Изоляция Брюшина производные тучных клеток и их функциональные характеристики с Ca2 +-изображений и дегрануляции анализов

Резюме

Здесь мы представляем протокол к изоляции и культивировать мышиных перитонеальных тучных клеток. Мы также обсудим два протокола для их функциональных характеристик: флуоресцентных изображений внутриклеточных бесплатно Ca^{2 +} концентрации и пробирного дегрануляции основе колориметрические количественная оценка выпущенной β-hexosaminidase.

Аннотация

Тучные клетки (MCs), как часть иммунной системы, играют ключевую роль в защите принимающей страны против нескольких возбудителей и в инициировании аллергических иммунного ответа. Активация MCs через cross-linking поверхности IgE связана с высоким сродством IgE рецептором (FcεRI), а также путем стимулирования несколько других рецепторов, инициирует подъем уровня свободного внутриклеточных Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_я) что способствует высвобождение медиаторов воспалительных и аллергических. Идентификация молекулярных компонентов, участвующих в этих сигнальных путей имеет решающее значение для понимания регулирования MC функции. В этой статье мы опишем протокол для изоляции типа МКН, перитонеальный лаваж мышиных соединительной ткани и культивирование перитонеальный MCs (ЧВК). Культур MCs от различных моделей мыши нокаут по этой методике представляют собой полезный подход к идентификации белков, участвующих в MC, сигнальные пути. Кроме того мы также описать протокол для одной ячейки фура-2 изображений как важный метод количественного определения Ca^{2 +} сигнализации в MCs. флуоресценции основе мониторинга [Ca^{2 +}]_я является надежным и обычно используется подход к Изучите Ca^{2 +} сигнализации событий, включая вход работает магазин кальция, который имеет первостепенное значение для MC активации. Для анализа MC дегрануляции мы описываем пробирного релиз β-hexosaminidase. Количество β-hexosaminidase, выпустила в среду культуры считается дегрануляции маркера для всех три различных секреторных подмножества описанных в MCs β-hexosaminidase могут быть легко количественно по его реакции с colorigenic субстрата в микротитровальных пластины колориметрического анализа. Этот высоко воспроизводимый метод с точки зрения затрат и не требует специализированного оборудования. В целом, предоставленный протокол демонстрирует высокий урожай МКН, выражая типичный MC поверхностных маркеров, отображение типичных морфологических и Фенотипические особенности MCs и демонстрирует высокую воспроизводимость ответы на secretagogues в Ca^{2 +}- изображений и дегрануляции анализов.

Введение

МКН играть заметную роль во время врожденного и приобретенного иммунного ответа. В частности MCs участвовать в убийстве патогенов, таких как бактерии и паразиты и также ухудшить потенциально токсичных эндогенного пептидов или компоненты яды (для обзора см. Галли et al. 2008¹). Физиологическая роль МКН в врожденная и адаптивного иммунитета является предметом оживленных дискуссий. Таким образом многочисленные расхождения данных в исследованиях, выполненных с различными моделями мышь MC-недостаточным требует систематической переоценки иммунологической функции помимо специальные²МКН. Зрелые MCs преимущественно локализуются в ткани и органы, такие, как кожи, легких и кишечника и обычно находятся только в небольших количествах в крови. MCs являются производными от кроветворных прекурсоров, таких как MC прародителями и завершить их дифференцировки и созревания в микросреды почти все васкуляризированной тканей¹. Т-клеток, полученных фактор интерлейкина (IL) -3 выборочно способствует жизнеспособности, пролиферации и дифференцирования плюрипотентных населения мыши MCs от их гемопоэтических прародителями³. Стволовых клеток фактора (SCF) производится структурных клеток в тканях и играет решающую роль в развитии MC, выживания, миграции и функции⁴. Свойства отдельных MCs может отличаться в зависимости от их способность синтезировать и хранить различные протеазы или протеогликанов. В мышей так называемой соединительной ткани тип MCs отличаются от слизистой MCs согласно анатомической локализации, морфология и содержание гепарина и протеаз⁵.

