JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем систему надежной и простой двухмерный (2D) coculture для изучения взаимодействия между опухолевых клеток и адипоциты костного мозга, который показывает двойной эффект факторов клеток меланомы на адипоциты костного мозга дифференциация и также представляет классический метод механистический исследования костных метастазов.

Аннотация

Перекрестных помех между адипоциты костного мозга и клетки опухоли могут сыграть важную роль в процессе костных метастазов. Разнообразные методы доступны для изучения существенных помех; Однако двумерных transwell системы для coculture остается классический, надежный и простой способ для этого исследования помех. Здесь мы представляем подробный протокол, который показывает coculture адипоциты костного мозга и клетки меланомы. Тем не менее такая система coculture может не только способствовать изучение клеток сигнал transductions раковых клеток, вызванные адипоциты костного мозга, но также в будущее механистический исследования костных метастазов, которая может выявить новых терапевтических целей для костей метастазирование.

Введение

Метастазы в кости широко распространены среди больных раком, но курс лечения по-прежнему недоступна. Помимо специализируется на хранение энергии в виде жира, адипоциты может поддерживать рост опухоли и метастазов в костный мозг и другие органы1,2,3,4,5,6. Кроме того адипоциты играют важную роль в регулировании раковых клеток биологии7,8,9,10 и метаболизм4,11,12 ,13,14,,1516, а также в костных метастазов1,4,12. В нише костного мозга адипоциты также может повлиять на биологическое поведение раковых клеток4,6,17. Взаимодействие между адипоциты костного мозга и раковые клетки с osteotropism имеет важное значение для понимания костных метастазов. Однако мало что известно.

Основываясь на текущих исследований, различные методы применяются к адипоциты, включая двух - и трехмерных (2/3D) и ex vivo культур17,18,19,,2021. Herroon et al. , недавно, разработал новый 3D-культура подход к изучению взаимодействия адипоциты костного мозга с раком клетки22. Хотя 3D coculture оптимальное подражая физиологических взаимодействий между адипоциты и рак клеток в естественных условиях, она страдает от бедных воспроизводимость22,23. По сравнению с 2D coculture системы 3D coculture система может обеспечить различных клеточных фенотипы, например клетки морфология21,22,24,25,26. Кроме того ex vivo культуры изолированных губчатой костной ткани фрагментов может привести к надежной нарост адипоцитов искусственный костный мозг клеток17.

В отличие от этих предыдущих моделей однако, 2D ячеечная модель культуры остается классический, надежной и простой метод для быстро сканирования кандидат молекул и фенотипы, изменилось в адипоцитов или рак клеток в пробирке1, 4,6,12,15,27. Чтобы лучше понять уровень помех между адипоциты костного мозга и клетки меланомы, мы предоставляем подробный протокол для 2D coculture системы адипоциты костного мозга с клетки меланомы.

протокол

Примечание: Все клетки, используемые в настоящем протоколе должна быть выращены для по крайней мере трех поколений после оттаивания из замороженных запасов клеток.

1. урожай факторы клеток меланомы

  1. Подготовка
    1. Получите B16F10 клеток и линии клетки меланомы мыши.
      Примечание: Для этого протокола, линия клетки меланомы мышь была получена из стволовых клеток, банк Китайской академии наук.
    2. Сделайте полный средой для B16F10 культуры клеток (100 мл). Используйте Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
    3. Сделайте бесплатно сыворотки средой для голода B16F10 клеток (50 мл). Использование среды без FBS DMEM, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
  2. Подготовить меланома кондиционером среднего (CM)
    1. Семя 2.0 x 105 B16F10 клетки в 100 мм блюдо с 10 мл 10% FBS DMEM. Затем инкубации клеток в инкубатор 37 ° C в атмосферу 5% CO2 на 24 часа.
    2. Когда клетки достигает около 80% слияния, удалите питательной среды, вымыть клетки дважды с 5 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS) (1 x, рН 7,4) и заменить носитель с 10 мл сыворотки бесплатно средних для голодания.
    3. Возвращение клетки в инкубатор для 18 – 24 часа.
    4. После голодания собирать кондиционером среднего (см) с пипетки и перенести его на свежий 50 мл пластиковых пробирок.
      Примечание: Кондиционером среда является супернатант B16F10 клеточных культур. Убедитесь, что B16F10 клетки находятся в хорошем состоянии перед сбором см.
    5. Центрифуга см 5 мин на 1000 x g при 4 ° C.
    6. Пипетка супернатант и перенести его на свежий стерильную пробирку или бутылку.
      Примечание: Избегайте дозирование выкл Пелле в нижней части трубки.
    7. Чтобы удалить ячейки мусора, фильтр см, проходя через шприц подключен 0,45 мкм фильтром поверх стерильные бутылки или трубки.
      Примечание: 0.22 мкм фильтры являются оптимальными для фильтрации см.
    8. Сохранять отфильтрованные супернатант при-20 ° C до использования.
      Примечание: Лучше не хранить супернатант при-20 ° C для более чем одного месяца. Альтернативно хранятся см-80 ° c для более длительных периодов времени для дифференциации Адипоцит.

