Double effet de facteurs dérivés de cellules de mélanome sur la différenciation des Adipocytes médullaires

Résumé

Nous présentons ici un système fiable et simple à deux dimensions co-culture (2D) pour étudier l’interaction entre les cellules tumorales et les adipocytes de la moelle osseuse, qui révèle un double effet de facteurs dérivés des cellules de mélanome sur les adipocytes de la moelle osseuse différenciation et constitue également une méthode classique pour l’étude mécanistique de métastase osseuse.

Résumé

La diaphonie entre les adipocytes de la moelle osseuse et les cellules tumorales peut-être jouer un rôle crucial dans le processus de métastase osseuse. Diverses méthodes sont disponibles pour l’étude de la diaphonie significative ; Toutefois, un système bidimensionnel transwell coculture reste un classique, fiable et un moyen facile pour cette étude de diaphonie. Nous présentons ici un protocole détaillé qui montre la coculture des adipocytes de la moelle osseuse et de cellules de mélanome. Néanmoins, un tel système de co-culture pourrait non seulement contribuer à l’étude de transductions signal cellulaire des cellules cancéreuses induites par les adipocytes de la moelle osseuse, mais aussi à l’avenir mécaniste étude de métastase osseuse qui peut révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour OS métastase.

Introduction

Les métastases osseuses sont très répandus chez les patients atteints de cancer avancé, mais un traitement curatif n’est pas encore disponible. Au-delà se spécialisant dans le stockage de l’énergie sous forme de graisse, les adipocytes peuvent prendre en charge la croissance tumorale et les métastases dans la moelle osseuse et les autres organes^1,2,3,4,5,6. En outre, les adipocytes jouent un rôle essentiel dans la régulation du cancer cell biology^7,8,9,10 et métabolisme^{4,11,12 ,13,14,15,16}, tel qu’il est bien comme dans OS métastase^1,4,12. Dans le créneau de la moelle osseuse, les adipocytes peuvent aussi affecter le comportement biologique du cancer cellules^4,6,17. L’interaction entre les adipocytes de la moelle osseuse et les cellules cancéreuses avec osteotropism est importante pour la compréhension des métastases osseuses. Cependant, on connaît peu.

Se fondant sur les études actuelles, différentes méthodes sont appliquées aux adipocytes, y compris deux ou trois dimensions (2/3D) et ex vivo cultures^{17,18,19,20,21}. Récemment, Herroon et coll. conçu une nouvelle approche de la 3D-culture pour étudier les interactions entre les adipocytes de la moelle osseuse et de cellules de cancer²². Bien que la co-culture 3D est optimale pour imiter physiologique des interactions entre les adipocytes et le cancer cells in vivo, il souffre d’une mauvaise reproductibilité^22,23. Par rapport à un système de co-culture 2D, un système de co-culture 3D peut fournir différents phénotypes cellulaires, comme la cellule morphologie^{21,22,24,25,26}. Par ailleurs, la culture ex vivo des fragments de tissus isolés d’os spongieux peut entraîner une excroissance robuste des adipocytes cultivées la moelle osseuse des cellules¹⁷.

Contrairement à ces prédécesseurs, cependant, le modèle de culture cellulaire 2D reste une technique classique, fiable et facile pour numérisation rapidement des molécules de candidat et les phénotypes changés en adipocytes ou cancer des cellules in vitro^{1, 4,6,12,15,27}. Pour mieux comprendre la diaphonie entre les adipocytes de la moelle osseuse et des cellules du mélanome, nous fournissons un protocole détaillé pour un système de co-culture 2D des adipocytes de la moelle osseuse avec des cellules de mélanome.

Protocole

Remarque : Toutes les cellules utilisées dans le présent protocole devraient être cultivés depuis au moins trois générations après décongélation de cellules congelées de stock.