В MCs, увеличение свободной цитозольной Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_я) является необходимым для дегрануляция и производства эйкозаноидов, а также для синтеза цитокинов и активация факторов транскрипции в ответ на антиген и различные secretagogues⁶. Главная задача течению этих стимулов — фосфолипаза C, который гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат диацилглицерол (DAG) и инозитол 1,4,5-trisphosphate. Даг активирует Протеинкиназа С и IP3 освобождает ионы Ca^{2 +} от эндоплазматического ретикулума. Истощение этих магазинов активирует Ca^{2 +} приток через плазматическую мембрану Ca^{2 +} каналы, ведущие к хранить запись оперированных кальция (SOCE). Этот процесс вызвал путем взаимодействия Ca^{2 +}-датчик, стромы взаимодействия молекулы-1 (Stim1), в эндоплазматический ретикулум с Orai1⁷ , а также через активацию Переходный рецепторный потенциал канонические (Термизатор) канала белки (для обзора см. Freichel и др. 2014⁸) в плазматической мембраны.

Для изучения физиологической роли этих каналов, несколько фармакологических (применение блокаторы кальциевых каналов) или генетические подходы обычно используются. В последнем случае, подавление экспрессии белка достигается путем ориентации мРНК (нокдаун) или геномной ДНК редактирования с глобальной или ткани конкретных⁹ исключить экзона кодирования поры, образуя Субблок канала (нокаут). Наличие окон с достаточной точностью для этих каналов является ограниченной. Кроме того, бросовым подход требует тщательного контроля ее эффективность с помощью, например., Западная пятно анализа и препятствует отсутствие специфических антител для целенаправленных канал протеина во многих случаях. Таким образом использование моделей мышей нокаут до сих пор рассматривается как золотой стандарт для такого анализа. Предпочтительным в vitro модель для исследования функций MC является выращивание ЧВК, которые могут быть изолированы ex vivo как полностью зрелые населения (в отличие от дифференциации МКН в vitro от, например., клетки костного мозга)¹⁰ . По сравнению с MCs костного производных (BMMCs), которые также часто используются для изучения MC функции в пробирке, стимуляция FcεRI и бета hexosaminidase релиз увеличивается спецавтотехнике и 100 раз в компании "ПМКС", соответственно. В этой статье мы опишем способ изоляции и культивирование мышиных ЧВК, который позволяет получить после 2 недель культивирования большое количество чистого соединительной ткани типа МКН, достаточного для дальнейшего анализа.

Несмотря на недавний прогресс в разработке и применении показателей генетически закодированный кальция их использование по-прежнему ограничивается трудностями в доставке генов в клетки-мишени, конкретно, в весьма специализированных клеток, таких как основной культурный MCs. Кроме того эта группа Люминесцентные индикаторы для [Ca^{2 +}]_я измерений по-прежнему не хватает ratiometric красители с высоким динамическим диапазоном. По этим причинам предпочтительным методом для ratiometric [Ca^{2 +}]_я измерения по-прежнему является использование флуоресцентных красителей «Фура-2»¹¹.

В настоящее время наиболее часто используемый подход для оценки MC активации и дегрануляции измерения β-hexosaminidase деятельности. Β-hexosaminidase, аллергических посредника, является одним из компонентов MC гранул, которые совместно выпущенные с гистамина в постоянной пропорции от MCs¹². Β-hexosaminidase легко и точно измерять через его реакции с конкретного субстрата, который производит измеримые количество colorigenic продукт, который легко обнаружить в Гонав колориметрические assay. Сообщается, что в этой статье, применение этого метода для анализа ЧВК дегрануляции в ответ на различные стимулы.

Агрегирование высокоспецифичные рецепторы плазмалеммарного IgE (FcɛRI) активирует в MCs универсальный внутриклеточных сигнальный путь, приводит к высвобождению содержание секреторных гранул в окружающем пространстве внеклеточного. Помимо специфического антигена, многие другие раздражители могут активировать MCs выпустить разнообразных иммуномодулирующих посредников, таких как дополнение anaphylatoxins (например., C3a и С5а)¹³, эндотелина вазоконстриктора пептид 1 (ЭТ1)¹⁴ , а также многочисленные Катионный вещества и препараты, провоцируя pseudoallergic реакций (например., icatibant)¹⁵ путем привязки к MRGPRX2¹⁶. Внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в MRGPR-индуцированной MCs дегрануляции характеризуются плохо по сравнению с FcɛRI опосредованной внутриклеточная сигнализация; Эти пути только начал интенсивно изучаться в течение последних нескольких лет¹⁷ после идентификации рецептор¹⁶. В основном каналы иона плазматической мембраны, участвующих в вход кальция, следуют MRGPRX2 стимуляции по-прежнему следует понимать. Таким образом настоящей статьи также фокусируется на сигнализацию внутриклеточного кальция и дегрануляции MCs стимулировали с агонисты MRGPR.

