黑色素瘤细胞衍生因子对骨髓脂肪分化的双重影响

摘要

在这里, 我们提出了一个可靠和直接的二维 (2D) 共培养系统, 研究肿瘤细胞和骨髓细胞之间的相互作用, 这表明黑色素瘤干细胞衍生因子的双重作用对骨髓脂肪的影响分化, 也为骨转移的机械学研究提供了经典的方法。

摘要

骨髓脂肪细胞与癌细胞的串扰在骨转移过程中起着至关重要的作用。有多种方法可用于研究显著的串扰;然而, 共培养的二维 transwell 系统仍然是这种串扰研究的经典、可靠、简便的方法。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 显示了骨髓脂肪细胞和黑色素瘤的共培养。然而, 这种共培养系统不仅有助于研究骨髓脂肪细胞诱导的癌细胞信号 transductions, 而且可以为今后骨转移的机械学研究提供新的治疗靶点。转移。

引言

骨转移在晚期癌症患者中普遍存在, 但治疗仍不可用。除了专门储存能量作为脂肪, 脂肪细胞可以支持肿瘤生长和转移骨髓和其他器官^1,2,3,4,5,6。此外, 脂肪细胞在调节癌细胞生物学^{7、8、9、10}和新陈代谢方面起着至关重要的作用,^{4、11、12 ,13,14,15,16}, 以及在骨转移^1,4,12。在骨髓小生境中, 脂肪细胞还会影响癌细胞^4、6、17的生物学行为。骨髓脂肪细胞与癌细胞 osteotropism 的相互作用对了解骨转移有重要意义。然而, 鲜为人知。

根据目前的研究, 各种方法适用于脂肪细胞, 包括两个或三维 (2/3 d) 和体外培养^{17,18,19,20,21}。最近, Herroon等人设计了一种新的 3 d-培养方法来研究骨髓脂肪细胞与癌细胞的相互作用²²。虽然3D 共培养是最佳的模仿脂肪细胞和癌细胞在体内的生理相互作用, 它的重现性差^22,23。与2D 共培养系统相比, 3D 共培养系统可以提供不同的细胞表型, 如细胞形态学^{21、22、24、25、26}。此外, 分离的松质骨组织片段的体外培养可以导致骨髓细胞培养出¹⁷的生长脂肪体。

然而, 与以前的模型相比, 2D 细胞培养模型仍然是一种经典的、可靠的、易于快速扫描候选分子的技术, 在体外¹的脂肪细胞或癌细胞中的表型改变^{, 4,6,12,15,27}.为更好地了解骨髓脂肪细胞与黑色素瘤的相互串扰, 我们提供了一个详细的协议, 为2D 共培养系统的骨髓脂肪细胞与黑色素瘤。

研究方案

注: 本协议中使用的所有细胞在解冻后, 应至少生长三代。

1. 收获黑色素瘤细胞衍生因子

1. 准备
   1. 获得 B16F10 细胞和小鼠黑色素瘤细胞系。
      注: 本协议中, 从中国科学院干细胞库获得了一条小鼠黑色素瘤细胞系。
   2. 制作一个完整的培养基为 B16F10 细胞培养 (100 毫升)。使用 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 补充10% 胎牛血清 (血清), 50 毫升青霉素和50µg/毫升链霉素。
   3. 为 B16F10 细胞 (50 毫升) 的饥饿做无血清培养基。使用 DMEM 培养基, 不加血清, 50 毫升青霉素和50µg/毫升链霉素。
2. 制备黑色素瘤条件培养基 (厘米)
   1. 种子 2.0 x 10⁵ B16F10 细胞在100毫米盘与10毫升10% 血清 DMEM。然后在 5% CO₂ 24 小时的大气层中孵化出37摄氏度孵化器中的细胞。
   2. 当细胞达到80% 的汇合, 移除培养基, 用5毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (1x, pH 7.4) 清洗细胞, 并用10毫升无血清培养基替代培养基, 以使饥饿。
   3. 将细胞归还给 18–24 h 的孵化器。
   4. 饥饿后, 收集条件培养基 (CM) 与吸管和转移到一个新鲜的50毫升离心管。
      注: 条件培养基为 B16F10 细胞培养的上清液。确保 B16F10 细胞在收集 CM 之前状态良好。
   5. 离心机 CM 为5分钟在 1000 x g在4°c。
   6. 将上清液吸管移到新鲜的无菌管或瓶中。
      注意: 避免吹打在管子底部的颗粒。
   7. 要去除细胞碎片, 过滤 CM 通过通过注射器连接0.45 µm 过滤器在无菌瓶或管子之上。
      注: 0.22 µm 过滤器是最佳的过滤 CM。
   8. 将过滤后的上清液贮存在摄氏-20 摄氏度, 直至使用。
      注: 最好不要将上清液贮存在摄氏-20 摄氏度以上的一个月以上。或者, 将 CM 保存在-80 摄氏度以上, 以延长脂肪细胞的分化时间。

