Efeitos duplos de fatores derivado de células de Melanoma na diferenciação de adipócitos de medula óssea

Resumo

Aqui, apresentamos um sistema confiável e simples bidimensional coculture (2D) para estudar a interação entre as células do tumor e da medula óssea de adipócitos, que revela um duplo efeito de fatores derivado de células de melanoma em adipócitos a medula óssea diferenciação e também coloca um método clássico para o estudo mecanicista da metástase óssea.

Resumo

O crosstalk entre adipócitos de medula óssea e células tumorais pode desempenhar um papel crítico no processo de metástase óssea. Uma variedade de métodos estão disponíveis para estudar a interferência significativa; no entanto, um sistema bidimensional transwell para coculture continua a ser um clássico, confiável e fácil caminho para este estudo de interferência. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que mostra o coculture de adipócitos de medula óssea e células de melanoma. No entanto, tal sistema coculture poderia não só contribuir para o estudo da transductions de sinal de celular das células cancerosas induzidas pela medula óssea adipócitos, mas também para o futuro mecanicista estudo de metástase óssea, que pode revelar novos alvos terapêuticos para o osso metástase.

Introdução

Metástases ósseas são comuns entre pacientes com câncer avançado, mas um tratamento curativo é ainda não está disponível. Além de especializada em armazenamento de energia como gordura, adipócitos podem suportar o crescimento do tumor e metástases em medula óssea e outros órgãos^1,2,3,4,5,6. Além disso, adipócitos desempenham um papel essencial na regulação câncer célula biologia^7,8,9,10 e metabolismo^{4,11,12 ,13,14,15,16}, como bem como em osso metástase^1,4,12. No nicho de medula óssea, adipócitos também podem afetar o comportamento biológico do câncer células^4,6,17. A interacção entre a medula óssea adipócitos e células de câncer com osteotropism é significativa para a compreensão da metástase óssea. No entanto, pouco se sabe.

Baseado nos estudos atuais, vários métodos são aplicados a adipócitos, incluindo duas ou três dimensões (2/3D) e ex vivo culturas^{17,18,19,20,21}. Recentemente, Herroon et al desenhou uma nova abordagem de 3D-cultura para estudar as interações dos adipócitos de medula óssea com células de câncer²². Embora o coculture 3D é ideal para imitar fisiológicas interações entre adipócitos e câncer células na vivo, sofre pobre reprodutibilidade^22,23. Em comparação com um sistema de coculture 2D, um sistema 3D coculture pode fornecer diferentes fenótipos celulares, tais como célula morfologia^{21,22,24,25,26}. Além disso, a cultura ex vivo de fragmentos de tecido ósseo esponjoso isolado pode levar a uma consequência robusta de adipócitos de células de medula culta¹⁷.

Em contraste com os modelos anteriores, no entanto, o modelo de cultura celular 2D continua a ser uma técnica clássica, confiável e fácil para digitalização rapidamente as moléculas do candidato e os fenótipos mudados em adipócitos ou câncer células in vitro^{1, 4,6,12,15,27}. Para entender melhor o crosstalk entre adipócitos de medula óssea e as células de melanoma, nós fornecemos um protocolo detalhado para um sistema 2D coculture dos adipócitos de medula óssea com células de melanoma.

Protocolo

Nota: Todas as células, usadas no presente protocolo devem ser adultos pelo menos três gerações após o descongelamento de células congeladas de estoque.

1. colheita fatores de derivado de células de Melanoma

1. Preparações
   1. Obter células B16F10 e uma linhagem de células de melanoma de rato.
      Nota: Para este protocolo, uma linhagem de células de melanoma de rato foi obtida do banco de células-tronco da Academia Chinesa de Ciências.
   2. Fazer um meio completo para a cultura de células B16F10 (100 mL). Uso suplementado modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 10% fetal de soro bovino (FBS), 50 U/mL de penicilina e 50 µ g/mL de estreptomicina.
   3. Fazer um meio livre de soro pela fome das células B16F10 (50 mL). Use DMEM meio sem FBS, 50 U/mL de penicilina e 50 µ g/mL de estreptomicina.
2. Preparar o melanoma-condicionado médio (CM)
   1. Semente de 2,0 x 10⁵ B16F10 células em um 100 mm prato com 10 mL de 10% FBS DMEM. Então Incube as células em uma incubadora de 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO₂ por 24 h.
   2. Quando as células atingem cerca de 80% de confluência, remover o meio de cultura, lavar as células duas vezes com 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) (1 x, pH 7,4) e substituir o medium com um 10 mL soro livre médio pela fome.
   3. Retorno das células para a incubadora para 18-24 h.
   4. Após a fome, recolher o meio condicionado (CM) com uma pipeta e transferi-lo para um tubo de centrífuga 50 mL.
      Nota: O meio condicionado é o sobrenadante das culturas de células B16F10. Certifique-se que as células B16F10 estão em boas condições antes de coletar o CM.
   5. Centrifugue o CM por 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.
   6. Pipetar o sobrenadante e transferir para um tubo estéril de fresco ou garrafa.
      Nota: Evite pipetagem fora o sedimento no fundo do tubo.
   7. Para remover os detritos de célula, filtre o CM por passagem através de um filtro de 0,45 µm seringa conectada em cima de um frasco estéril ou tubo.
      Nota: 0,22 µm de filtros são ideais para a CM de filtragem.
   8. Armazene o sobrenadante filtrado a-20 ° C até o uso.
      Nota: É melhor não armazenar o sobrenadante a-20 ° C por mais de um mês. Alternativamente, armazene o CM a-80 ° C por mais longos períodos de tempo para a diferenciação dos adipócitos.

2. indução de adipócitos de medula óssea por fatores de derivado de células de Melanoma

1. Preparações
   1. Fazer 100 mL de adipogenic indução média²⁸. Use um DMEM completo suplementado com 5 µ g/mL de insulina, 0.5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine e 1 µM de dexametasona. Armazená-lo para duas semanas a 4 ° C.
   2. Prepare 100 mL de meio de manutenção de adipogenic. Usar um DMEM completa ou misturado com melanoma 50% CM suplementado com 5 µ g/mL de insulina.
   3. Fazer uma solução de óleo vermelho O estoque. Dissolver 30 mg de pó O vermelho de óleo em 10 mL de isopropanol (≥ 99.5%) e misturá-los bem pelo vórtice.
      Nota: Armazená-lo para 1 ano a 4 ° C.
   4. Fazer uma solução de óleo vermelho O trabalho. Na coifa, dilua a solução de estoque de óleo vermelho O (da etapa 2.1.3) com água deionizada na proporção de 3:2. Incubar a mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente e filtrar através de um filtro de 0,22 µm antes da utilização.
      Nota: Utilize apenas a solução fresca de trabalho até 2 horas.
2. Diferenciação dos adipócitos
   1. Cultura uma célula do estroma linha 14F1.1 de medula óssea de rato²⁹ em um prato de 60 mm com uma completa DMEM na confluência de 80% em uma incubadora de 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO₂.
      Nota: Como alternativa, substitua 14F1.1 primário de células mesenquimais derivadas da medula óssea de³⁰.
   2. Trypsinize as células com 1,5 mL de uma solução de tripsina 0,25% na incubadora para 1 a 2 min.
   3. Adicionar 5 mL de meio FBS de 10% para as células e contar o número de células com um hemocytometer de vidro; em seguida, ajuste a densidade de célula a aproximadamente 1 – 2 x 10⁵/mL.
   4. Semente de 5 x 10⁴ de 14F1.1 células por poço em uma placa de 24 com 0,5 mL de meio de indução de adipogenic. Após dois dias de incubação, as células atingir cerca de 90% de confluência.
      Nota: Este passo é muito crítico. Células do estroma da medula óssea não podem ser induzidas a adipócitos sem um meio de indução de adipogenic.
   5. Remover o meio de indução e lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS cada vez.
   6. Mude para 1 mL de meio de manutenção de adipogenic e continuar a cultura das células até a maturação dos adipócitos.
      Nota: Sob um microscópio, adipócitos parecem pequenas ou grandes bolhas de sabão e são muito fáceis de reconhecer. Geralmente, adipócitos maduros estão presentes em 6^th ou 8^° dia.
   7. Mancha os adipócitos maduros com óleo vermelho ou coletar os adipócitos para análise quantitativa do polymerase reação em cadeia (qPCR).
3. A coloração dos adipócitos
   1. Lavagem a 14F1.1 diferenciadas células 2x com PBS e corrigi-los em 3,7% formaldeído por 1h.
   2. Enxagúe as células em 60% de isopropanol e deixe-os secar completamente.
   3. Adicionar 0,2 mL da solução de trabalho de óleo vermelho O nos poços e incube-lo à temperatura de 0,5 a 2 h.
   4. Lave as células com água para remover os corantes não acoplados.
   5. Fotografia os adipócitos tingidos sob um microscópio de luz.

3. coculture dos adipócitos de medula óssea com células de Melanoma

1. Preparações
   1. Prepare o osso maduro adipócitos medula: induzir as células 14F1.1 em adipócitos maduros do BM em placas de 24 poços com o meio de indução de adipogenic por 2 dias e depois mantê-las em meio de manutenção de adipogenic por mais 6 a 8 dias.
   2. Preparar as células B16F10: cultura de células B16F10 em pratos de 60 mm com 5 mL de meio DMEM.
   3. Umedeça a inserção de membrana (por exemplo, transwell): Adicionar 150 µ l de meio DMEM FBS-livre para as 0,4 µm a inserções de tamanho dos poros da membrana e mergulhe-os em cima dos poços das placas 24-bem preenchidos com 500 µ l de meio DMEM FBS-livre.
2. Configuração de coculture
   1. Lentamente a pipeta fora o médio de cada inserção.
      Nota: Não destrua a membrana ao remover o meio.
   2. As células B16F10 (0/10³10⁵10⁶) a 0,4 µm poro insere de passo 3.2.1 de semente.
   3. Substitua o meio de manutenção de adipogenic dos poços com os adipócitos maduros da medula óssea da etapa 3.1.1. com 600 µ l de meio DMEM completo.
   4. Transferi as inserções preenchidas com as células B16F10 (da etapa 3.2.2) em cima dos poços com os adipócitos maduros da medula óssea (da etapa 3.2.3) para os experimentos de coculture.
   5. Incube as cocultures a 37 ° C e 5% de CO₂ por 2 dias.
   6. Após 48 h de incubação, remover as inserções do coculture e depois lavar os adipócitos 2 x com 500 µ l de PBS 1x.
      Nota: Opcionalmente, colete as células B16F10 nas bulas para análise, se necessário.
   7. Mancha os adipócitos com a solução de óleo vermelho O trabalho ou coletar os adipócitos para análise de qPCR.
      Nota: Consulte o procedimento de coloração na etapa 2.3.
   8. Fotografia os adipócitos tingidos sob um microscópio de luz.

4. análise do Gene Signature específicas dos adipócitos de qPCR

1. Adicionar 0,5 mL de reagente de isolamento de RNA de ready-to-use por alvéolo em uma placa de 24 na qual adipócito maduro está pronto para detectar.
2. Siga um protocolo padrão para a extração de RNA e a síntese de cDNA³¹.
3. Use o primer para 18S e GAPDH como o controle e CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptina, Pref-1 ou Adiponectina para a assinatura do gene específico dos adipócitos (tabela 1).
4. Execute a seguinte reação em um termociclador: 95 ° C por 20 s, seguida de 40 ciclos de 95 ° C por 1 s e 60 ° C durante 20 s.
5. Use o método de^ΔΔCt de^–2 para calcular que a dobra altera³².

Resultados

Na medula óssea, adipócitos podem aparecer no tumor microambiente^{1,13,33,34,35} numa fase precoce para apoiar a progressão do tumor através de fatores solúveis ou Ativando a^12,osteoclastogenesis^6,36, especialmente no contexto da ob...

Discussão

Cocultures com inserções foram amplamente utilizados para estudar as interações de célula para célula. O sistema coculture 2D é uma maneira eficaz de observar como as duas partes crosstalk em vitro, pelo qual mostramos aqui dois efeitos diferentes de câncer orientado a célula na medula óssea de adipócitos. Muitos laboratórios têm utilizado este método para investigar o crosstalk entre adipócitos e câncer células^6,12,,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen Inc.	11965092
Fetal Bovine Serum	Invitrogen Inc.	16000–044
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Oil Red o	Sigma-Aldrich	O0625
24-well plate	Corning	CLS3527
Transwell insert	Millipore	MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516
0.25% trypsin	Thermo Scientific	25200056
hemocytometer	Bio-Rad	1450016
Culture incubator	Thermo Scientific
50 mL falcon	Corning	CLS430828
Clean Bench	Thermo Scientific	-
Microscopy	Olympus	-
200 μL pipet tips	BeyoGold	FTIP620
1,000 mL pipet tips	BeyoGold	FTIP628