протокол

Все животные процедуры выполнялись согласно немецкого законодательства руководящие принципы ухода и использования лабораторных животных (официально утверждена Карлсруэ регионального Совета).

1. PMC изоляции и культивирования внутрибрюшинного промывание

1	Лед
2	10 мл-шприцы
3	27 G иглы
4	20 G иглы
5	Блок из пенопласта и контакты
6	Коллекции трубок (50 мл пластиковых пробирок)
7	70% этанол
8	RPMI среднего (предварительно охлажденным и хранится на льду)
9	PMC-средний: RPMI средний + 20% FCS (плода телячьей сыворотки) + 1% раствора пенициллина стрептомицина (ручка-стрептококк)
10	Фосфат Дульбекко в буфер солевой раствор - DPBS (без Ca2 + и Mg2 +)
11	Культура колбы (25 см)
12	Факторы роста запасов решения (IL-3: 1 мкг/мкл; SCF: 2,5 мкг/мл)
13	Пипетки серологические (10 мл)
14	Стерильные пипетки советы (20-200 мкл)
15	Горяева
16	Скамейка центрифуги
17	Ножницы и щипцы
18	CO2 камеры для мышей
19	Открыть капот стерильные
20	Закрыта стерильной Худ
21	Инкубатор клеток (37 ° C и 5% CO2)
22	Передача пипетки (20-200 мкл)

Таблица 1: Материалы для шага 1.

1. PMC изоляции, внутрибрюшинного промывание
   1. До изоляция клетки Подготовьте материалы, перечисленные в таблице 1.
   2. Использовать 8-14 недельных самцов мышей для изоляции PMC. Усыпить мыши на CO₂ ингаляции и подтвердить смерть, утрата рефлексов. Спрей мышь с 70% этанола и закрепить его на блока пены с помощью булавки (спинной стороне вниз). Удалите кожу брюшной мыши с помощью ножниц тупой край. Избегайте повреждения брюшной полости.
      Примечание: Мы используем обычно этот протокол для мышей C57BL/6Н штамм генетическим фоном.
   3. Придать 7 мл ледяной RPMI средних и 5 мл воздуха в брюшной полости, используя шприц 10 мл с иглой 27 G. Вставьте иглу тщательно в брюшине и не перфорировать любого из органов. Используйте место в регионе эпидидимальных жира для снижения риска перфорации органа.
   4. После инъекции встряхните мышь за 1 мин до отсоединения брюшной клеток в среду RPMI. Не трясите мыши слишком сильно, чтобы избежать повреждения внутренних органов и загрязняя брюшной полости с кровью.
   5. Повторное использование 10-мл шприц, вооружив его с новой канюли 20 G. Сдвиг внутренние органы в одну сторону, наклоняя блок пену и осторожно похлопывая его на скамейке для упрощения средних аспирации от другой стороны. Вставьте иглу 20 G, наклонной вверх и аспирационная жидкость из брюшной полости, осторожно и медленно (~0.5 мл/сек) чтобы избежать засорения на внутренние органы. Соберите как можно больше жидкости можно (обычно 5-6 мл).
   6. Извлеките иглу от шприца и передавать собранные клеток подвеска в коллекции трубку на льду. Если существует видимой крови загрязнение, отказаться от образца трубки.
   7. Центрифуга трубки с суспензию клеток в ~ 300 x g за 5 мин. Под капотом стерильные аспирационная супернатант. Для каждой мыши, объединить образец окатышей в 4 мл холодной (4 – 10 ° C) PMC среднего и передачи суспензию клеток в культуре колбу 25 см² . Добавьте факторы роста Ил-3 и SCF окончательный концентрации 10 нг/мл и 30 нг/мл, соответственно. Место флакон, содержащий ячейки в инкубатор (37 ° C и 5% CO₂) и проинкубируйте ~ 48 ч до следующей процедуры.
2. PMC-культура
   1. День 2 (~ 48 ч после изоляции): средние изменения
      1. Чтобы удалить супернатант и non сторонник клетки (эритроциты и мертвые клетки), аспирационная среднего из колбы, поместив кончик пипетка Пастера на краю колбу и держа колбу почти горизонтально. Добавьте 4 мл подогретым PMC среды на мышь. Добавьте факторы роста Ил-3 (10 нг/мл) и ФСД (30 нг/мл). Место флакон, содержащий ячейки в инкубатор (37 ° C и 5% CO₂).
   2. День 9: Ячейка колки
      1. Передача суспензию клеток от колбу культуры клеток в 50 мл трубки пластмассовые центрифуги. Мойте колбу три раза с 10 мл предварительно разогретую (37 ° C) Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS), сбора суспензии клеток с отсоединенной клетки в том же 50 мл пластиковых центрифуга трубки. Подсчет клеток концентрации с Горяева и рассчитать общее количество клеток.
      2. Центрифуга суспензию клеток на ~ 300 x g 5 минут и удалить супернатант. Восстановите Пелле в подогретым среднего PMC (37 ° C) для получения клеток концентрации 1 x 10⁶ клеток/мл. Суспензию клеток передавать новой культуры колбу 25 см² . Утилизируйте старый флакон с фибробластов, придерживаясь в нижней.
      3. Добавьте факторы роста Ил-3 (10 нг/мл) и ФСД (30 нг/мл) и место флакон, содержащий ячейки в инкубатор (37 ° C и 5% CO₂).
   3. 12 – 15 дней: мобильных измерений
      1. Если планируется любые эксперименты с раздражение рецепторов FcɛRI, предварительной обработки клеток на ночь с 300 нг/мл МГЭ анти DNP в стандартной среде культуры. Приступить к шаг 2 и шаг 3.

2. измерение концентрации флуориметрический внутриклеточных свободного кальция в компании "ПМКС"

1. До измерения Подготовьте материалы, перечисленные в таблице 2. Кроме того, подготовить изображения установки, состоящей из: инвертированный микроскоп флуоресценции; Цель: 40 X / 1,3 масла; Фура 2 набора фильтров; ПЗС-камеры; Источник света возбуждения; Программа приобретения изображений; Гравитация, кормили решение системы приложений.

1	PMC (12-15 дней) 1 x 106 клеток/мл
2	Конканавалина А
3	Фура-2 AM
4	Плюрониевого F-127 20% раствор
5	Круглые очки скользит крышка; ø 25 мм; № 1
6	Стоковый раствор DNP-HSA (динитрофенола человеческого сывороточного альбумина)
7	Стоковый раствор анти-DNP-антитела (IgE)
8	Плоское дно плиты (12 скважин)
9	Стоковый раствор составные 48/80
10	Обложка, хорошо изображений камер
11	Горяева
12	Передача пипетки (20-200 мкл)

Таблица 2: Материалы для шага 2.

2. Подготовка изображений фура-2
   1. Выполнить подсчет клеток с помощью Горяева и регулировка концентрации клеток до 1 x 10⁶ клеток/мл. Разделите колонии ЧВК, нежно дозирование (3 – 5 раз) суспензии клеток с кончиком пипетки 1 мл.
   2. Подготовить Ca^{2 +}-содержащих HEPES буфер солевой раствор (Ca^{2 +}- HBSS) состоит из 135 мм NaCl, 6 мм KCl, 2 мм CaCl₂, 1,2 мм MgCl₂, 10 мм HEPES и глюкозы 12 мм. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 с 3 M NaOH.
   3. Подготовить конканавалина А покрытием слайды дозирования 1 капля раствора (0,1 мг/мл в H₂O) конканавалина А на каждые 25 мм раунд покровным стеклом под капотом стерильные. Оставить капли на обложке скользит по крайней мере 1 мин, а затем удалить большую часть решения с пипеткой и пусть скользит крышка просушите 45 мин тщательно пресс скользит крышка конканавалина А лечение на изображений камеры резиновые (см. Таблицу материалы) до они придают получить микроскопии изображений камеры.
      Примечание: Поли-L-лизин покрытием слайдов может использоваться в качестве альтернативы.
   4. Распустить флуоресцентные Ca^{2 +} краситель фура-2 утра (1 мм) в диметилсульфоксида (ДМСО). Храните это решение, защищенном от света.
   5. Разбавить фура-2 AM Стоковый раствор в Ca^{2 +}- HBSS к окончательной концентрации 5 мкм для того, чтобы подготовить буфере «загрузки». Дополнение с 5 мкл/мл 20% плюрониевого F-127 в ДМСО.
   6. Смесь 500 мкл «загрузки буфера» с 500 мкл суспензии клеток PMC. Пипетка смесь в тепловизионной камеры и инкубации клеток для 20-30 мин при комнатной температуре в темноте.
   7. Настройка гравитации, кормили системы приложений с различными решениями согласно протокола стимуляции. Дополнение 1 шприц с 40 мл Ca^{2 +}- HBSS раствора, шприц 2 с 40 мл Ca^{2 +}- HBSS раствора, содержащего 100 нг/мл ДНП, шприц 3 с 40 мл Ca^{2 +}- HBSS раствора, содержащего подворье 48/80 50 мкг/мл шприц 4 с 40 мл номинально Ca^{2 +}-бесплатно-HBSS решения и шприц 5 с 40 мл номинально Ca^{2 +}-бесплатно-HBSS раствор, содержащий 2 мкм увеличивается.
   8. Подготовьте 40 X нефти высокой апертуры погружения цель, поместив небольшое падение погружения нефти на нем.
   9. Смонтируйте системы приложений на сцене инвертированным микроскопом. Тепловизионные камеры с загруженной клетки в системе приложений и для предотвращения их перемещения во время записи. Включите пропускаемого света и сосредоточиться клетки.
   10. Промойте клетки три раза с Ca^{2 +}- HBSS буфера с помощью системы самотечных приложений.
   11. Инкубировать клетки в Ca^{2 +}- HBSS за 5 мин для фура-2 AM де этерификации.
   12. Промойте клетки еще один раз перед началом съемки, чтобы удалить любой потенциально утечка Люминесцентную краску.
3. Клеток
   1. Запустите программу приобретения изображений в режиме физиологических приобретения. Откройте окно Настройка и отрегулируйте фокус и оптимальное приобретение время (которое должно быть одинаковым для возбуждения с 340 Нм и 380 Нм и обычно колеблется от 50 – 150 мс).
      Примечание: Свести к минимуму воздействие фура-2 загружен ячейку для любой свет, чтобы избежать Фотообесцвечивание красителя.
   2. Изображение изображение ссылкой и пометить клетки как регионы интереса (ROI). Марк последний ROI в районе, где нет клетки присутствуют и определить его как фон.
   3. Завершите установку и начать измерение с коэффициентом приобретение 5 s.
      Примечание: Клетки будут поочередно освещаться с возбуждением, свет 340 Нм и 380 Нм и испускаемого флюоресценция (> 510 нм) будут собраны с использованием ПЗС-камеры. Образы флуоресценции сигналы F340 Нм и F380 Нм, а также отношение (F340 Нм/F380 Нм) будет отображаться в трех окнах. Графики времени курс индивидуальных интенсивности флуоресценции ROIs означает, что значения будут отображаться также непрерывно.
   4. Добавление решения в номер надлежащего цикла, согласно дизайн эксперимента:
      1. В меру антиген индуцированной высота [Ca^{2 +}],_якак показано на рисунке 2, 2B, применяют раствор шприц 2 после цикла 20 и остановить запись после цикла 150.
      2. Для измерения высоты подворье 48/80-индуцированной [Ca^{2 +}]_i,как показано на рис. 2C, применяют раствор шприц 3 после цикла 20 и остановить запись после цикла 150.
      3. Для измерения высоты [Ca^{2 +}],_я вызвал SOCE, как показано в рисунке 2D, применять раствор шприц 4 после цикла 10, применять раствор шприцем 5 после цикла 70, применять раствор шприц 4 после цикла 120, применять раствор шприцем 1 после цикла 150 и остановить запись после цикла 220.
   5. После окончания измерения, преобразуйте результаты в соотношении таблицу, содержащую измерения интенсивности для длин волн возбуждения с и без коррекции фон, а также значения соотношения с и без коррекции фон для каждого ROI и каждая точка измерения времени. В программе приобретения, последовательно нажмите кнопки: «начало резец», «пометить все», «перевести все», «физиология измерений», «Ok, «Ok». Сохраните файлы как таблицы и стеки изображений для анализа в автономном режиме.

3. бета hexosaminidase измерения выпуска в компании "ПМКС"

1	PMC (12-15 дней) 1 x 106 клеток/мл
2	Стоковый раствор анти-DNP-антитела (IgE)
3	Стоковый раствор DNP-HSA
4	Стоковый раствор составные 48/80
5	Ionomycin
6	96-луночных плита, v образный снизу
7	96-луночных пластины, плоское дно
8	Пластиковых пробирок (15 мл)
9	Пипетки серологические
10	Инкубатор клеток (37 ° C и 5% CO2)
11	Скамейка центрифуги
12	Микротитровальных плита читатель для измерения оптической плотности
13	Многоканальные пипетки (20-200 мкл)
14	Горяева

Таблица 3: Материалы для шага 3.