2. 黑色素瘤细胞衍生因子诱导骨髓脂肪组织的研究

1. 准备
   1. 使100毫升的脂肪感应介质²⁸。使用完整的 DMEM 补充5µg/毫升胰岛素, 0.5 毫米3异丁基 1-甲基黄嘌呤和1µM 地塞米松。存储在4摄氏度的两个星期。
   2. 准备100毫升的脂肪维护培养基。使用完整的 DMEM 或混合50% 黑色素瘤 CM 补充5µg/毫升胰岛素。
   3. 做油红色 O 库存解决方案。将30毫克的油红 O 粉溶于10毫升异丙醇 (≥ 99.5%), 并将其与涡流混合均匀。
      注: 储存1年在4摄氏度。
   4. 做一个油红色 O 工作解决方案。在油烟机中, 稀释油红色 O 型股票溶液 (从步骤 2.1.3) 与去离子水的比例为3:2。在室温下孵化混合物15分钟, 并在使用前通过0.22 µm 过滤器进行过滤。
      注: 仅在2小时内使用新的工作解决方案。
2. 脂肪细胞分化
   1. 培养一个基质细胞线14F1.1 从小鼠骨髓²⁹在60毫米菜与一个完全 DMEM 在80% 融合在37°c 孵化器在 5% CO₂的大气中。
      注: 或者, 用原发骨髓间充质细胞取代 14F1.1³⁰。
   2. 胰蛋白酶处理细胞与1.5 毫升的0.25% 胰蛋白酶溶液在一个孵化器中的最小。
   3. 在细胞中加入5毫升10% 的血清, 用玻璃 hemocytometer 计数细胞数;然后调整细胞密度约 10⁵/毫升。
   4. 种子 5 x 10⁴的14F1.1 细胞每井在24井板与0.5 毫升的脂肪诱导培养基。经过两天的孵化, 细胞达到90% 的汇合。
      注意: 这一步非常关键。骨髓基质细胞在没有脂肪诱导培养基的情况下不能诱导为脂肪组织。
   5. 每次取出感应介质, 用1毫升的 PBS 清洗两次细胞。
   6. 改变到1毫升的脂肪维持培养基, 并继续培养细胞直到脂肪成熟。
      注: 在显微镜下, 脂肪细胞看起来像小或大肥皂泡, 很容易辨认。通常, 成熟的脂肪细胞存在于 6日或 8天。
   7. 用油红色 O 染色成熟脂肪细胞或收集脂肪细胞进行定量聚合酶链反应 (qPCR) 分析。
3. 脂肪细胞染色
   1. 用 PBS 清洗分化的14F1.1 细胞 2x, 并将其固定在3.7% 甲醛中1小时。
   2. 冲洗60% 异丙醇的细胞, 使其完全干燥。
   3. 在油井中加入0.2 毫升油红色 O 工作溶液, 在室温下孵化0.5 至2小时。
   4. 用清水冲洗细胞, 除去未粘合的染料。
   5. 在光显微镜下拍摄染色脂肪细胞。

3. 骨髓脂肪细胞与黑色素瘤共培养的研究

1. 准备
   1. 制备成熟的骨髓脂肪细胞: 用脂肪诱导培养基在24井板中诱导14F1.1 干细胞成成熟的 BM 脂肪, 2 天, 然后在脂肪维持培养基中维持6–8天。
   2. 准备 B16F10 细胞: 培养5毫升 DMEM 培养基的60毫米菜肴中的 B16F10 细胞。
   3. 滋润膜插入物 (如transwell): 添加150µL 的无血清 DMEM 培养基到0.4 µm 孔大小膜插入, 并浸泡在24井板的水井, 填充500µL 的无血清 DMEM 培养基。
2. 共培养设置
   1. 慢慢地把每个插入物的培养基吸走。
      注意: 去除介质时不要破坏膜。
   2. 种子的 B16F10 细胞 (0/10³/10⁵/10⁶) 在0.4 µm 孔插入从步骤3.2.1。
   3. 用步骤3.1.1 中的成熟骨髓脂肪细胞取代脂肪的维持培养基。与600µL 完全 DMEM 培养基。
   4. 将填充有 B16F10 细胞的插入物 (从步骤 3.2.2) 转移到与成熟的骨髓脂肪脂 (从步骤 3.2.3) 的水井上共培养实验。
   5. 孵化的 cocultures 在37摄氏度和 5% CO₂ 2 天。
   6. 48小时的孵化后, 取出共培养的插入物, 然后用500µL 1x PBS 清洗脂肪细胞2x。
      注意: 如果需要, 可以选择在插入中收集 B16F10 单元格进行分析。
   7. 用油红 O 工作溶液染色脂肪细胞, 或收集脂肪细胞进行 qPCR 分析。
      注: 请参阅步骤2.3 中的染色过程。
   8. 在光显微镜下拍摄染色脂肪细胞。

4. 脂肪细胞特异基因特征的 qPCR 分析

1. 在成熟脂肪细胞准备检测的24井板中, 每井添加0.5 毫升的可随时使用的 RNA 隔离试剂。
2. 遵循一个标准协议的 RNA 提取和 cDNA 合成³¹。
3. 使用18S 和 GAPDH 的底漆作为对照, CEBPα/β, PPARγ, FABP4, 瘦素, Pref-1, 或脂联素为脂肪细胞特异基因签名 (表 1)。
4. 在热循环仪中运行以下反应:95 °c 二十年代, 其次40周期95°c 为 1 s 和60°c 为二十年代。
5. 使用 2^-ΔΔCt方法计算褶皱变化³²。

结果

在骨髓, 脂肪细胞可以出现在肿瘤微环境^{1,13,33,34,35}在早期阶段支持肿瘤进展通过可溶性因素或激活 osteoclastogenesis^6,12,36, 特别是在肥胖^6,12

讨论

Cocultures 与插入物已被广泛用于研究细胞间的相互作用。2D 共培养系统是观察两个部位在体外进行串扰的有效方法, 我们在这里显示了两种不同的癌细胞驱动对骨髓脂肪细胞的影响。许多实验室利用这种方法来研究脂肪细胞与癌细胞^{6、12、27、39}之间的串扰。

因此, 一般而言,...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen Inc.	11965092
Fetal Bovine Serum	Invitrogen Inc.	16000–044
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Oil Red o	Sigma-Aldrich	O0625
24-well plate	Corning	CLS3527
Transwell insert	Millipore	MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516
0.25% trypsin	Thermo Scientific	25200056
hemocytometer	Bio-Rad	1450016
Culture incubator	Thermo Scientific
50 mL falcon	Corning	CLS430828
Clean Bench	Thermo Scientific	-
Microscopy	Olympus	-
200 μL pipet tips	BeyoGold	FTIP620
1,000 mL pipet tips	BeyoGold	FTIP628