Effetti doppi di fattori derivati da cellule di Melanoma su differenziazione adipociti del midollo osseo

Riepilogo

Qui, presentiamo un sistema affidabile e semplice coculture bidimensionale (2D) per studiare l'interazione tra le cellule del tumore e adipociti del midollo osseo, che rivela un duplice effetto di fattori derivati da cellule di melanoma su adipociti del midollo osseo differenziazione e pone anche un metodo classico per lo studio meccanicistico della metastasi dell'osso.

Abstract

Il crosstalk tra adipociti del midollo osseo e le cellule del tumore può giocare un ruolo critico nel processo di metastasi ossee. Una varietà di metodi sono disponibili per studiare il crosstalk significativo; Tuttavia, un sistema di transwell bidimensionale per coculture rimane un classico, affidabile e facile modo per questo studio di diafonia. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che mostra il coculture delle adipociti del midollo osseo e le cellule del melanoma. Tuttavia, un tale sistema di coculture potrebbe non solo contribuire allo studio di trasduzioni segnale cellulare delle cellule di cancro indotte dagli adipociti del midollo osseo, ma anche per il futuro meccanicistico studio della metastasi dell'osso che può rivelare nuovi bersagli terapeutici per osso metastasi.

Introduzione

Le metastasi dell'osso sono diffuse fra i pazienti di cancro avanzato, ma un trattamento curativo non è ancora disponibile. Di là di specializzata nella conservazione di energia come grasso, adipociti è in grado di supportare la crescita del tumore e metastasi nel midollo osseo e altri organi^1,2,3,4,5,6. Inoltre, adipociti svolgono un ruolo essenziale nella regolazione del cancro cellula biologia^7,8,9,10 e metabolismo^{4,11,12 ,13,14,15,16}, come bene come in osso metastasi^1,4,12. Nella nicchia del midollo osseo, adipociti possono anche influenzare il comportamento biologico del cancro cellule^4,6,17. L'interazione tra adipociti del midollo osseo e le cellule tumorali con osteotropism è significativo per la comprensione della metastasi dell'osso. Tuttavia, piccolo è conosciuto.

Basati sugli studi di correnti, vari metodi vengono applicati ai adipocytes, tra cui bi - o tri - dimensionale (2/3D) ed ex vivo culture^{17,18,19,20,21}. Recentemente, Herroon et al. progettato un nuovo approccio di 3D-cultura per studiare le interazioni degli adipociti del midollo osseo con cancro cellule²². Anche se il 3D coculture è ottimale per mimare fisiologiche interazioni tra adipociti e cancro cellule in vivo, soffre di scarsa riproducibilità^22,23. Rispetto ad un sistema di coculture 2D, un sistema di coculture 3D può fornire diversi fenotipi cellulari, come ad esempio cellule morfologia^{21,22,24,25,26}. Inoltre, la cultura ex vivo di frammenti di tessuto isolato cancellous dell'osso può portare a un'escrescenza robusta degli adipociti dal midollo osseo coltivate cellule¹⁷.

In contrasto con questi modelli precedenti, tuttavia, il modello della coltura cellulare 2D rimane una tecnica classica, affidabile e facile scansione rapidamente molecole candidate e i fenotipi cambiati in adipociti o cancro cellule in vitro^{1, 4,6,12,15,27}. Per comprendere meglio il crosstalk tra adipociti del midollo osseo e le cellule del melanoma, forniamo un protocollo dettagliato per un sistema di coculture 2D degli adipociti del midollo osseo con cellule di melanoma.

Protocollo

Nota: Tutte le celle utilizzate nel presente protocollo dovrebbero essere cresciute da almeno tre generazioni dopo lo scongelamento da cellule stock congelate.

