, B...

Tartışmalar

MC modelleri, MC degranulation, kemotaksis, adezyon, de hücre içi sinyal iletim yollarının MC harekete geçirmek içinde yer aydınlatmak için çalışmaya başarıyla kullanılabilir. Kullanım insan MCs modelleri, ölümsüzleştirdi hatları (LAD2 ve HMC1) veya insan MCs gibi türetilen kablosunu ve bazı araştırmacılar kan progenitör hücreler (CD133 +) ve periferik kan progenitör hücreler (CD34 +). Diğerleri kemirgen MC modelleri, (sıçan bazofilik lösemi RBL - 2 H 3 MC satır) gibi ölümsüzleştiril...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R