1. récolter les facteurs dérivés de cellules de mélanome

1. Préparations
   1. Obtenir les cellules B16F10 et une lignée de cellules de mélanome de souris.
      Remarque : Pour ce protocole, une lignée de cellules de mélanome de souris a été obtenue auprès de la Banque de cellules souches de l’Académie chinoise des Sciences.
   2. Faire un support complet pour la culture de cellules de B16F10 (100 mL). Utilisez le support de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % bovine sérum fœtal (SVF), 50 U/mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine.
   3. Faire un milieu sans sérum pour la famine des cellules B16F10 (50 mL). Utilisez DMEM moyen sans FBS, 50 U/mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine.
2. Préparer le milieu conditionné par mélanome (CM)
   1. Cellules de⁵ B16F10 de semences 2,0 x 10 dans un 100 mm plat avec 10 mL de 10 % DMEM FBS. Puis incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   2. Lorsque les cellules atteignent environ 80 % de confluence, enlevez le milieu de culture, laver les cellules deux fois avec 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (1 x, pH 7,4) et remplacer le support avec un 10 mL sans sérum moyen pour la famine.
   3. Remettez les cellules dans l’incubateur pendant 18 à 24 h.
   4. Après la famine, recueillir le milieu conditionné (CM) avec une pipette et transférez-le dans un tube à centrifuger frais 50 mL.
      Remarque : Le milieu conditionné est le surnageant de cultures de cellules de la B16F10. Assurez-vous que les cellules B16F10 sont en bon état avant de prélever la CM.
   5. Centrifuger le CM pendant 5 min à 1 000 x g à 4 ° C.
   6. Pipeter le surnageant et transférer dans un nouveau tube stérile ou une bouteille.
      NOTE : Évitez de pipetage au large de la pastille au fond du tube.
   7. Pour supprimer les débris cellulaires, filtrer la CM en le faisant passer à travers un filtre de 0,45 µm relié à la seringue sur le dessus une bouteille stérile ou un tube.
      NOTE : 0,22 µm filtres sont optimales pour le filtrage de la CM.
   8. Conserver le surnageant filtré à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
      Remarque : Il est préférable de ne pas conserver le surnageant à-20 ° C pendant plus d’un mois. Vous pouvez également stocker les CM à-80 ° C pour plus longues périodes de temps pour la différenciation des adipocytes.

2. induction des Adipocytes de la moelle osseuse par facteurs dérivés de cellules de mélanome

1. Préparations
   1. Faire 100 mL d’adipocytaire induction moyenne²⁸. Utilisez un DMEM complet additionné de 5 µg/mL d’insuline, 0,5 mM 3-isobutyl-1-méthylxanthine et 1 µM de dexaméthasone. Il stocker jusqu'à deux semaines à 4 ° C.
   2. Préparation de 100 mL de milieu d’entretien adipocytaire. Utiliser un DMEM complet ou en mélange avec 50 % de mélanome CM additionné de 5 µg/mL d’insuline.
   3. Faire une solution d’huile rouge O. Dissoudre 30 mg de poudre de Oil Red O dans 10 mL d’isopropanol (≥ 99,5 %) et mélangez-les bien par vortex.
      Remarque : Il stocker jusqu'à 1 an à 4 ° C.
   4. Faire une solution de travail Oil Red O. Sous la hotte, diluer la solution mère d’huile rouge O (de l’étape 2.1.3) avec de l’eau déionisée dans un ratio de 3:2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 15 minutes et filtrer à travers un filtre de 0,22 µm avant utilisation.
      Remarque : Utilisez uniquement la solution de travail frais moins de 2 h.
2. Différenciation adipocytaire
   1. Culture un stromal cell line 14F1.1 de la moelle osseuse de souris²⁹ dans un plat de 60 mm avec un DMEM complet à la confluence de 80 % dans un incubateur à 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO₂.
      NOTE : Sinon, remplacez 14F1.1 primaires dérivés de la moelle osseuse des cellules mésenchymateuses³⁰.
   2. Trypsinize les cellules avec 1,5 mL d’une solution de trypsine de 0,25 % dans un incubateur pendant 1 à 2 min.
   3. Ajouter 5 mL de milieu FBS de 10 % pour les cellules et compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre verre ; puis régler la densité de cellules à environ 1 à 2 x 105/ml.
   4. Graines de 5 x 10⁴ de 14F1.1 cellules / puits dans une plaque 24 puits avec 0,5 mL de milieu d’induction adipocytaire. Après deux jours d’incubation, les cellules atteignent environ 90 % de confluence.
      Remarque : Cette étape est très critique. Cellules stromales de la moelle osseuse ne peuvent être induites aux adipocytes sans un milieu d’induction adipocytaire.
   5. Enlever le milieu inducteur et laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS chaque fois.
   6. 1 mL de milieu d’entretien adipocytaire, continuer à la culture des cellules jusqu'à la maturation de l’adipocyte.
      Remarque : Sous un microscope, ressemblent à petites ou grandes bulles de savon et les adipocytes sont très faciles à reconnaître. Habituellement, les adipocytes matures sont présents sur la 6^ème ou 8^ème jour.
   7. Teindre les adipocytes matures avec de l’huile rouge O ou recueillir les adipocytes pour une analyse (qPCR) réaction en chaîne de polymérase quantitative.
3. Coloration des adipocytes
   1. Laver la 14F1.1 différencié cellules 2 x avec PBS et fixez-les à 3,7 % de formaldéhyde pendant 1 h.
   2. Rincer les cellules en 60 % isopropanol et laissez-les sécher complètement.
   3. Ajouter 0,2 mL de la solution de travail Oil Red O dans les puits et il incuber à température ambiante pendant 0,5 à 2 h.
   4. Laver les cellules avec l’eau pour enlever les colorants non liés.
   5. Photo les teints adipocytes sous un microscope optique.