1. raccogliere i fattori derivati da cellule di Melanoma

1. Preparazioni
   1. Ottenere le cellule B16F10 e una linea cellulare di melanoma del topo.
      Nota: Per questo protocollo, una linea cellulare di melanoma del topo è stata ottenuta dalla banca della cellula formativa dell'Accademia cinese delle scienze.
   2. Rendere un supporto completo per la coltura delle cellule B16F10 (100 mL). Utilizzare medium dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina.
   3. Rendere un medium senza siero per l'inedia delle cellule B16F10 (50 mL). Utilizzare Media senza FBS DMEM, 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina.
2. Preparare il melanoma-condizionato medio (CM)
   1. Seme 2.0 x 10⁵ B16F10 cellule in un 100mm piatto con 10 mL di 10% FBS DMEM. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO₂ per 24 h.
   2. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule due volte con 5 mL di tampone fosfato salino (PBS) (x 1, pH 7.4) e sostituire il mezzo con un 10 mL privo di siero medio per la fame.
   3. Riporre le cellule nell'incubatore per 18 – 24 h.
   4. Dopo l'inedia, raccogliere il medium condizionato (CM) con una pipetta e trasferirlo in una provetta da centrifuga fresca 50 mL.
      Nota: Il medium condizionato è il sovranatante delle colture cellulari B16F10. Assicurarsi che le cellule B16F10 sono in buone condizioni prima di raccogliere i CM.
   5. Centrifugare il CM per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.
   6. Pipettare il supernatante e trasferirlo in una provetta sterile fresco o bottiglia.
      Nota: Evitare di pipettaggio fuori la pallina nella parte inferiore del tubo.
   7. Per rimuovere i detriti cellulari, è possibile filtrare i CM facendolo passare attraverso un filtro da 0,45 µm siringa-collegato sulla cima di un tubo o bottiglia sterile.
      Nota: 0,22 µm filtri sono ottimali per il filtraggio del CM.
   8. Conservare il surnatante filtrato a-20 ° C fino all'utilizzo.
      Nota: Si consiglia di non conservare il supernatante a-20 ° C per più di un mese. In alternativa, è possibile memorizzare i CM a-80 ° C per più lunghi periodi di tempo per la differenziazione degli adipociti.

2. induzione degli adipociti del midollo osseo da fattori derivati da cellule di Melanoma

1. Preparazioni
   1. Portare a 100 mL di adipogenico induzione media²⁸. Utilizzare un completo DMEM completate con 5 µ g/mL di insulina, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine e 1 µM desametasone. Memorizzare a due settimane a 4 ° C.
   2. Preparare 100 mL di mezzo di manutenzione adipogenico. Utilizzare un DMEM completo o miscelato con il 50% del melanoma CM completati con 5 µ g/mL di insulina.
   3. Fare una soluzione di riserva di Oil Red O. Sciogliere 30 mg di polvere di Oil Red O in 10 mL di isopropanolo (≥ 99.5%) e mescolarli bene dal vortice.
      Nota: E ' memorizzare fino a 1 anno a 4 ° C.
   4. Fare una soluzione di lavoro Oil Red O. In cappa, diluire la soluzione di riserva di Oil Red O (dal punto 2.1.3) con acqua deionizzata in un rapporto di 3:2. Incubare la miscela per 15 min a temperatura ambiente e filtrare attraverso un filtro da 0,22 µm prima dell'uso.
      Nota: Utilizzare solo la soluzione fresca di lavoro all'interno di 2 h.
2. Differenziazione degli adipociti
   1. Cultura una cella stromal linea 14F1.1 dal mouse del midollo osseo²⁹ in un piatto di 60 mm con un completo DMEM al confluency di 80% in un incubatore a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO₂.
      Nota: In alternativa, sostituire 14F1.1 con cellule mesenchimali derivate da midollo osseo primario³⁰.
   2. Tripsinizzano le cellule con 1,5 mL di una soluzione di tripsina 0.25% in un'incubatrice per 1 – 2 min.
   3. Aggiungere 5 mL di terreno di 10% FBS alle celle e contare i numeri di cellulare con un emocitometro di vetro; quindi regolare la densità delle cellule a circa 1 – 2 x 105/ml.
   4. 5 x 10⁴ di 14F1.1 cellule per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 0,5 mL di mezzo di induzione adipogenico del seme. Dopo due giorni di incubazione, le cellule raggiungono circa il 90% di confluenza.
      Nota: Questo passaggio è molto critico. Cellule stromali del midollo osseo non possono essere indotto a adipociti senza un mezzo di induzione adipogenic.
   5. Rimuovere il mezzo di induzione e lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS ogni volta.
   6. Cambiare a 1 mL di mezzo di manutenzione adipogenico e continuare a coltivare le cellule fino alla maturazione degli adipociti.
      Nota: Sotto un microscopio, adipociti apparire come piccole o grandi bolle di sapone e sono molto facili da riconoscere. Di solito, adipocytes maturi sono presenti 6^th o 8^° giorno.
   7. Macchiare i adipocytes maturi con Oil Red O o raccogliere gli adipociti per un'analisi di reazione a catena (qPCR) della polimerasi quantitativa.
3. Macchiatura del adipocyte
   1. Lavare il 14F1.1 differenziato cellule 2 volte con PBS e correggerli in formaldeide del 3,7% per 1 h.
   2. Sciacquare le cellule in 60% isopropanolo e lasciarli asciugare completamente.
   3. Aggiungere 0,2 mL di soluzione di lavoro di Oil Red O pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 0,5-2 h.
   4. Lavare le cellule con acqua per rimuovere i coloranti non associati.
   5. Foto gli adipociti tinti sotto un microscopio chiaro.

3. coculture degli adipociti del midollo osseo con cellule di Melanoma

1. Preparazioni
   1. Preparare l'osso maturo adipociti del midollo: indurre le cellule 14F1.1 in adipociti maturi BM in piastre da 24 pozzetti con il mezzo di induzione adipogenico per 2 giorni e poi mantenerli nel medium adipogenico manutenzione per ulteriori 6-8 giorni.
   2. Preparare le cellule B16F10: coltura le cellule B16F10 in piastre da 60 mm con 5 mL di terreno DMEM.
   3. Inumidire l'inserto di membrana (ad es. transwell): aggiungere 150 µ l di terreno DMEM privo di FBS per gli inserti di formato del poro della membrana 0,4 µm e immergerli su pozzetti di piastre da 24 pozzetti riempite con 500 µ l di terreno DMEM privo di FBS.
2. Impostazione di coculture
   1. Pipettare lentamente fuori il mezzo di ciascun frutto.
      Nota: Non distruggono la membrana quando si rimuove il mezzo.
   2. Seme le cellule B16F10 (0/10³10⁵10⁶) nel poro 0,4 µm inserisce dal punto 3.2.1.
   3. Sostituire il mezzo di manutenzione adipogenico nei pozzetti con gli adipociti maturi del midollo osseo dal punto 3.1.1. con 600 µ l di terreno DMEM completo.
   4. Trasferire gli inserti riempiti con le cellule B16F10 (dal punto 3.2.2) sui pozzetti con gli adipociti maturi del midollo osseo (dal punto 3.2.3) per gli esperimenti di coculture.
   5. Incubare i cocultures a 37 ° C e 5% CO₂ per 2 giorni.
   6. Dopo 48 h di incubazione, rimuovere gli inserti del coculture e poi lavare gli adipociti 2 x con 500 µ l di PBS 1X.
      Nota: Facoltativamente, raccogliere le cellule B16F10 negli inserti per analisi se necessario.
   7. Gli adipociti con la soluzione di lavoro Oil Red O di macchia o raccogliere gli adipociti per analisi qPCR.
      Nota: Vedere la procedura di colorazione al punto 2.3.
   8. Foto gli adipociti tinti sotto un microscopio chiaro.

4. qPCR analisi del Adipocyte-specific Gene Signature

1. Aggiungere 0,5 mL di reagente di isolamento di RNA ready-to-use per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in cui adipocita maturo è pronto a rilevare.
2. Seguire un protocollo standard per l'estrazione di RNA e la sintesi di cDNA³¹.
3. Utilizzare il primer per 18S e GAPDH come controllo e CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptina, Pref-1 o adiponectin per la firma genica adipocyte-specifica (tabella 1).
4. Eseguire la seguente reazione in un termociclatore: 95 ° C per 20 s, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 1 s e 60 ° C per 20 s.
5. Utilizzare il metodo di^{ΔΔCt –}2 per calcolare che la piega cambia³².

Risultati

Nel midollo osseo, adipociti possono apparire nel tumore microambiente^{1,13,33,34,35} in una fase precoce per sostenere la progressione del tumore attraverso fattori solubili o attivazione^12,6,osteoclastogenesis³⁶, soprattutto nel contes...

Discussione

Cocultures con inserti sono stati ampiamente usati per studiare le interazioni cellula--cellula. Il sistema di coculture 2D è un modo efficace per osservare come le due parti diafonia in vitro, mediante il quale abbiamo mostrato qui due differenti del cancro delle cellule-guidati effetti sugli adipociti del midollo osseo. Molti laboratori hanno utilizzato questo metodo per indagare il crosstalk tra adipociti e cancro cellule^6,12,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen Inc.	11965092
Fetal Bovine Serum	Invitrogen Inc.	16000–044
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Oil Red o	Sigma-Aldrich	O0625
24-well plate	Corning	CLS3527
Transwell insert	Millipore	MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516
0.25% trypsin	Thermo Scientific	25200056
hemocytometer	Bio-Rad	1450016
Culture incubator	Thermo Scientific
50 mL falcon	Corning	CLS430828
Clean Bench	Thermo Scientific	-
Microscopy	Olympus	-
200 μL pipet tips	BeyoGold	FTIP620
1,000 mL pipet tips	BeyoGold	FTIP628