1. До измерения Подготовьте материалы, перечисленные в таблице 3.
   Примечание: β-hexosaminidase освобожден от MCs после их стимуляции гидролизует p нитрофенил ацетил D-глюкозамина (pNAG) в p нитрофенола и N-ацетил D-глюкозамина. Количество β-hexosaminidase в образце пропорциональна количество p нитрофенола, который будет сформирован. В среде высоких рН раствора «стоп», p нитрофенола существует как полностью депротонированная p-nitrophenolat и может быть обнаружен, его поглощения света в 405 нм.
2. Подготовка Tyrode в раствор, содержащий 130 мм NaCl, 5 мм KCl, 1,4 мм CaCl₂, 1 мм MgCl₂, 10 мм HEPES, 5,6 мм глюкозы и BSA 0,1%. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 с 3 M NaOH.
3. Приготовляют раствор лизиса, добавив 1% объем Тритон X-100 Tyrode решения.
4. Готовят раствор стоп, состоящий из 200 мм глицин и скорректировать рН до 10,7 с NaOH.
5. Приготовляют раствор pNAG решение (4-нитрофенил 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) путем растворения pNAG в лимонной кислоты 0,4 М до конечной концентрации 4 мм.
6. Рассчитать количество необходимых для assay клетки (выполнить пробу в двух экземплярах). Использование 200000 ЧВК за хорошо. Используйте 2 скважин как негативный контроль (Tyrode в раствор без каких-либо secretagogues как DNP или составные 48/80) и 2 скважин как позитивные элементы управления (Tyrode в раствор с 10 мкм Ionomycin) для каждого генотипа.
7. Перевести клетки в 15 мл пластиковых пластиковых пробирок, Отpегулиpуйте уpовень до 15 мл с Tyrode в раствор и центрифуги на 200 x g 4 мин удалить супернатант с пипетка Пастера и Ресуспензируйте клетки в Tyrode и решение 2 х 10⁶ клеток / мл.
8. Передавать 100 мкл суспензии клеток за хорошо 96-луночных V-хорошо днище. Добавьте 25 мкл стимуляции или решение управления для каждой скважины (согласно схемы дозирования, показано на рисунке 3A). Инкубируйте клетки для 45 минут при 37 ° C и 5% CO₂.
9. Остановите реакции, поместив 96-луночных пластины на льду на 5 мин. Затем центрифуга пластину на 4 ° C на 4 мин на 120 x g. Передача 120 мкл супернатанта, используя многоканальные пипетки на 96-луночных тарелку с плоским дном и поместите его на льду. Осторожно прикасайтесь ячейки гранулы, но полностью удалить супернатант.
10. Мкл 125 буфера lysis клетки гранул. Инкубации клеток гранулы для 5 мин при комнатной температуре и Ресуспензируйте их после инкубации, неоднократные дозирование (примерно в 5 раз).
11. Пипетка 25 мкл раствора pNAG (4 мм) в требуемый скважинах новой пластинкой 96-луночных с плоским дном. Добавьте 25 мкл от каждого супернатант подготовленный pNAG решения, а также 25 мкл каждого lysate клетки.
12. Инкубировать реакции партий за 1 ч при 37 ° C. После инкубации Пипетка 150 мкл стоп решения для каждой скважины, чтобы остановить реакции.
13. Анализировать пластину с Считыватель микропланшетов с помощью параметра двойной длины волны в 405 нм с ссылкой 630 Нм для автоматического фон вычитание. В программе приобретения, поставьте галочку в поле «Ссылка» и выберите в меню элемент программы «Поглощения», «630 Нм» из раскрывающегося списка. При слишком высокой оптической плотности образцов, подготовьте соответствующие разрежения зонда перед заново определить размеры.
14. Рассчитайте процент выпуска β-hexosaminidase по следующему уравнению:
    
    Релиз [%], где процент выпуска конкретных бета hexosaminidase, [супернатант] это фон исправлены поглощение супернатанта, и [лизатных] — фон исправлены поглощения соответствующих lysate клетки.

Результаты

ЧВК были изолированы от 3 дикого типа мыши (C57BL/6Н), внутрибрюшинного промывание и далее культивировали в среде RPMI дополнены с FCS 20% и 1% перо-стрептококк в присутствии факторы роста (IL-3 на 10 нг/мл) и СКФ в 30 нг/мл в стерильных увлажняется условий на 37 ° C и 5% CO₂. Средство б...

Обсуждение

MC модели могут успешно использоваться для изучения MC дегрануляции, хемотаксис, сцепления, а также разъяснению внутриклеточных сигнальных путей участвует в активации MC. Некоторые исследователи, использование человека MCs модели, такие как увековечена линии (LAD2 и HMC1) или человека MCs произ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R