השפעות כפול של מלנומה נגזר תא גורמים על בידול Adipocytes מח עצם

Summary

כאן, אנו מציגים את מערכת אמינה וישירה דו-ממדית (2D) coculture ללמוד את האינטראקציה בין תאים סרטניים adipocytes מח עצם, אשר חושף את אפקט כפול של מלנומה נגזר תא גורמים על adipocytes מח העצם בידול גם מהווה שיטה קלאסי לצורך המחקר מכניסטית של עצם גרורות.

Abstract

Crosstalk בין מח עצם adipocytes תאים סרטניים עשוי לשחק תפקיד קריטי בתהליך של עצם גרורות. מגוון שיטות זמינות עבור הלומדים crosstalk משמעותי; עם זאת, מערכת transwell דו-ממדי עבור coculture נשאר קלאסי, אמינה, בעלת דרך קלה עבור מחקר crosstalk זה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המציג את coculture של מח עצם adipocytes, בתאי מלנומה. למרות זאת, מערכת כזו coculture יכול לתרום המחקר של תא transductions אות של תאים סרטניים המושרה על ידי מח העצם adipocytes אלא גם לעתיד מכניסטית ללמוד על עצם גרורות אשר עלול לגלות מטרות טיפוליות חדשות עבור עצם גרורות.

Introduction

גרורות בעצמות נפוץ בקרב חולי סרטן מתקדם, אך טיפול המרפא אינו זמין עדיין. מעבר המתמחה באחסון אנרגיה כשומן, adipocytes יכול לתמוך הגידול, גרורות במח העצם, שאר האיברים^1,2,3,4,5,6. יתר על כן, adipocytes ממלאות תפקיד חיוני בוויסות סרטן התא ביולוגיה^7,8,9,10 ואת חילוף החומרים^{4,11,12 ,13,14,15,16}, כמו גם כמו ב עצם גרורות^1,4,12. בנישה מח עצם, adipocytes יכולים להשפיע גם על ההתנהגות הביולוגית של סרטן תאים^4,6,17. יחסי הגומלין בין מח עצם adipocytes תאים סרטניים עם osteotropism היא משמעותית להבנת עצם גרורות. עם זאת, מעט מאוד ידוע.

על סמך המחקרים הנוכחי, שיטות שונות חלות adipocytes, כולל שני - או תלת ממדית (2) / 3יח ו- ex-vivo תרבויות^{17,18,19,20,21}. לאחרונה, Herroon. ואח עיצב גישה 3D-תרבות חדשה ללמוד אינטראקציות של מח עצם adipocytes עם סרטן תאים²². אמנם coculture 3D אופטימלי מחקה פיזיולוגיים אינטראקציות בין adipocytes לבין סרטן תאים ויוו, זה סובל מסכן הפארמצבטית^22,23. לעומת מערכת 2D coculture, מערכת 3D coculture עשויה לספק פנוטיפים הסלולר שונים, כגון תא מורפולוגיה^{21,22,24,25,26}. יתר על כן, התרבות שמחוץ שברי רקמת עצם ספוגית מבודד יכול להוביל המוצלח חזקים adipocytes מ מח עצם בתרבית תאים¹⁷.

לעומת דגמים קודמים אלה, עם זאת, המודל התרבות התא 2D נשאר טכניקה קלאסית, אמין וקל עבור במהירות הסריקה מולקולות המועמד, על הפנוטיפים השתנה adipocytes או סרטן תאי במבחנה^{1, 4,6,12,15,27}. כדי להבין טוב יותר crosstalk בין מח עצם adipocytes בתאי מלנומה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מערכת coculture דו-מימדית של מח עצם adipocytes עם תאי מלנומה.

Protocol

הערה: כל התאים המשמשים פרוטוקול זה צריך להיות בוגר לפחות שלושה דורות לאחר מפשיר מתאי מניות קפוא.

1. הקציר גורמים נגזר תא מלנומה

1. ההכנות
   1. להשיג B16F10 תאים וקו תא מלנומה העכבר.
      הערה: עבור פרוטוקול זה, קו תא מלנומה העכבר הושג מהבנק תאי גזע של האקדמיה הסינית למדעים.
   2. להפוך למדיום מלאה לתרבות תא B16F10 (100 מ"ל). השתמש בינוני ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 50 U/mL פנצילין ולאחר 50 µg/mL של סטרפטומיצין.
   3. להפוך מדיום ללא סרום עבור הרעב של תאי B16F10 (50 מ"ל). השתמש DMEM הבינונית ללא FBS U/mL 50 של פניצילין, µg 50/mL של סטרפטומיצין.
2. להכין בינוני ממוזגים מלנומה (ס מ)
   1. זרע 2.0 x 10⁵ B16F10 בתאים 100 מ מ מגישים עם 10 מ"ל של 10% FBS DMEM. ואז דגירה התאים 37 ° C חממה באווירה של 5% CO₂ במשך 24 שעות ביממה.
   2. כאשר התאים מגיעים כ- 80% של זרימה, להסיר את המדיום תרבות, לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) (1 x, ה-pH 7.4), והחלף המדיום 10 מ"ל ללא סרום בינונית עבור הרעב.
   3. להחזיר את התאים החממה במשך 18 – 24 שעות.
   4. לאחר הרעב, לאסוף את המדיום ממוזגים (ס מ) עם פיפטה, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה מ"ל.
      הערה: המדיום ממוזגים הוא תגובת שיקוע של התרבויות תא B16F10. ודא כי התאים B16F10 הם במצב טוב לפני איסוף של ס מ.
   5. Centrifuge את ס"מ על 5 דקות ב x 1000 גרם -4 מעלות צלזיוס.
   6. Pipette את תגובת שיקוע והעבר אותו צינור סטרילי טריים או בקבוק.
      הערה: יש להימנע pipetting את בגדר בתחתית הצינורית.
   7. כדי להסיר את שאריות תאים, לסנן את ס מ על ידי העברתו דרך מסנן מיקרומטר 0.45 מזרק המחובר על גבי בקבוק סטרילי או צינור.
      הערה: 0.22 מיקרומטר מסננים הם אופטימליים עבור סינון של ס מ.
   8. לאחסן את תגובת שיקוע המסוננות ב-20 ° C עד השימוש.
      הערה: מומלץ לא לאחסן את תגובת שיקוע ב-20 מעלות צלזיוס במשך יותר מחודש. לחלופין, לאחסן את ס"מ ב-80 מעלות צלזיוס לתקופות ממושכות יותר של זמן הבידול של adipocyte.

2. אינדוקציה של מח עצם Adipocytes על ידי גורמים נגזר תא מלנומה

1. ההכנות
   1. להפוך 100 מ של adipogenic אינדוקציה בינונית²⁸. השתמש DMEM מלאה בתוספת 5 µg/mL של אינסולין, 0.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine 1 מיקרומטר דקסמתזון. לאחסן אותו עד שבועיים, 4 מעלות צלזיוס.
   2. הכן 100 מ של adipogenic תחזוקה בינוני. השתמש DMEM מלאה או מעורבב עם מלנומה 50% ס מ בתוספת 5 µg/mL של אינסולין.
   3. להפוך את פתרון מניות הנפט אדום O. לפזר 30 מ ג של אבקת שמן אדום O ב- 10 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל (≥ 99.5%) ומערבבים אותם היטב על ידי מערבולת.
      הערה: לאחסן אותו עד 1 שנה-4 מעלות צלזיוס.
   4. להפוך את פתרון עובד שמן אדום O. בשכונה fume, לדלל את שמן אדום O מניות הפתרון (מתוך שלב 2.1.3) עם מים יונים על יחס של 3:2. דגירה את התערובת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולסנן אותו דרך מסנן מיקרומטר 0.22 לפני השימוש.
      הערה: השתמש רק את הפתרון עובד טריים בתוך שעתיים.
2. בידול adipocyte
   1. תרבות תא סטרומה קו 14F1.1 מן העכבר מח עצם²⁹ בצלחת 60 מ מ עם DMEM מלאה ב- 80% confluency ב חממה 37 ° C באווירה של 5% CO₂.
      הערה: לחלופין, להחליף 14F1.1 תאים mesenchymal הנגזרות מח העצם העיקרי³⁰.
   2. Trypsinize התאים עם 1.5 מ של פתרון טריפסין 0.25% באינקובטור למשך 1-2 דקות.
   3. הוסף 5 מ של 10% FBS בינוני לתאים ולספור את מספרי הטלפון הנייד עם hemocytometer זכוכית; ואז להתאים את צפיפות התאים עד כ 1-2 x 10⁵/mL.
   4. זרע 5 x 10⁴ תאי 14F1.1 לכל טוב לתוך צלחת 24-ובכן עם 0.5 מ של adipogenic אינדוקציה בינוני. אחרי שני ימי דגירה, התאים להגיע כ- 90% של הנהרות.
      הערה: השלב זה קריטי מאוד. תאי סטרומה מח העצם לא יכול להיגרם כדי adipocytes ללא בינוני אינדוקציה adipogenic.
   5. להסיר את המדיום אינדוקציה ולשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS בכל פעם.
   6. לשנות ל 1 מ"ל adipogenic תחזוקה בינוני ולהמשיך התרבות התאים עד ההבשלה adipocyte.
      הערה: תחת מיקרוסקופ, adipocytes נראה כמו בועות סבון קטן או גדול, קל מאוד לזהות. בדרך כלל, adipocytes בוגר נוכחים את 6^th או ביום^ה 8.
   7. כתם על adipocytes בוגרת עם שמן אדום O או לאסוף את adipocytes עבור ניתוח (qPCR), תגובת שרשרת של פולימראז כמותית.
3. Adipocyte מכתים
   1. לשטוף 14F1.1 הבדיל תאים 2 x עם PBS ותקן אותן בפורמלין 3.7% לשעה.
   2. לשטוף את התאים ב- 60% אלכוהול איזופרופיל ולאפשר להם להתייבש לגמרי.
   3. הוספת 0.2 מ"ל של הפתרון עובד שמן אדום O הבארות, דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך 0.5 עד 2 h.
   4. לשטוף את התאים עם מים כדי להסיר את צבע לא מאוגד.
   5. תמונה של adipocytes צבוע תחת מיקרוסקופ אור.

3. coculture של מח עצם Adipocytes עם תאי מלנומה

1. ההכנות
   1. להכין adipocytes מח עצם בוגרת: זירוז התאים 14F1.1 לתוך adipocytes מוניטור בוגרים ב- 24-ובכן צלחות עם המדיום אינדוקציה adipogenic 2 ימים, ולאחר מכן לשמור אותם בתוך המדיום תחזוקה adipogenic עבור 6-8 ימים נוספים.
   2. להכין את התאים B16F10: התרבות התאים B16F10 במנות 60 מ מ עם 5 מ של DMEM בינונית.
   3. להרטיב את תותב ממברנה (למשל transwell): להוסיף 150 µL בינוני DMEM נטולת FBS 0.4 µm גודל הנקבוביות ממברנה התוספות, לטבול אותם על הבארות של לוחות 24-ובכן מלא 500 µL של DMEM FBS ללא מדיום.
2. הגדרת coculture
   1. פיפטה לאט את המדיום של כל הוספה.
      הערה: לא מחריבים את הקרום בעת הסרת המדיום.
   2. זרע תאי B16F10 (0/10³/10⁵/10⁶) הנקבובית מיקרומטר 0.4 מוסיף מהשלב 3.2.1.
   3. החלף המדיום תחזוקה adipogenic ב הבארות adipocytes מח עצם בוגרת מהשלב 3.1.1. עם 600 µL בינוני DMEM מלאה.
   4. להעביר את הכיסויים מלא עם תאי B16F10 (מתוך שלב 3.2.2) על הבארות עם adipocytes מח עצם בוגרת (מתוך שלב 3.2.3) עבור הניסויים coculture.
   5. תקופת דגירה של cocultures-CO 37 ° C ו-5%₂ של 2 ימים.
   6. לאחר 48 שעות של דגירה, הסר את המכסים של coculture ולאחר מכן לשטוף את adipocytes 2 x עם 500 µL ל- 1 x PBS.
      הערה: לחלופין, איסוף התאים B16F10 הכיסויים לניתוח במידת הצורך.
   7. מכתים את adipocytes עם הפתרון עובד שמן אדום O או לאסוף את adipocytes לניתוח qPCR.
      הערה: עיין בהליך מכתימים בשלב 2.3.
   8. תמונה של adipocytes צבוע תחת מיקרוסקופ אור.

4. qPCR ניתוח של החתימה גנים ספציפיים Adipocyte

1. להוסיף 0.5 מיליליטר מוכן לשימוש RNA בידוד מגיב לכל טוב לתוך צלחת 24-ובכן adipocyte בוגר אשר הוא מוכן לזהות.
2. בצע את פרוטוקול תקני עבור החילוץ RNA ו- סינתזה cDNA³¹.
3. להשתמש ומהצמיגים 18S, GAPDH שליטה, ו CEBPα/β, PPARγ, FABP4, לפטין, לבחירות-1 או אדיפונקטין לחתימה ג'ין adipocyte ספציפי (טבלה 1).
4. להפעיל את התגובה הבאה הצנטרפוגה תרמי: 95 ° C עבור 20 s, ואחריו 40 מחזורי 95 ° C 1 s ו- C ° 60 20 s.
5. השתמש בשיטת^{ΔΔCt –}2 כדי לחשב שהקיפול שינויים³².

תוצאות

במח העצם, adipocytes יכול להופיע גידול microenvironment^{1,13,33,34,35} בשלב מוקדם לתמיכה התקדמות הגידול דרך גורמים מסיסים או הפעלת osteoclastogenesis^6,12,36, במי?...

Discussion

Cocultures עם מוסיף היה בשימוש נרחב ללמוד אינטראקציות מתא לתא. מערכת 2D coculture היא דרך יעילה כדי לבחון איך שני חלקים crosstalk במבחנה, שלפיו שהצגנו כאן שני סרטן שונים מונחה תא אפקטים על מח עצם adipocytes. מעבדות רבות השתמשו בשיטה זו כדי לחקור crosstalk בין adipocytes לבין סרטן תאים^6,12...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen Inc.	11965092
Fetal Bovine Serum	Invitrogen Inc.	16000–044
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Oil Red o	Sigma-Aldrich	O0625
24-well plate	Corning	CLS3527
Transwell insert	Millipore	MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516
0.25% trypsin	Thermo Scientific	25200056
hemocytometer	Bio-Rad	1450016
Culture incubator	Thermo Scientific
50 mL falcon	Corning	CLS430828
Clean Bench	Thermo Scientific	-
Microscopy	Olympus	-
200 μL pipet tips	BeyoGold	FTIP620
1,000 mL pipet tips	BeyoGold	FTIP628