肿瘤免疫和非免疫微环境在小鼠皮下肿瘤中的富集与鉴定

摘要

在这里, 我们描述了一个方法, 以分离和丰富的组成部分, 肿瘤免疫和非免疫微环境的建立皮下肿瘤。该技术允许对肿瘤免疫浸润和非免疫肿瘤分数进行单独分析, 从而可以对肿瘤免疫微环境进行综合表征。

摘要

肿瘤免疫微环境 (时间) 最近被认为是一个关键的调解者的治疗反应, 在实体肿瘤, 特别是免疫疗法。最近在免疫治疗方面的最新进展突出了需要重现的方法, 准确和彻底的特点肿瘤及其相关的免疫渗透。肿瘤酶消化和流细胞分析可以广泛地描述多种免疫细胞亚群和表型;然而, 分析的深度往往受到限制的荧光限制的面板设计和需要获得大量的肿瘤样本, 以观察罕见的免疫人群的兴趣。因此, 我们已经开发出一种有效的高通量的方法来分离和丰富肿瘤免疫浸润的非免疫肿瘤成分。所描述的肿瘤消化和离心密度分离技术允许分离的肿瘤和肿瘤免疫浸润分数的特点, 并保持细胞活力, 从而提供了一个广泛的描述肿瘤免疫状态。该方法用于表征实体肿瘤中广泛的空间免疫异质性, 进一步证明了对肿瘤免疫分析技术的一致性要求。总体上, 该方法为皮下固体小鼠肿瘤的免疫学特性提供了一种有效、适应性强的技术;因此, 这个工具可以用来更好地表征肿瘤免疫功能和在临床前评价新的免疫治疗策略。

引言

抑制时间最近被认为是癌症的一个标志, 众所周知, 在肿瘤的发展、进展和保护方面发挥重要作用, 并减轻他们对免疫治疗¹的敏感性。时间由大量的细胞子集和表型组成, 所有这些都为肿瘤的免疫状态提供了重要的洞察力。这些免疫亚群可以进一步分层成淋巴细胞或髓系细胞的起源, 这共同构成了大多数先天和适应性免疫反应^2,3。最近在癌症免疫治疗领域的进展表明, 免疫治疗策略 (即免疫检查点抑制剂, 嵌合体抗原受体 T 细胞等) 有可能导致持久性癌症回归然而, 它们在^4、5的实体肿瘤癌症中仍然相对无效。许多团体已经显示了时间可以在治疗成功^6,7的关键障碍, 因此, 仍然需要准确地评估新的免疫疗法在临床前的设置专门关注其能够调节或克服时间⁸。

目前的工作特点的时间通常利用显微镜或流式细胞术, 以及抗体标签策略, 以确定免疫细胞子集和其特点^9,10。这两种策略提供独特的不同信息, 因为显微镜允许细胞子集的空间欣赏和流式细胞术提供高吞吐量和更广泛的细胞变化量化。尽管最近有改进的荧光复合免疫组化优化光谱成像系统, 现在可以支持多达7参数, 有限的面板大小使广泛的免疫分析困难, 因此这种技术往往为更集中的分析预留。因此, 流式细胞术仍然是最广泛使用的免疫分析技术之一。尽管其在时间表征中的广泛应用, 但用于加工和染色的方法相当多变。通常的协议使用肿瘤游离酶 (即胶原酶, DNase等) 和手工离解方法, 以实现单细胞悬浮, 其次是抗体染色和分析⁷。尽管每种方法都有好处, 但许多群体显示了通过这些技术¹¹可以诱发的广泛的变异性。这使得跨研究比较的肿瘤微环境分析非常困难, 即使在评估相同的小鼠肿瘤模型。此外, 这些方法提供了有限的潜力, 以评估肿瘤细胞和肿瘤免疫渗透成分独立, 因为两个组成部分是散置后消化。样本数量, 然后限制多面板染色和分析, 这成为一个主要的问题时, 试图描述罕见的免疫子集 (即肿瘤特异性 T 细胞)¹²。最近的技术, 如大规模细胞术, 或飞行时间的细胞术 (CyTOF), 允许高维细胞子集的表型分析与一些系统支持面板设计超过42独立参数¹³。尽管 CyTOF 技术在免疫分析方面具有巨大的威力, 但由于费用、分析专业知识和对设备的访问, 它仍然受到限制。此外, 许多 CyTOF 协议建议纯化免疫子集, 以提高信噪比¹⁴, 因此我们建议, 我们的浓缩方法可以用于 CyTOF 分析的上游, 以提高数据质量。

在此, 我们描述了一种肿瘤微环境消化和分析方法, 纳入肿瘤免疫渗透分离。这种方法的目的是允许独立高通量的肿瘤免疫浸润和肿瘤细胞分数的分析, 以更广泛地描述肿瘤微环境。利用该方法, 我们进一步论证了进行全肿瘤分析的重要性, 认为皮下实体瘤模型具有显著的空间免疫异质性。总的来说, 这种方法可以更准确和一致地比较样本, 因为它丰富的免疫细胞亚群在肿瘤和允许独立的分析肿瘤细胞和免疫分数的肿瘤。

研究方案

这里描述的所有方法都已被贝勒医学院的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。

1. 肿瘤的收获和消化

注: 收割所需时间为 3-5 分钟/肿瘤, 加工所需时间为1小时 + 2-3 分/肿瘤。

1. 弄死小鼠通过二氧化碳吸入和喷雾每只老鼠下来与70% 乙醇在收割前防止头发污染。手术切除小鼠皮下肿瘤, 确保肿瘤没有任何污染组织 (如毛发、皮肤、腹膜等). 将每个肿瘤放置在1.8 毫升的基 RPMI-1640 培养基中, 而不需要胎牛血清 (血清) 在24井板中。为了更大的收成, 在冰上保持盘子的低温以保持细胞的活力。
   注: 如果需要不育, 所有的肿瘤解剖将需要在一个生物安全柜内使用无菌外科工具 (如剪刀, 钳等), 以及任何进一步的步骤。最长直径在 0.5-1 厘米之间的肿瘤是最佳的, 更大或更小的肿瘤将需要试剂的缩放。
2. 用剪刀把肿瘤切成少于1毫米的³块。
3. 通过溶酶 i 10 毫克/毫升, 胶原酶 IV 在 2500 u/毫升, 和 DNase I 在 200 U/毫升在基 RPMI-1640 培养基 (没有血清), 制备10x 消化鸡尾酒。
   注: 消化鸡尾酒可以提前一天准备, 储存在-20 摄氏度;但是, 不推荐长时间贮存, 因为酶一旦溶解就会失去活性。
4. 添加200µL 的10x 离解鸡尾酒含有胶原酶 i, 胶原酶 IV, 和 DNase i 到每个井与1毫米³件。
5. 允许样品消化1小时在37°c, 而轻微晃动 60-100 rpm 使用轨道平板振动筛。
   注: 在酶消化过程中, 温度升高到37摄氏度可能会导致免疫细胞活化。
6. 1小时后, 加入1毫升的 RPMI-1640 培养基, 补充5% 的血清和2毫米 EDTA, 以抵消反应。
7. 将肿瘤消化和剩余的肿瘤片注入40µm 细胞过滤器, 安装在50毫升离心管的顶端。
   注: 切断1毫升吸管尖端的尖端, 以便更容易地将肿瘤消化转移到滤网。
8. 使用10毫升注射器柱塞通过过滤器机械地将肿瘤碎片分解。定期冲洗过滤器与2毫升补充 RPMI-1640 培养基 (含5% 的血清) 和重复, 直到细胞过滤器是明确的肿瘤。
   注: 大约 4-10 毫升的总介质应该足以充分冲洗滤网的肿瘤。
   注: 将样品放在冰上, 直到完成所有样品的步骤, 以保持细胞的生存能力。
9. 使用补充的 RPMI-1640 介质, 将每50毫升离心管调整到同一体积。
   注: 容积调整对离心机平衡至关重要。跳过这一步可能会导致离心机损坏或人身伤害。
10. 离心机细胞悬浮液 (5 分钟, 805 x g, 4 °c), 丢弃上清液, 并在2毫升补充 RPMI-1640 介质中重新悬浮。
    注: 细胞骨料可能形成后, 离心, 是难以并用重悬。使用5毫升血清吸管, 并迅速混合, 以打破它之前, 继续。

2. 免疫和肿瘤细胞分数的分离

注: 此步骤所需的时间约为1小时。

1. 将3毫升的密度梯度介质添加到15毫升离心管的底部。为每个肿瘤准备和贴上足够的管子。
2. 将2毫升的肿瘤细胞悬浮在密度梯度介质的顶部, 吹打缓慢地向下侧管以防止两层混合。
3. 小心地放置在离心机的分层管和旋转20分钟在 805 x g, 20 °c, 没有刹车。
   注意: 验证适当的平衡并确保在离心过程中不使用刹车是非常重要的。此过程的任何中断都会导致图层混合, 并且完整的样本恢复将会很困难。
4. 将肿瘤浸润的白细胞 (直至) 层和顶层培养基, 用转移吸管小心转移到新的15毫升管上。丢弃所有剩余的密度梯度介质, 并在2毫升的补充 RPMI-1640 中并用重悬在管底部的肿瘤颗粒。
   注: 离心后从上到下将有四个可见层, 分别对应于: 培养基、TILs、密度梯度介质和肿瘤细胞颗粒。有关各个层的示例, 请参见图 2A 。
5. 在分离的管子 (5 分钟, 805 x g, 4 °c) 中, 离心两个直到和肿瘤标本, 并丢弃上清。
6. 并用重悬在200µL 和肿瘤颗粒在2毫升补充 RPMI-1640 培养基中, 直到样品。保持冰块以保持生存能力。

3. 电镀和染色

注: 电镀所需时间为三十年代/肿瘤;表面染色所需时间为1小时;细胞内染色所需时间为40分钟;流式细胞术分析所需的时间为 1-4 min/肿瘤。

1. 为每个免疫染色板准备并标记一个96井的 U 型底板, 并为细胞计数增加一个盘子。
   注: 通常, 总共准备了三个板块: 淋巴细胞聚焦板、髓系聚焦板和细胞计数板。
2. 整除将单细胞悬浮液放入每一个染色板, 并将一组容积放入计数板中。
   注: 计数板用于计算添加到每个染色面板的单元格总数, 从而允许准确的细胞数量计数。96井板取样和容积分析能力的流式细胞仪可以提供每个样本中每个µL 的单元数, 因此计算添加到每个染色面板中的单元格数。计数板可以获得第二天后固定过夜4摄氏度, 冲洗与外地资产管制署缓冲 (磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 与2% 的血清), 并 resuspending 在一套量的外地资产管制署缓冲区。
3. 用200µL 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 以离心 (5 分钟, 805 x g, 4 摄氏度) 清洗两次细胞, 并在每次冲洗之间丢弃上清, 以除去任何自由的血清。
4. 添加50µL 的 Fc 块, 混合样品使用多通道吸管, 并孵化20分钟4摄氏度。
5. 添加50µL 的2x 浓缩细胞外靶向抗体和固定生存能力染色混合物, 混合使用多通道吸管, 并孵化30分钟在黑暗中的 RT 或4°c。
   注: 抗体的确切染色条件取决于制造商的指示。所有染色稀释必须在 DPBS, 没有添加的血清, 以防止饱和的可修复的活性染料。请参阅本手稿中使用的染色面板的最佳稀释的材料/设备表。抗体和可修复的生存能力染色解决方案是在2x 浓度, 以提供最终1x 染色浓度100µL 的总染色量时添加到 Fc 块。
6. 用离心 (5 分钟, 805 x g, 4 °c) 将样品清洗两次, 并在每次冲洗之间丢弃上清液。
7. 并用重悬在200µL 1x 固定/通透溶液和孵化过夜4摄氏度保护免受光照。
   注意: 这个实验可以在一夜之间暂停, 在这一点上: 保持样品在4摄氏度的保护免受光照。
8. 第二天, 离心板 (5 分钟, 805 x g, 4 °c), 并丢弃上清。
9. 冲洗一次与200µL 1x 通透缓冲器, 离心机 (5 分钟, 805 x g, 4 °c), 并丢弃上清。
10. 添加100µL 1x 浓缩细胞内抗体染色板, 在1x 通透缓冲和孵化30分钟在黑暗中的 RT 或4°c (这取决于染色建议从制造商)。
11. 冲洗一次与1x 通透缓冲 (5 分钟, 805 x g, 4 °c), 放弃上清, 和漂洗第二次与资产管制署缓冲 (PBS 与2% 血清)。
12. 并用重悬300µL (PBS 2% 胎) 的样品, 将样本转移到流式细胞术管, 进行流式细胞仪分析。

结果

我们的研究结果表明, 从非免疫性肿瘤成分分离的显著优势, 如议定书所解释的。此外, 使用所描述的方法, 我们证明了明显的免疫异质性的建立实体肿瘤。

许多肿瘤离解技术的一个重要问题是样本生存能力的丧失, 最常见的原因是严酷的消化条件 (即高温、营养供给不足等)。使用描述的消化方法, 有或没有密度梯?...

讨论

时间由多种复杂的细胞成分和分子组成。最近的证据表明, 准确的描述这个环境可以提供更好的理解治疗成功或失败, 甚至可以帮助确定机制的治疗耐药性。例如, 增加各种免疫抑制细胞 (如MDSCs、T 调节细胞等) 的瘤内水平, 可以减轻效应的免疫应答, 并消除免疫治疗效应。另一方面, 效应免疫种群 (如肿瘤特异性 CD8+ t 细胞、自然杀伤细胞、t 辅助细胞) 的瘤内存在增加, 可以成为?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	N/A	Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line	Acquired from collaborator	N/A	E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line
70% isopropyl alcohol	EMD Milipore	PX1840
Murine surgical tool kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.
24-well plate	Denville Scientific Inc.	T1024	Or any 24-well flat bottom plate.
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R0883
Collagenase I	EMD Milipore	234153
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
DNase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Low Speed Orbital Shaker	BioExpress (supplier: Genemate)	S-3200-LS	Or any orbital shaker.
Thermoregulating incubator	Fisher Scientific	13-255-27	Or any other thermo-regulated incubator
FBS	Sigma-Aldrich	F8192
EDTA	AMRESCO	E177
1 mL Pipette and tips	Eppendorf	13-690-032	Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers	Fisher Scientific	22363547
50 mL Centrifuge Tubes	Denville Scientific Inc.	C1062-P
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific Inc.	C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles	BD	309604
Lymphoprep Density Gradient Medium	STEMCELL Technologies	7811
Transfer Pipettes	Denville Scientific Inc.	P7212
96-well U-bottom plates	Denville Scientific Inc.
DPBS	Sigma Aldrich	D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher Scientific	00-5523-00	Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For 96-well cell volumetric counting
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2	ThermoFisher Scientific	553141	Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	ThermoFisher Scientific	L34962	Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780	ThermoFisher Scientific	47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC	ThermoFisher Scientific	17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE	Santa Cruz Biotechnology	sc-53473
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700	ThermoFisher Scientific	56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450	ThermoFisher Scientific	48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC	ThermoFisher Scientific	17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE	ThermoFisher Scientific	12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	ThermoFisher Scientific	25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710	ThermoFisher Scientific	46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711	BD Biosciences	563755