3. coculture des Adipocytes de la moelle osseuse avec des cellules de mélanome

1. Préparations
   1. Préparer les os mature adipocytes de moelle osseuse : induire les cellules 14F1.1 en adipocytes matures de BM en plaques 24 puits avec le milieu d’induction adipocytaire pendant 2 jours et puis leur maintien dans le milieu de maintenance adipocytaire pour une période supplémentaire de 6 à 8 jours.
   2. Préparer les B16F10 des cellules : les cellules de B16F10 dans des boîtes de 60 mm avec 5 mL de milieu DMEM la culture.
   3. Humidifier l’insert membrane (p. ex. transwell) : Ajouter 150 µL de milieu DMEM FBS-gratuit pour les inserts de pores membranaires 0,4 µm et immerge-les sur les puits de plaques 24 puits remplis de 500 µL de milieu DMEM FBS-libre.
2. Réglage de la co-culture
   1. Pipetter lentement hors du milieu de chaque insertion.
      Remarque : Ne pas détruire la membrane lorsque vous retirez le support.
   2. Graine de cellules B16F10 (0/10³10⁵10⁶) dans le pore de 0,4 µm insère de l’étape 3.2.1.
   3. Remplacer le support de maintenance adipocytaire dans les puits avec les adipocytes matures la moelle osseuse de l’étape 3.1.1. avec 600 µL de milieu DMEM complet.
   4. Transférer les inserts remplis avec les cellules de B16F10 (de l’étape 3.2.2) sur les puits avec les adipocytes matures la moelle osseuse (de l’étape 3.2.3) pour les expériences de coculture.
   5. Incuber les cocultures à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 2 jours.
   6. Après 48 h d’incubation, enlever les inserts de la co-culture et puis laver les adipocytes 2 x avec 500 µL de PBS 1 x.
      Remarque : Recueillir éventuellement, les cellules de B16F10 dans les encarts pour analyse si nécessaire.
   7. Teindre les adipocytes avec la solution de travail Oil Red O ou recueillir les adipocytes pour analyse qPCR.
      Remarque : Voir la procédure de marquage à l’étape 2.3.
   8. Photo les teints adipocytes sous un microscope optique.

4. qPCR analyse de la Signature de gènes adipocytaires spécifiques

1. Ajouter 0,5 mL de réactif d’isolement d’ARN prêt à l’emploi / puits dans une plaque 24 puits dans lequel adipocyte mature est prêt à détecter.
2. Suivre un protocole standard pour l’extraction de l’ARN et la synthèse de cDNA³¹.
3. Utiliser l’apprêt pour 18 et GAPDH comme le contrôle et CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptine, Pref-1 ou adiponectine pour la signature de gènes adipocytaires spécifiques (tableau 1).
4. Exécutez la réaction suivante dans un thermocycleur : 95 ° C pendant 20 s, suivi de 40 cycles de 95 ° C pendant 1 s et 60 ° C pendant 20 s.
5. La méthode de^{ΔΔCt –}2 permet de calculer que le giron change³².

Résultats

Dans la moelle osseuse, les adipocytes peuvent apparaître dans la tumeur microenvironnement^{1,13,33,34,35} à un stade précoce pour soutenir la progression de la tumeur par l’intermédiaire de facteurs solubles ou activation de^12,6,osteoclastogenesis

Discussion

Cocultures avec inserts ont été largement utilisés pour étudier les interactions cellule-cellule. Le système de co-culture 2D est un moyen efficace d’observer comment les deux pièces de diaphonie in vitro, par lequel nous avons montré ici deux différente axée sur la cellule les effets cancérogènes sur les adipocytes de la moelle osseuse. Plusieurs laboratoires ont utilisé cette méthode pour étudier la diaphonie entre les adipocytes et les cellules de cancer^6,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen Inc.	11965092
Fetal Bovine Serum	Invitrogen Inc.	16000–044
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Oil Red o	Sigma-Aldrich	O0625
24-well plate	Corning	CLS3527
Transwell insert	Millipore	MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516
0.25% trypsin	Thermo Scientific	25200056
hemocytometer	Bio-Rad	1450016
Culture incubator	Thermo Scientific
50 mL falcon	Corning	CLS430828
Clean Bench	Thermo Scientific	-
Microscopy	Olympus	-
200 μL pipet tips	BeyoGold	FTIP620
1,000 mL pipet tips	BeyoGold	FTIP628