העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

Summary

כאן אנו מתארים שיטה כדי להפריד ולהעשיר את מרכיבי microenvironment המערכת החיסונית והחיסון של הגידול גידולים הוקמה תת עורית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נפרד של הגידול לחדור המערכת החיסונית ושברים -החיסון הגידול אשר יכולים להרשות אפיון מקיף של microenvironment מערכת החיסון הגידול.

Abstract

הגידול חסין microenvironment (זמן) לאחרונה הוכר כמתווך קריטי של תגובה לטיפול בגידולים מוצקים, במיוחד עבור immunotherapies. התפתחויות אחרונות קליניים חיסוני מדגישות את הצורך שיטות לשחזור לאפיין במדויק וביסודיות הגידול, שלה לחדור המערכת החיסונית המשויך. עיכול אנזימטי הגידול וניתוח cytometric זרימה מאפשרים אפיון רחבה של קבוצות משנה תא החיסון הרבות פנוטיפים; עם זאת, וניתוח מעמיק לעיתים קרובות מוגבל fluorophore הגבלות על לוח עיצוב את הצורך לרכוש דגימות הגידול גדול להתבונן אוכלוסיות החיסון נדירים של ריבית. לכן, פיתחנו שיטה תפוקה גבוהה ויעילה עבור הפרדת ומעשירה הגידול לחדור המערכת החיסונית של הרכיבים הלא-החיסון הגידול. הגידול שתואר לעיכול, הפרדה צנטריפוגלית המבוסס על צפיפות הטכניקה מאפשרת אפיון נפרדים של הגידול, הגידול לחדור המערכת החיסונית שברים המשמרת את הכדאיות הסלולר ואני לפיכך, מספק אפיון רחבה של הגידול מצב אוטואימונית. בשיטה זו נעשה שימוש כדי לאפיין את מקיף המרחבי המערכת החיסונית הטרוגניות בגידולים מוצקים, אשר בהמשך מדגים את הצורך טכניקות פרופיל אוטואימונית עקבי כל הגידול. בסך הכל, שיטה זו מספקת טכניקה יעילה וישימה עבור אפיון אוטואימונית תת עורית מאתר גידולים מוצקים; ככזה, כלי זה יכול לשמש כדי לאפיין טוב יותר את התכונות tumoral אוטואימונית, בהערכה פרה של הרומן אסטרטגיות immunotherapeutic.

Introduction

הזמן מדכאים לאחרונה הוכר סימן היכר של סרטן, וידוע לשחק תפקיד משמעותי התפתחות, התקדמות והגנה של גידולים מוצקים סרטן, כמו גם להמתיק את הרגישות חיסוני¹. הזמן מורכב של מספר קבוצות משנה הסלולר של הפנוטיפים, אשר כולם לספק תובנות קריטי למדינה אוטואימונית של הגידול. אלה קבוצות משנה אוטואימונית יכול להיות מרובדת יותר לתוך תאים של לימפוציטים או מיאלואידית המוצא, אשר יחד מהווים את הרוב של תגובות חיסוניות מולדת, גמישים,^2,3. ההתקדמות בתחום חיסוני סרטן הראו כי אסטרטגיות immunotherapeutic (קרי, מעכבי המערכת החיסונית במחסום, chimeric אנטיגן קולטן תאי-T, וכו ') יש פוטנציאל לגרום סרטן עמיד regressions; עם זאת, הם נשארים יעיל יחסית גידולים מוצקים-סרטן-^4,-⁵. קבוצות רבות הראו המשוכה קריטי כי הזמן יכול לשחק על טיפול הצלחה^6,7, לפיכך, נותר צורך להעריך במדויק את immunotherapies החדש בהגדרת קליניים במיוחד התמקדות שלהם היכולת לווסת או להתגבר על הזמן⁸.

המאמצים הנוכחיים כדי לאפיין את הזמן בדרך כלל לנצל או מיקרוסקופ או לזרום cytometry יחד עם נוגדן תיוג אסטרטגיות כדי לזהות קבוצות משנה התאית החיסונית שלהם תכונות^9,10. אלה שתי אסטרטגיות לספק מידע שונים ייחודי, כמו מיקרוסקופ מאפשר הערכה המרחבי של קבוצות משנה הסלולר cytometry זרימה מספק תפוקה גבוהה, כימות רחבה של שינויים סלולריים. למרות השיפורים בפלורסנט אימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס אופטימיזציה של מערכות הדמיה ספקטרלי, אשר כעת יכול לתמוך עד 7 פרמטרים, גודל לוח מוגבל מקשה רחבה רמת החיסון פרופיל, ובכך טכניקה זו היא לעתים קרובות שמורות יותר ממוקד ניתוחים. כתוצאה מכך, cytometry זרימה נשאר באחת החיסון הנפוצה ביותר. פרופילים טכניקות. למרות השימוש הנרחב שלה באפיון זמן, השיטות המשמש לעיבוד של צביעת הן משתנה מאוד. בדרך כלל פרוטוקולים לנצל את גידול בריא אנזים (קרי, collagenases, DNase, וכו) שיטות דיסוציאציה ידנית כדי להשיג את המתלים מתא בודד, ואחריו נוגדן מכתים וניתוח⁷. למרות היתרונות של כל אחת מהשיטות, קבוצות רבות הראו ההשתנות נרחב זה יכול להיגרם באמצעות טכניקות אלה¹¹. זה עושה השוואות קרוס-מחקר של גידול microenvironment פרופיל קשה מאוד, גם כאשר הערכת המודל מאתר הגידול באותו. יתר על כן, שיטות אלה מספקים פוטנציאל מוגבל כדי להעריך את תאי הגידול, הגידול החיסון לחדור רכיבים באופן עצמאי, שכן שני הרכיבים הם וביניהם לאחר עיכול. כמות הדגימה מגביל ואז רב הפאנל מכתים וניתוח, אשר הופך להיות נושא מרכזי כאשר מנסים לאפיין קבוצות משנה אוטואימונית נדירה (קרי, הגידול הספציפי תאי-T)¹². טכניקות מאוחרים יותר כגון cytometry המונית או cytometry מאת שעת הטיסה (CyTOF), מאפשרים ניתוח פנוטיפי גבוהה-ממדי הסלולר קבוצות משנה עם כמה מערכות תמיכה לוח עיצובים של יותר מ 42 פרמטרים עצמאיים¹³. למרות הכוח העצום של טכנולוגיה CyTOF פרופיל החיסונית, נותר מוגבל בשל ההוצאות, ניתוח מומחיות, גישה לציוד. בנוסף, פרוטוקולים CyTOF רבים ממליצים על טיהור של קבוצות משנה המערכת החיסונית כדי לשפר את יחס אות לרעש¹⁴, ועל כן אנו מציעים כי שיטת העשרה שלנו יכול לשמש הזרם של CyTOF ניתוח לשיפור איכות הנתונים.

במסמך זה אנו מתארים של גידול microenvironment לעיכול, ניתוח בשיטה המשלבת הגידול החיסון לחדור ההפרדה. מטרת שיטה זו היא לאפשר תפוקה גבוהה עצמאית פרופיל של הגידול לחדור המערכת החיסונית ואת הגידול שברים הסלולר עבור אפיון רחבה יותר של microenvironment הגידול. באמצעות שיטה זו, רחוק נדגים את החשיבות של ביצוע ניתוח כל הגידול, כמו דוגמנית גידולים מוצקים תת עורית נמצאה משמעותי הטרוגניות אוטואימונית מרחבית. בסך הכל, שיטה זו באפשרותך יותר מדויק ועקבי להשוות בין מדגמים כי זה מעשיר את מערכת החיסון התאית קבוצות משנה בתוך הגידול ומאפשר בניית פרופיל עצמאית של גידול תאים ושברים המערכת החיסונית של הגידול.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של ביילור לרפואה.

1. הגידול הקציר ועיכול

הערה: הזמן הדרוש הקציר הוא ~ 3-5 דקות/גידול, ואת הזמן הדרוש לעיבוד הוא ~ 1 h + 2-3 דקות/גידול.

1. המתת חסד עכברים על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני, לרסס כל העכבר למטה עם אתנול 70% לפני הקציר כדי למנוע זיהום שיער. בניתוח להסיר גידולים תת עורית של העכברים ולהבטיח כי הגידולים הם ללא כל רקמות מזהמים (קרי, שיער, עור, הצפק, וכו '). מקם כל הגידול 1.8 מ של מדיה RPMI-1640 הבסיס ללא סרום שור עוברית (FBS) לתוך צלחת 24-. טוב. לאסיפים גדול יותר, לשמור על צלחות קר על קרח כדי לשמר את הכדאיות הסלולר.
   הערה: אם נדרשת עקרות, כל הגידול והניתוחים תצטרך להתבצע באבטחה ארון עם כלי ניתוח סטרילי (קרי, מספריים, מלקחיים, וכו '), וכן צעדים נוספים. גידולים בקוטר הארוך בין 0.5 - 1 ס מ אופטימלית, גידולים גדולים יותר או קטנים יותר ידרוש שינוי קנה מידה של ריאגנטים.
2. להשתמש במספריים לחתוך הגידולים בתוך פחות מ 1 מ"מ³ חתיכות בתוך כל טוב.
3. הכינו 10 x קוקטייל לעיכול על ידי המסת collagenase אני ב- 10 מ"ג/מ"ל, collagenase הרביעי 2,500 U/mL, ו DNase. אני ב- U/mL 200 בתקשורת RPMI-1640 בסיס (ללא FBS).
   הערה: קוקטייל העיכול ניתן להכין יום מראש, המאוחסנים ב-20 ° C; עם זאת, אחסון ממושך לא מומלץ כי אנזימים תאבד את הפעילות לאורך זמן פעם התפרקה.
4. להוסיף 200 µL של 10 x דיסוציאציה קוקטייל המכיל collagenase, collagenase הרביעי ואני DNase I כל טוב עם החלקים³ 1 מ מ.
5. לאפשר את הדגימות לעיכול עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועדת קלות במהירות של 60-100 סל ד באמצעות של שייקר צלחת מסלולית.
   הערה: העלאת טמפרטורה ל- 37 ° C במהלך עיכול אנזימטי עלול לגרום להפעלת תא החיסון.
6. לאחר 1 h, לנטרל את התגובה על-ידי הוספת 1 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 בתוספת EDTA FBS ו- 2 מ מ 5% על כל טוב.
7. Pipette העיכול הגידול ואת החלקים הנותרים של הגידול לתוך מסננת תא 40 µm יושב על גבי שפופרת צנטרפוגה 50 מ.
   הערה: חותכים את הטיפ ממני טיפ פיפטה 1 מ"ל להעברה קלה של עיכול הגידול כדי מסננת.
8. להשתמש מכנית disaggregate החלקים הגידול דרך מסננת פומפה מזרק 10 מ"ל. מעת לעת לשטוף את מסננת עם 2 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 שהושלם (המכילה 5% FBS) וחזור עד מסננת התא היא ברורה של הגידול.
   הערה: כ- 4-10 מ"ל של מדיה סה כ צריך להיות מספיק כדי שלמאחה לשטוף את מסננת של הגידול.
   הערה: במקום דוגמאות על הקרח עד להשלמת שלב זה עבור כל הדגימות לשמר את הכדאיות הסלולר.
9. התאם כל שפופרת צנטריפוגה 50 מ ל אותו אמצעי אחסון באמצעות התקשורת RPMI-1640 שהושלם.
   הערה: ההתאמה של אמצעי חיוני לאיזון צנטריפוגה. דילוג על שלב זה יכול לגרום נזק צנטריפוגה או פציעה אישית.
10. Centrifuge את המתלים תא (5 דקות, 805 x g, 4 ° C), למחוק את supernatants, וכן להשעות מחדש ב- 2 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 שהושלם.
    הערה: צבירה תא שעלול להיווצר בעקבות צנטריפוגה שקשה resuspend. שימוש בסיסמה פיפטה 5 מ"ל סרולוגית לערבב במהירות לשבור אותה. לפני שתמשיך.

2. הפרדה בין שברים התאית החיסונית ואת הגידול

הערה: הזמן הנדרש עבור שלב זה הוא כ 1 h.

1. להוסיף 3 מ"ל של צפיפות בינונית מעבר הצבע התחתון של שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. להכין, תווית מספיק צינורות עבור כל גידול.
2. שכבת mL 2 של גידול התא השעיה על המדיום הדרגתיות צפיפות מאת pipetting לאט לאט במורד צינור כדי למנוע ערבוב של שתי השכבות.
3. בזהירות המקום הצינורות בשכבות צנטריפוגה, ספין בשביל 20 דקות ב 805 x g, 20 ° C, עם בלי בלמים.
   הערה: חשוב מאוד לוודא איזון נאות ולהבטיח כי בלי בלמים משמש במהלך צנטריפוגה. כל הפרעה של תהליך זה יביא שכבת ערבוב, התאוששות מלאה מדגם יהיה קשה.
4. להעביר בזהירות את הגידול שחדר ליקוציט (TIL) שכבה של השכבה העליונה מדיה לרכבת התחתית 15 mL החדש באמצעות פיפטה של העברת. למחוק את כל שאר צפיפות בינונית הדרגתיות, resuspend בגדר גידול בתחתית הצינורית ב 2 מ של RPMI-1640 שהושלם.
   הערה: לאחר צנטריפוגה יהיו ארבע השכבות הגלויות מלמעלה למטה המקבילים בהתאמה: מדיה, הפדגוגי, צפיפות בינונית הדרגתיות, גידול התא גלולה. ראה איור 2א לקבלת דוגמה של הרבדים השונים.
5. Centrifuge TIL את שניהם, דגימות הגידול ב להפריד בין צינורות (5 דקות, g x 805, 4 ° C) ולמחוק את תגובת שיקוע.
6. Resuspend המדגם TIL ב- 200 µL, בגדר גידול ב- 2 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 שהושלם. לשמור על הקרח כדי לשמר את יכולת הקיום.

3. ציפוי ולא מכתים

הערה: הזמן הדרוש ציפוי הוא s 30/גידול; הזמן הנדרש עבור צביעת משטח הוא 1 h; הזמן הנדרש עבור צביעת תאיים הוא 40 דקות; הזמן הנדרש עבור ניתוח cytometry זרימה הוא 1 - 4 דקות/גידול.

1. להכין וסופרת לוחית התווית 96-ובכן U-תחתון עבור כל החיסון צביעת לוח, צלחת נוספת עבור תא.
   הערה: בדרך כלל, שלושה לוחות מוכנים סה כ: צלחת לוח ממוקדות לימפוציט צלחת מיאלואידית ממוקד לוח, צלחת ספירת תאים.
2. Aliquot המתלים תא בודד לתוך כל ההכתמה פאנל צלחות ונפח קבועים המשקולת ספירה.
   הערה: הצלחת לספור משמש כדי לחשב את המספר הכולל של תאים יתווספו כל לוח מוכתמים, ובכך לאפשר מדויק של האוכלוסייה ספירת. Cytometer זרימה עם יכולות דיגום וניתוח volumetric צלחת 96-ובכן יכול לספק את מספר התאים לכל µL בכל מדגם, לכן, לחשב את מספר התאים שיתווספו כל לוח מכתימים. לוחות ספירת ניתן לרכוש למחרת לאחר קיבוע בין לילה ב 4 ° C, שטיפה עם FACs מאגר (buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עם 2% FBS), ו resuspending בנפח קבוע של מאגר FACs.
3. לשטוף את התאים פעמיים עם µL 200 תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עבור דגימה על-ידי צריך שתוציאו (5 דקות, 805 x g, 4 ° C) ומחיקת את תגובת שיקוע בין כל שטיפה להסרת כל FBS חינם.
4. להוסיף 50 µL של גוש Fc, לערבב את הדגימות באמצעות פיפטה רב ערוצית ולאחר תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C.
5. להוסיף 50 µL של 2 x מרוכז נוגדן מיקוד חוץ-תאית, תערובת הכתם הכדאיות ניתן לתיקון, לערבב בעזרת פיפטה רב ערוצית ולאחר תקופת דגירה של 30 דקות בחושך RT או 4 ° C.
   הערה: התנאים מכתימים המדויק הנוגדן תלויים להוראות היצרן. דילולים צביעת כל חייב להיות DPBS, עם אין FBS נוספה כדי למנוע הרוויה של לצבוע הכדאיות ניתן לתיקון. נא עיין טבלה של חומרים/ציוד דילולים אופטימלית של הפאנל מכתימים בשימוש כתב היד הזה. נוגדן ואת הכדאיות שניתן לתקן צביעת פתרון מוכן-ריכוז 2 x כדי לספק 1 הסופי x מכתים ריכוז ב 100 µL הנפח הכולל צביעת כאשר הוסיף את הבלוק Fc.
6. לשטוף את הדגימות פעמיים עם FACs מאגר מאת צריך שתוציאו (5 דקות, 805 x g, 4 ° C) ומחיקת את supernatants בין כל שטיפה.
7. Resuspend ב µL 200 1 x פיקסציה/permeabilization פתרון, דגירה בין לילה ב 4 ° C מוגן מפני אור.
   הערה: הניסוי ניתן להשהות למשך הלילה בנקודה זו: לשמור דגימות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
8. למחרת, centrifuge הלוחות (5 דקות, 805 x g, 4 ° C) וזורקים את תגובת שיקוע.
9. לשטוף פעם עם µL 200 1 x permeabilization מאגר, צנטריפוגה (5 דקות, g x 805, 4 ° C), ולמחוק את תגובת שיקוע.
10. להוסיף 100 µL 1 x נוגדן תאיים מרוכז מכתימים ' בחלונית ' מוכן במאגר permeabilization 1 x, תקופת דגירה של 30 דקות בחושך RT או 4 ° C (זה תלוי המלצות מכתימים מהיצרן).
11. שטיפה פעם עם 1 x permeabilization מאגר (5 דקות, 805 x g, 4 ° C), למחוק את תגובת שיקוע ולאחר שטיפה פעם שניה עם FACs מאגר (PBS עם 2% FBS).
12. Resuspend את הדגימות ב µL 300 FACs מאגר (PBS עם 2% FBS), להעביר את הדגימות צינורות cytometry זרימה, ולבצע ניתוח cytometry זרימה.

תוצאות

התוצאות שלנו להפגין היתרון המשמעותי של TIL ההפרדה של רכיבים שאינם-החיסון הגידול, כפי שהוסבר בפרוטוקול. בנוסף, באמצעות השיטה המתוארת נדגים את הטרוגניות אוטואימונית משמעותית של גידולים מוצקים הוקמה.

בעיה משמעותית עם טכניקות רבות של דיסוציא...

Discussion

הזמן מורכב מרכיבי התא מגוונות ומורכבות ומולקולות. ממצאים אחרונים מעידים כי אפיון מדויק של סביבה זו יכולה לספק הבנה טובה יותר של הטיפול הצלחה או כישלון, יכול אפילו לעזור לזהות את מנגנוני ההתנגדות טיפולית. לדוגמה, הגדלת רמות intratumoral של תאים שונים לדיכוי המערכת החיסונית (קרי, MDSCs, תאי T רגו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	N/A	Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line	Acquired from collaborator	N/A	E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line
70% isopropyl alcohol	EMD Milipore	PX1840
Murine surgical tool kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.
24-well plate	Denville Scientific Inc.	T1024	Or any 24-well flat bottom plate.
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R0883
Collagenase I	EMD Milipore	234153
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
DNase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Low Speed Orbital Shaker	BioExpress (supplier: Genemate)	S-3200-LS	Or any orbital shaker.
Thermoregulating incubator	Fisher Scientific	13-255-27	Or any other thermo-regulated incubator
FBS	Sigma-Aldrich	F8192
EDTA	AMRESCO	E177
1 mL Pipette and tips	Eppendorf	13-690-032	Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers	Fisher Scientific	22363547
50 mL Centrifuge Tubes	Denville Scientific Inc.	C1062-P
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific Inc.	C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles	BD	309604
Lymphoprep Density Gradient Medium	STEMCELL Technologies	7811
Transfer Pipettes	Denville Scientific Inc.	P7212
96-well U-bottom plates	Denville Scientific Inc.
DPBS	Sigma Aldrich	D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher Scientific	00-5523-00	Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For 96-well cell volumetric counting
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2	ThermoFisher Scientific	553141	Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	ThermoFisher Scientific	L34962	Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780	ThermoFisher Scientific	47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC	ThermoFisher Scientific	17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE	Santa Cruz Biotechnology	sc-53473
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700	ThermoFisher Scientific	56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450	ThermoFisher Scientific	48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC	ThermoFisher Scientific	17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE	ThermoFisher Scientific	12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	ThermoFisher Scientific	25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710	ThermoFisher Scientific	46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711	BD Biosciences	563755