2. индукция адипоциты костного факторы клеток меланомы

  1. Подготовка
    1. Сделайте 100 мл адипогенном индукции средних28. Используйте полный DMEM дополнена 5 мкг/мл инсулин, 0.5 мм 3-изобутил-1-метилксантина и дексаметазона 1 мкм. Хранить его до двух недель при 4 ° C.
    2. Подготовка 100 мл адипогенном обслуживания среды. Использовать полный DMEM или смешивают с 50% меланомы см с 5 мкг/мл инсулина.
    3. Сделайте Стоковый раствор нефти красный O. Растворяют 30 мг порошка красного масла O в 10 мл изопропиловый спирт (≥ 99,5%) и смешивать их хорошо, вихрь.
      Примечание: Храните его до 1 год на 4 ° C.
    4. Сделайте рабочий раствор нефти красный O. В Зонта разбавленных нефти красный O Стоковый раствор (из шага 2.1.3) с дейонизированной водой в соотношении 3:2. Инкубировать смесь для 15 мин при комнатной температуре и процеживают через 0,22 мкм фильтр перед использованием.
      Примечание: Используйте только свежие рабочего раствора в течение 2 ч.
  2. Адипоцит дифференциация
    1. Культура стромальных клеток линии 14F1.1 от мыши костного29 в 60 мм блюдо с полным DMEM на 80% confluency в инкубаторе 37 ° С в атмосфере 5% CO2.
      Примечание: в качестве альтернативы, замените основной Мезенхимальные клетки костного мозга, полученных3014F1.1.
    2. Trypsinize клетки с 1,5 мл 0,25% раствора трипсина в инкубаторе для 1 – 2 мин.
    3. Добавьте 5 мл 10% FBS среды к клеткам и подсчета числа клеток с Горяева стекла; Затем отрегулируйте плотность ячеек примерно 1 – 2 x 105/мл.
    4. Семена 5 x 104 14F1.1 клеток на хорошо в пластине 24-хорошо с 0,5 мл адипогенном индукции среды. После двух дней инкубации клетки достигает около 90% слияния.
      Примечание: Этот шаг очень важно. Стромальные клетки костного не может быть привлечен к адипоцитов без среднего адипогенном индукции.
    5. Удалите средство индукции и вымыть клетки дважды с 1 мл раствора PBS каждый раз.
    6. Изменения в 1 мл адипогенном обслуживания среды и продолжают культуры клетки до Адипоцит созревания.
      Примечание: Под микроскопом, адипоциты выглядят как маленькие или большие мыльные пузыри и очень легко распознать. Как правило пожилые адипоцитов присутствуют на 6-й или 8-й день.
    7. Пятно Зрелые адипоцитов с O Красного масла или собирать адипоциты для анализа количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР).
  3. Адипоцит пятнать
    1. Мыть дифференцированных 14F1.1 клетки 2 x с PBS и исправить их в 3,7% формальдегида за 1 ч.
    2. Промойте клетки в 60% изопропиловый спирт и дайте им высохнуть полностью.
    3. Добавить 0,2 мл масла Red O рабочего раствора в колодцы и проинкубируйте его при комнатной температуре на 0,5-2 ч.
    4. Вымойте клетки с водой, чтобы удалить несвязанные красители.
    5. Фото-окрашенная адипоцитов под микроскопом света.

3. coculture адипоциты костного мозга с клетки меланомы

  1. Подготовка
    1. Подготовка зрелых кости адипоциты костного мозга: заставить клетки 14F1.1 в зрелых адипоцитов BM в 24-ну пластины с адипогенном индукции среднего за 2 дня и затем сохранять их в средстве обслуживания адипогенном еще 6-8 дней.
    2. Подготовка клетки B16F10: Культура клетки B16F10 блюдах 60 мм с 5 мл DMEM среды.
    3. Смочите вставки мембраны (например , transwell): 150 мкл FBS бесплатно DMEM среднего до 0,4 мкм-поры мембраны вставок и погрузить их на колодцы пластин 24-ну заполнены с 500 мкл FBS бесплатно DMEM среднего.
  2. Coculture Настройка
    1. Медленно пипетку вне среды каждой вставки.
      Примечание: Не уничтожить мембраны при удалении среды.
    2. Семя B16F10 клетки (0/103/105/106) в поры 0,4 мкм вставляет шаг 3.2.1.
    3. Замените адипоцитов Зрелые костного мозга от шага 3.1.1 среднего обслуживания адипогенном в скважинах. с 600 мкл полного DMEM среды.
    4. Передача вставок, заполнены с B16F10 клетками (от шага 3.2.2) по скважинам с зрелой костного адипоцитов (от шага 3.2.3) для coculture экспериментов.
    5. Инкубируйте cocultures при 37 ° C и 5% CO2 на 2 дня.
    6. После 48 ч инкубации, снимите вставки coculture, а затем вымыть адипоцитов 2 x с 500 мкл ПБС.
      Примечание: При необходимости соберите B16F10 клетки в вставки для анализа при необходимости.
    7. Пятно адипоцитов с нефти красный O рабочий раствор или собирать адипоциты для ПЦР анализа.
      Примечание: Смотрите пятная процедуру на шаге 2.3.
    8. Фото-окрашенная адипоцитов под микроскопом света.

4. ПЦР анализ Адипоцит специфических генов подписи

  1. Добавить 0,5 мл реагента изоляции RNA готовых к использованию на хорошо в пластине 24-Ну в которых пожилые Адипоцит готова обнаружить.
  2. Следуйте стандартным протоколом для извлечения РНК и синтез cDNA31.
  3. Используйте грунт для 18S и GAPDH как элемент управления и CEBPα/β, PPARγ, FABP4, лептин, Pref-1 или адипонектина для подписания Адипоцит специфических генов (Таблица 1).
  4. Запуск следующей реакции в тепловой циклователь: 95 ° C 20 s, следуют 40 циклов 95 ° c 1 s и 60 ° C для 20 s.
  5. Используйте методΔΔCt 2–для расчета раз меняет32.

Результаты

В костном мозге, адипоциты может появиться в опухоли микроокружения1,13,33,,3435 на ранней стадии для поддержки опухолевой прогрессии через растворимых факторов или Активация osteoclastogen...

Обсуждение

Cocultures с вставками широко использовался для изучения взаимодействия к ячейке. 2D coculture система является эффективным способом наблюдать, как две части перекрестных помех в пробирке, в которой мы здесь показали два различных раковых клеток driven воздействия на адипоциты костного мозга....

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего объявить.

Благодарности

Мы благодарим дов Zipori (Институт Вейцмана, Реховот, Израиль) любезно за предоставление нам стромальных клеток костного мозга мышиных линия 14F1.1. Это исследование было поддержано грантов от китайского национального фонда естественных наук (№ 81771729) и Yongchuan больница Чунцин медицинского университета (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMInvitrogen Inc.11965092
Fetal Bovine SerumInvitrogen Inc.16000–044
Phosphate Buffered SalineInvitrogen Inc.14190-144
InsulinSigma-Aldrich91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthineSigma-AldrichI5879
DexamethasoneSigma-AldrichD4902
Oil Red oSigma-AldrichO0625
24-well plateCorningCLS3527
Transwell insertMilliporeMCHT24H48
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-122
isopropanolSigma-AldrichI9516
0.25% trypsinThermo Scientific25200056
hemocytometerBio-Rad1450016
Culture incubatorThermo Scientific
50 mL falconCorningCLS430828
Clean BenchThermo Scientific-
MicroscopyOlympus-
200 μL pipet tipsBeyoGoldFTIP620
1,000 mL pipet tipsBeyoGoldFTIP628

Ссылки

  1. Wang, J., et al. Adipogenic niches for melanoma cell colonization and growth in bone marrow. Laboratory Investigation. 97 (6), 737-745 (2017).
  2. Trotter, T. N., et al. Adipocyte-Lineage Cells Support Growth and Dissemination of Multiple Myeloma in Bone. The American Journal of Pathology. 186 (11), 3054-3063 (2016).
  3. Morris, E. V., Edwards, C. M. The role of bone marrow adipocytes in bone metastasis. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 121-123 (2016).
  4. Diedrich, J. D., et al. Bone marrow adipocytes promote the Warburg phenotype in metastatic prostate tumors via HIF-1alpha activation. Oncotarget. 7 (40), 64854-64877 (2016).
  5. Chkourko Gusky, H., Diedrich, J., MacDougald, O. A., Podgorski, I. Omentum and bone marrow: how adipocyte-rich organs create tumour microenvironments conducive for metastatic progression. Obesity Reviews. 17 (11), 1015-1029 (2016).
  6. Chen, G. L., et al. High fat diet increases melanoma cell growth in the bone marrow by inducing osteopontin and interleukin 6. Oncotarget. 7 (18), 26653-26669 (2016).
  7. Balaban, S., et al. Adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration. Cancer & Metabolism. 5, 1 (2017).
  8. Huang, C. K., et al. Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate. Nature Communications. 8, 14706 (2017).
  9. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI Insight. 2 (4), 87489 (2017).
  10. Wang, C., Gao, C., Meng, K., Qiao, H., Wang, Y. Human adipocytes stimulate invasion of breast cancer MCF-7 cells by secreting IGFBP-2. PLoS One. 10 (3), 0119348 (2015).
  11. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
  12. Herroon, M. K., et al. Bone marrow adipocytes promote tumor growth in bone via FABP4-dependent mechanisms. Oncotarget. 4 (11), 2108-2123 (2013).
  13. Tabe, Y., et al. Bone Marrow Adipocytes Facilitate Fatty Acid Oxidation Activating AMPK and a Transcriptional Network Supporting Survival of Acute Monocytic Leukemia Cells. Cancer Research. 77 (6), 1453-1464 (2017).
  14. Wen, Y. A., et al. Adipocytes activate mitochondrial fatty acid oxidation and autophagy to promote tumor growth in colon cancer. Cell Death & Differentiation. 8 (2), 2593 (2017).
  15. Liu, Z., et al. Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation. Oncotarget. 6 (33), 34329-34341 (2015).
  16. Ye, H., et al. Leukemic Stem Cells Evade Chemotherapy by Metabolic Adaptation to an Adipose Tissue Niche. Cell Stem Cell. 19 (1), 23-37 (2016).
  17. Templeton, Z. S., et al. Breast Cancer Cell Colonization of the Human Bone Marrow Adipose Tissue Niche. Neoplasia. 17 (12), 849-861 (2015).
  18. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
  19. Emont, M. P., et al. Using a 3D Culture System to Differentiate Visceral Adipocytes In Vitro. Endocrinology. 156 (12), 4761-4768 (2015).
  20. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
  21. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  22. Herroon, M. K., Diedrich, J. D., Podgorski, I. New 3D-Culture Approaches to Study Interactions of Bone Marrow Adipocytes with Metastatic Prostate Cancer Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 84 (2016).
  23. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Laboratory Investigation. 93 (5), 528-542 (2013).
  24. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  25. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  26. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  27. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  28. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  29. Zipori, D., Toledo, J., von der Mark, K. Phenotypic heterogeneity among stromal cell lines from mouse bone marrow disclosed in their extracellular matrix composition and interactions with normal and leukemic cells. Blood. 66 (2), 447-455 (1985).
  30. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
  31. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. Journal of Visualized Experiments. (132), e56850 (2018).
  32. Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis. Journal of Visualized Experiments. (112), e53822 (2016).
  33. Shafat, M. S., et al. Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment. Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).
  34. Gazi, E., et al. Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy. The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).
  35. Brown, M. D., et al. Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer. British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).
  36. Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer. Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).
  37. Aebi, M. Spinal metastasis in the elderly. European Spine Journal. 12, 202-213 (2003).
  38. Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation. Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).
  39. Bochet, L., et al. Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance. Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).
  40. Hirano, T., et al. Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells. Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).
  41. Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures. Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138coculture

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены