JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, bir çift etkisi melanoma hücre kaynaklı faktörler kemik iliği adiposit ortaya koymaktadır tümör hücreleri ve kemik iliği adipositler, arasındaki etkileşimi çalışmak için güvenilir ve doğru sözlü iki boyutlu (2D) coculture sistemi mevcut farklılaşma ve ayrıca kemik metastaz mekanik incelenmesi için klasik bir yöntem teşkil etmektedir.

Özet

Kemik iliği adiposit ve tümör hücreleri arasında çapraz karışma kemik metastaz sürecinde önemli bir rol oynayabilir. Çeşitli yöntemler önemli crosstalk eğitim için kullanılabilir; Ancak, bir iki boyutlu transwell sistemi coculture için bir klasik, güvenilir ve kolay bir şekilde bu çapraz karışma çalışma için kalır. Burada, coculture kemik iliği adiposit ve Melanom hücreleri gösterir ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut. Yine de, böyle bir coculture sistem sadece hücre sinyal transductions kemik iliği adipositler tarafından indüklenen kanser hücrelerinin incelenmesi katkıda ama Ayrıca kemik için yeni tedavi hedefleri ortaya çıkarabilir kemik metastaz, geleceğe mekanik çalışma metastaz.

Giriş

Kemik metastazı ileri kanser hastaları arasında yaygın, ancak bir iyileştirici tedavi hala ulaşılamıyor. Yağ olarak enerji depolama uzmanlaşmış ötesinde, adipositler tümör büyüme ve metastaz kemik iliği ve makarna diğer organları1,2,3,4,5,6' da destekleyebilir. Ayrıca, adipositler kanser hücre biyolojisi7,8,9,10 ve metabolizma4,11,12 düzenlenmesinde önemli bir rol oynamak su kuyusu içinde olarak kemik metastaz1,4,12gibi ,13,14,15,16,. Kemik iliği niş içinde adiposit da kanser hücreleri4,6,17biyolojik davranışını etkileyebilir. Kemik iliği adiposit ve osteotropism kanseri hücreleri arasındaki etkileşimi bir kemik metastaz anlamak için önemlidir. Ancak, az şey bilinmektedir.

Mevcut çalışmalar üzerinde bağlı olarak, iki veya üç boyutlu (2/3D) ve ex vivo kültürler17,18,19,20,21de dahil olmak üzere adiposit için çeşitli yöntemler uygulanır. Son zamanlarda, Herroon vd. kemik iliği adiposit etkileşimleri kanser hücreleri22ile çalışmaya yeni bir 3D-kültür yaklaşım tasarlanmış. 3D coculture fizyolojik taklit için en uygun olmasına rağmen adiposit ve kanser arasındaki etkileşimler hücreleri vivo içindebu zavallı tekrarlanabilirlik22,23uğrar. 2D coculture sistemi ile karşılaştırıldığında, bir 3D coculture sistemi gibi hücre morfolojisi21,22,24,25,26farklı hücresel fenotipleri sağlayabilir. Ayrıca, izole Süngerimsi Kemik doku parçaları ex vivo kültürünü adiposit sağlam bir akıbet kültürlü kemik iliği hücreleri17yol açabilir.

Hızlı bir şekilde tarama aday molekülleri ve adiposit veya kanser değişti fenotipleri vitro1hücreleri bu önceki modellerin aksine Ancak, 2D hücre kültür modeli bir klasik, güvenilir ve kolay teknik kalır, 4,6,12,15,27. Kemik iliği adiposit ve Melanom hücreleri arasında çapraz karışma daha iyi anlamak için biz bir detaylı protokol kemik iliği adiposit Melanom hücreleri ile 2D coculture sistemi için sağlar.

Protokol

Not: Bu protokol için kullanılan tüm hücre donmuş hisse senedi hücrelerden çözdürme sonra en az üç nesiller için yetişkin olmalıdır.

1. hasat Melanoma hücre kaynaklı faktörler

  1. Hazırlıklar
    1. B16F10 hücreleri ile bir fare melanoma hücre kültürünü edinmek.
      Not: Bu iletişim kuralı için bir fare melanoma hücre kültürünü Çin Bilimler Akademisi kök hücre bankadan elde edildi.
    2. B16F10 hücre kültürü (100 mL) için tam bir orta yapmak. Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) % 10 fetal Sığır serum ile (FBS), 50 U/mL penisilin ve 50 µg/mL streptomisin takıma kullanın.
    3. B16F10 hücreleri (50 mL) açlık serum-Alerjik orta yapmak. DMEM FBS olmadan orta, 50 U/mL penisilin ve 50 µg/mL streptomisin kullanın.
  2. Melanom şartına Orta (CM) hazırlamak
    1. Tohum 2.0 x 105 B16F10 hücrelerde 100 mm ile 10 mL % 10 FBS DMEM çanağı. O zaman bir 37 ° C Kombine Kuluçka makinesi %5 CO2 bir ortamda 24 h için hücrelerde kuluçkaya.
    2. Hücreleri izdiham yaklaşık % 80 ulaştığında, kültür orta kaldırmak, fosfat tamponlu tuz (PBS) (1 x, pH 7,4) 5 mL iki kez hücrelerle yıkama ve 10 mL için açlık serum-Alerjik orta orta yerine.
    3. Hücreleri 18 – 24 h için kuluçka dönün.
    4. Açlık sonra bir pipet ile klimalı ortam (CM) toplamak ve bir taze 50 mL santrifüj tüpü aktarın.
      Not: Klimalı B16F10 hücre kültürleri süpernatant ortamıdır. B16F10 Hücreleri CM toplama önce iyi durumda olduğundan emin olun.
    5. CM, 1000 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi
    6. Süpernatant pipette ve taze steril tüp ya da şişe aktarın.
      Not: tüpün dibinde Pelet kapalı pipetting kaçının.
    7. Hücre artıkları kaldırmak için bir şırınga bağlı 0,45 µm filtre bir steril şişe ya da tüp üstüne aracılığıyla geçirerek CM filtre.
      Not: 0,22 µm filtreleri CM filtre uygulamak için en iyi durumda.
    8. Filtre uygulanmış süpernatant-20 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
      Not:-20 ° C'de süpernatant bir ay daha fazla saklamamayı en iyisidir. Alternatif olarak,-80 ° C'de CM daha uzun bir süre adipocyte farklılaşma için saklamak.

2. indüksiyon kemik iliği adipositler tarafından Melanoma hücre kaynaklı faktörler

  1. Hazırlıklar
    1. Adipojenik indüksiyon orta28100 mL olun. 5 µg/mL ile insülin, 0,5 mM 3-izobütil-1-methylxanthine ve 1 µM deksametazon takıma tam bir DMEM kullanın. İki hafta 4 ° C'de depolama yapar
    2. Adipojenik bakım orta 100 mL hazırlayın. Tam bir DMEM kullanın veya % 50 Melanom 5 µg/mL ile insülin takıma CM ile karışık.
    3. Bir yağ kırmızı O hisse senedi çözüm olun. İsopropanol (≥ % 99.5) 10 ml yağ kırmızı O tozu 30 mg dağıtılması ve bunları de gönderen vortex karıştırın.
      Not: Bu 4 ° C'de 1 yıl depolama yapar
    4. Bir yağ kırmızı O çalışma çözüm olun. Duman başlık, (2.1.3. adımdaki) yağ kırmızı O hisse senedi çözüm 3:2 oranında deiyonize suyla seyreltik. Karışımı oda sıcaklığında 15 dk için kuluçkaya ve kullanmadan önce 0.22 µm filtre ile filtre.
      Not: Sadece 2 saat içinde taze çalışma çözüm kullanın.
  2. Adipocyte farklılaşma
    1. Kültür stromal hücre fare kemik iliği29 tam DMEM %80 confluency % 5 CO2bir ortamda 37 ° C kuluçka adlı ile 60 mm yemek 14F1.1 hatta.
      Not: Alternatif olarak, 14F1.1 birincil kemik iliği elde edilen mezenkimal hücreler30ile eski yerine koymak.
    2. 1.5 mL % 0.25 tripsin çözeltisi 1-2 min için bir kuluçka hücrelerle trypsinize.
    3. 5 mL % 10 FBS orta de hücrelere ekleme ve bir cam hemasitometre ile hücre sayıları saymak; sonra hücre yoğunluğu yaklaşık 1-2 x 105/mL ayarlayın.
    4. 5 x 104 24-şey plaka bir kuyu başına 14F1.1 hücrelerinin Adipojenik indüksiyon orta 0.5 mL ile tohum. Kuluçka iki gün sonra hücreleri izdiham yaklaşık yüzde 90'ını ulaşmak.
      Not: Bu adım çok önemlidir. Kemik iliği stromal hücreler adiposit Adipojenik indüksiyon orta olmadan ikna edemez.
    5. İndüksiyon orta kaldırmak ve her zaman iki kez PBS 1 mL içeren hücreleri yıkayın.
    6. 1 mL Adipojenik bakım orta değiştirmek ve hücreleri adipocyte olgunlaşma kadar kültür devam ediyor.
      Not: Bir mikroskop altında adiposit küçük veya büyük sabun köpüğü gibi bakmak ve tanımak çok kolaydır. Genellikle, Olgun adipositth 6 veya 8inci günde mevcuttur.
    7. Yağ kırmızı O ile olgun adiposit leke veya nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için adiposit toplamak.
  3. Adipocyte boyama
    1. Yıkama farklılaşmış 14F1.1 2 x PBS ile hücreleri ve onları % 3.7 formaldehit 1 h için düzeltin.
    2. % 60 isopropanol hücrelerde durulama ve onları tamamen kurumasını sağlar.
    3. Wells için 0.2 mL yağ kırmızı O çalışma çözeltisi ekleyin ve 0,5-2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    4. Hücreleri ilişkisiz boya kaldırmak için su ile yıkayın.
    5. Hafif bir mikroskop altında boyalı adiposit fotoğraf.

3. kemik iliği adiposit Melanom hücreleri ile coculture

  1. Hazırlıklar
    1. Olgun kemik iliği adiposit hazırlamak: 14F1.1 hücreleri içine olgun BM adiposit Adipojenik indüksiyon orta ile 24-şey tabak içinde 2 gün ikna etmek ve o zaman için ek bir 6-8 gün Adipojenik bakım ortamda proje.
    2. B16F10 hücreleri hazırlayın: 60 mm yemekleri ile 5 mL DMEM orta B16F10 hücrelerde kültür.
    3. Membran Ekle (Örneğin transwell) nemlendirin: FBS ücretsiz DMEM orta 150 µL 0.4 µm gözenek boyutu membran ekler eklemek ve onları wells FBS ücretsiz DMEM orta 500 µL ile dolu 24-şey plakaların üzerine bırakın.
  2. Coculture ayarı
    1. Yavaş yavaş her ekleme orta pipet.
      Not: membran orta kaldırırken yok etmeyin.
    2. Tohum 0.4 µm gözenek B16F10 hücrelerinde (0/103/105/106)--dan adım 3.2.1 ekler.
    3. Adipojenik bakım orta Wells olgun kemik iliği adiposit adım 3.1.1 değiştirin. ile 600 µL tam DMEM orta.
    4. B16F10 hücrelerden (adım 3.2.2) kuyuları üzerine coculture deneyler için olgun kemik iliği adiposit (Kimden adım 3.2.3) ile dolu ekler aktarın.
    5. 37 ° C ve % 5 CO2 cocultures 2 gün kuluçkaya.
    6. 48 h, kuluçka sonra coculture ekler kaldırmak ve sonra yıkayın adiposit 2 x 1 x PBS 500 µL ile.
      Not: İsteğe bağlı olarak, gerekirse analiz için ekler B16F10 hücrelerde toplamak.
    7. Adiposit petrol kırmızı O çalışma çözüm ile leke veya adiposit qPCR analiz için toplamak.
      Not: adım 2.3 boyama yordama bakın.
    8. Hafif bir mikroskop altında boyalı adiposit fotoğraf.

4. qPCR Adipocyte özgü Gene imza Analizi

  1. Bir 24-şey tabak içinde kullanıma hazır RNA izolasyon reaktif iyi başına 0.5 mL eklemek hangi olgun adipocyte tespit etmek hazırdır.
  2. RNA çıkarma ve cDNA sentez31için standart bir protokol izleyin.
  3. Astar 18S ve GAPDH için kontrol ve CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptin, tercihen-1 veya adiponektin adipocyte özel gen imza (Tablo 1) için kullanın.
  4. Aşağıdaki reaksiyon termal bir cycler çalıştırın: 95 ° C 20 40 95 ° C devredir 1 ardından s, s ve 60 ° C 20 s.
  5. Kat32değişiklikleri hesaplamak için 2-ΔΔCt yöntemini kullanın.

Sonuçlar

Kemik iliğinde adiposit tümör microenvironment1,13,33,34,35 erken bir aşamada tümör ilerleme çözünür faktörler ile desteklemek için görünebilir veya osteoclastogenesis6,12,36, özellikle obezite6

Tartışmalar

Cocultures ekler ile hücre hücre etkileşimleri eğitim için yaygın olarak kullanılmaktadır. 2D coculture sistemi nasıl iki parça crosstalk vitro, biz burada iki farklı kanser hücre tahrik etkileri kemik iliği adipositler tarafından ortaya gözlemlemek için etkili bir yoldur. Birçok labs adiposit ve kanser hücreleri6,12,27,39arasında çapraz karışma araştırmak için...

Açıklamalar

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Teşekkürler

Biz Dov Zipori (Weizmann Enstitüsü bilim, Rehovot, İsrail) lütfen bize fare kemik iliği stromal hücre verdiğiniz için teşekkür ederiz 14F1.1 hattı. Bu çalışmada hibe Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NOS 81771729) ve Yongchuan hastane Chongqing Tıp Üniversitesi ('ları tarafından desteklenmiştir YJQN201330; YJZQN201527).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMInvitrogen Inc.11965092
Fetal Bovine SerumInvitrogen Inc.16000–044
Phosphate Buffered SalineInvitrogen Inc.14190-144
InsulinSigma-Aldrich91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthineSigma-AldrichI5879
DexamethasoneSigma-AldrichD4902
Oil Red oSigma-AldrichO0625
24-well plateCorningCLS3527
Transwell insertMilliporeMCHT24H48
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-122
isopropanolSigma-AldrichI9516
0.25% trypsinThermo Scientific25200056
hemocytometerBio-Rad1450016
Culture incubatorThermo Scientific
50 mL falconCorningCLS430828
Clean BenchThermo Scientific-
MicroscopyOlympus-
200 μL pipet tipsBeyoGoldFTIP620
1,000 mL pipet tipsBeyoGoldFTIP628

Referanslar

  1. Wang, J., et al. Adipogenic niches for melanoma cell colonization and growth in bone marrow. Laboratory Investigation. 97 (6), 737-745 (2017).
  2. Trotter, T. N., et al. Adipocyte-Lineage Cells Support Growth and Dissemination of Multiple Myeloma in Bone. The American Journal of Pathology. 186 (11), 3054-3063 (2016).
  3. Morris, E. V., Edwards, C. M. The role of bone marrow adipocytes in bone metastasis. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 121-123 (2016).
  4. Diedrich, J. D., et al. Bone marrow adipocytes promote the Warburg phenotype in metastatic prostate tumors via HIF-1alpha activation. Oncotarget. 7 (40), 64854-64877 (2016).
  5. Chkourko Gusky, H., Diedrich, J., MacDougald, O. A., Podgorski, I. Omentum and bone marrow: how adipocyte-rich organs create tumour microenvironments conducive for metastatic progression. Obesity Reviews. 17 (11), 1015-1029 (2016).
  6. Chen, G. L., et al. High fat diet increases melanoma cell growth in the bone marrow by inducing osteopontin and interleukin 6. Oncotarget. 7 (18), 26653-26669 (2016).
  7. Balaban, S., et al. Adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration. Cancer & Metabolism. 5, 1 (2017).
  8. Huang, C. K., et al. Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate. Nature Communications. 8, 14706 (2017).
  9. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI Insight. 2 (4), 87489 (2017).
  10. Wang, C., Gao, C., Meng, K., Qiao, H., Wang, Y. Human adipocytes stimulate invasion of breast cancer MCF-7 cells by secreting IGFBP-2. PLoS One. 10 (3), 0119348 (2015).
  11. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
  12. Herroon, M. K., et al. Bone marrow adipocytes promote tumor growth in bone via FABP4-dependent mechanisms. Oncotarget. 4 (11), 2108-2123 (2013).
  13. Tabe, Y., et al. Bone Marrow Adipocytes Facilitate Fatty Acid Oxidation Activating AMPK and a Transcriptional Network Supporting Survival of Acute Monocytic Leukemia Cells. Cancer Research. 77 (6), 1453-1464 (2017).
  14. Wen, Y. A., et al. Adipocytes activate mitochondrial fatty acid oxidation and autophagy to promote tumor growth in colon cancer. Cell Death & Differentiation. 8 (2), 2593 (2017).
  15. Liu, Z., et al. Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation. Oncotarget. 6 (33), 34329-34341 (2015).
  16. Ye, H., et al. Leukemic Stem Cells Evade Chemotherapy by Metabolic Adaptation to an Adipose Tissue Niche. Cell Stem Cell. 19 (1), 23-37 (2016).
  17. Templeton, Z. S., et al. Breast Cancer Cell Colonization of the Human Bone Marrow Adipose Tissue Niche. Neoplasia. 17 (12), 849-861 (2015).
  18. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
  19. Emont, M. P., et al. Using a 3D Culture System to Differentiate Visceral Adipocytes In Vitro. Endocrinology. 156 (12), 4761-4768 (2015).
  20. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
  21. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  22. Herroon, M. K., Diedrich, J. D., Podgorski, I. New 3D-Culture Approaches to Study Interactions of Bone Marrow Adipocytes with Metastatic Prostate Cancer Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 84 (2016).
  23. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Laboratory Investigation. 93 (5), 528-542 (2013).
  24. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  25. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  26. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  27. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  28. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  29. Zipori, D., Toledo, J., von der Mark, K. Phenotypic heterogeneity among stromal cell lines from mouse bone marrow disclosed in their extracellular matrix composition and interactions with normal and leukemic cells. Blood. 66 (2), 447-455 (1985).
  30. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
  31. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. Journal of Visualized Experiments. (132), e56850 (2018).
  32. Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis. Journal of Visualized Experiments. (112), e53822 (2016).
  33. Shafat, M. S., et al. Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment. Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).
  34. Gazi, E., et al. Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy. The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).
  35. Brown, M. D., et al. Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer. British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).
  36. Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer. Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).
  37. Aebi, M. Spinal metastasis in the elderly. European Spine Journal. 12, 202-213 (2003).
  38. Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation. Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).
  39. Bochet, L., et al. Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance. Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).
  40. Hirano, T., et al. Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells. Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).
  41. Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures. Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarsay 138kemik ili i adipocytekemik metastazmelanomcoculturefarkl la mamembran Ekle

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır