Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

Riepilogo

Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.

Abstract

Microambiente tumorale immuni (tempo) recentemente è stato riconosciuto come un mediatore critico di risposta al trattamento nei tumori solidi, soprattutto per le immunoterapie. Recenti progressi clinici nell'immunoterapia evidenziano l'esigenza di metodi riproducibili caratterizzare accuratamente e completamente il tumore e suoi associati si infiltrano in immuni. Digestione enzimatica del tumore e l'analisi cytometric di flusso permettono ampia caratterizzazione di numerosi sottoinsiemi delle cellule immuni e fenotipi; Tuttavia, profondità di analisi è spesso limitata dalla fluoroforo restrizioni sul design del pannello e la necessità di acquisire campioni di grande tumore di osservare rari popolazioni immuni di interesse. Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace e ad alta produttività per la separazione e arricchendo l'infiltrato immune tumore dai componenti del tumore non immune. La digestione di tumore descritto e separazione centrifuga basati su densità tecnica permette separato caratterizzazione del tumore e tumore immuni si infiltra in frazioni e preserva la vitalità cellulare e quindi, fornisce un'ampia caratterizzazione del tumore stato immunologico. Questo metodo è stato usato per caratterizzare la vasta eterogeneità immuni spaziale nei tumori solidi, che dimostra ulteriormente la necessità di tecniche di analisi immunologiche coerente intero tumore. Nel complesso, questo metodo fornisce una tecnica efficace ed adattabile per la caratterizzazione immunologica dei tumori murini solidi sottocutanei; come tale, questo strumento può essere utilizzato per caratterizzare meglio le caratteristiche immunologiche tumorale e nella valutazione preclinica di nuove strategie immunoterapeutiche.

Introduzione

Il tempo soppressivo recentemente è stato riconosciuto come un marchio di garanzia di cancro ed è conosciuto per svolgere un ruolo significativo nello sviluppo, progressione e nella protezione dei cancri solidi del tumore così come mitigare la loro suscettibilità all'immunoterapia¹. Il tempo è composto di numerosi cellulari sottoinsiemi e fenotipi, che forniscono approfondimenti critici dello stato immunologico del tumore. Questi sottoinsiemi immunologici possono essere ulteriormente stratificati nelle cellule del linfocita o origine mieloide, che insieme costituiscono la maggior parte della risposta immunitaria innata e adattativa^2,3. I recenti progressi nel campo dell'immunoterapia del cancro hanno dimostrato che strategie di immunoterapia (cioè, gli inibitori di checkpoint immuni, recettore chimerico antigene T-cellule, ecc.) hanno il potenziale di indurre cancro durevole regressioni; Tuttavia, rimangono relativamente inefficace nel tumore solido cancri^4,5. Numerosi gruppi hanno mostrato la transenna critica che il tempo può svolgere il trattamento successo^6,7, e così, ci rimane la necessità di valutare con precisione le nuove immunoterapie in ambito pre-clinico, occupandosi in particolare del loro capacità di modulare o superare il tempo⁸.

Gli sforzi attuali per caratterizzare il tempo in genere utilizzano entrambi microscopia o flusso cytometry insieme strategie per identificare immuni cellulari sottoinsiemi e loro caratteristiche^9,10di contrassegno dell'anticorpo. Queste due strategie forniscono informazioni in modo univoco diverse, come la microscopia permette spaziale apprezzamento dei sottoinsiemi cellulare e citometria a flusso fornisce throughput elevato e più ampia quantificazione dei cambiamenti cellulari. Nonostante i recenti miglioramenti in immunoistochimica multisala fluorescente l'ottimizzazione di sistemi di imaging spettrale, che ora possono supportare fino a 7 parametri, dimensioni pannello limitato rendono vasto livello immunitario profilatura difficile e così questa tecnica è spesso riservati per più concentrata di analisi. Di conseguenza, citometria a flusso rimane uno del sistema immunitario più ampiamente usato tecniche di profilatura. Nonostante il suo uso diffuso nella caratterizzazione di tempo, i metodi utilizzati per la lavorazione e colorazione sono molto variabili. Più spesso protocolli utilizzano un tumore dissociando enzima (cioè, collagenasi, DNasi, ecc.) e metodi di dissociazione manuale per raggiungere sospensioni unicellulari, seguita da anticorpo che macchia e analisi⁷. Nonostante i vantaggi di ciascun metodo, numerosi gruppi hanno dimostrato la notevole variabilità che può essere indotta attraverso queste tecniche¹¹. Questo rende la croce-Studio comparazioni di profilatura di microambiente del tumore estremamente difficile, anche quando valutare lo stesso modello di tumore murino. Inoltre, questi metodi forniscono un potenziale limitato per valutare il tumore cellulare e immunitaria tumore infiltrarsi componenti in modo indipendente, dal momento che entrambi i componenti sono sparpagliati dopo la digestione. Quantità di campione limita quindi multi-pannello di colorazione e di analisi, che diventa un grosso problema durante il tentativo di caratterizzare sottoinsiemi immunologiche rare (cioè, tumore-specifiche cellule T)¹². Tecniche più recenti come massa cytometry, o citometria a tempo di volo (CyTOF), permettono di alto-dimensionali analisi fenotipica di sottopopolazioni cellulari con alcuni sistemi di supporto disegni pannello superiore a 42 parametri indipendenti¹³. Nonostante l'enorme potenza di tecnologia CyTOF in profilatura immuni, resta limitato a causa di spese, competenze di analisi e l'accesso all'apparecchiatura. Inoltre, molti protocolli di CyTOF consiglia di purificazione dei sottoinsiemi immuni per migliorare i rapporti segnale-rumore¹⁴, e quindi suggeriamo che il nostro metodo di arricchimento poteva essere utilizzato a monte dell'analisi CyTOF per migliorare la qualità dei dati.

Qui descriviamo una digestione microambiente del tumore e analisi metodo che incorpora immunitaria tumore infiltrarsi separazione. Lo scopo di questo metodo è quello di consentire indipendente high throughput profilatura del si infiltra in sistema immunitario in tumore e frazioni cellulari del tumore per la più ampia caratterizzazione del microambiente tumorale. Utilizzando questo metodo, noi dimostrare ulteriormente l'importanza di eseguire analisi di intero tumore, come un modello di tumore solido sottocutaneo è stato trovato per avere significativa eterogeneità spaziale immunologica. Nel complesso, questo metodo può più accuratamente e costantemente confrontare tra campioni perché arricchisce per sottoinsiemi immuni cellulari all'interno del tumore e permette per la profilatura indipendente delle cellule del tumore e frazioni immunitarie di un tumore.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine.

1. digestione e raccolto tumore

Nota: Il tempo richiesto per il raccolto è ~ 3-5 min/tumore e il tempo necessario per l'elaborazione è ~ 1 h + 2-3 min/tumore.

1. Eutanasia di topi per inalazione di anidride carbonica e spray ogni mouse giù con etanolo al 70% prima della raccolta per evitare la contaminazione di capelli. Chirurgicamente rimuovere tumori sottocutanei dai topi e garantire che i tumori sono privi di qualsiasi tessuto contaminante (cioè, capelli, pelle, peritoneo, ecc.). Posizionare ogni tumore in 1,8 mL di base RPMI-1640 media senza siero bovino fetale (FBS) in una piastra a 24 pozzetti. Per raccolti più abbondanti, mantenere piastre fredde sul ghiaccio per preservare la vitalità cellulare.
   Nota: Se è richiesta la sterilità, necessario essere eseguita in una cappa di biosicurezza con strumenti chirurgici sterili (cioè, forbici, pinze, ecc.), come pure qualsiasi ulteriore procedura tutte le dissezioni di tumore. I tumori con il diametro più lungo tra 0,5 - 1 cm sono ottimali, e tumori maggiori o minori richiederanno ridimensionamento dei reagenti.
2. Usare le forbici per tagliare i tumori in meno di 1 mm³ pezzi all'interno di ciascun pozzetto.
3. Preparate un 10 x cocktail di digestione sciogliendo collagenosi sono a 10 mg/mL, collagenasi IV a 2.500 U/mL e dnasi I a 200 U/mL in base RPMI-1640 media (senza FBS).
   Nota: La digestione cocktail può essere preparata un giorno in anticipo e conservata a-20 ° C; Tuttavia, una conservazione prolungata non è raccomandata come enzimi perderà l'attività nel corso del tempo una volta sciolto.
4. Aggiungere 200 µ l di 10 x cocktail di dissociazione contenente collagenasi I, IV collagenosi e dnasi I per ciascun pozzetto con il mm 1³ pezzi.
5. Consentire ai campioni di digerire per 1h a 37 ° C agitando leggermente a 60-100 rpm usando un agitatore orbitale.
   Nota: L'elevazione della temperatura a 37 ° C durante la digestione enzimatica può causare l'attivazione delle cellule immuni.
6. Dopo 1 h, neutralizzare la reazione aggiungendo 1 mL di terreno RPMI-1640 completati con 5% FBS e 2 mM EDTA in ciascun pozzetto.
7. In un colino di cella di 40 µm seduto sulla cima di un tubo di centrifuga da 50 mL, pipettare la digestione di tumore e i restanti pezzi di tumore.
   Nota: Tagliare la punta al largo di punta di una pipetta da 1 mL per il trasferimento più facile della digestione tumore al filtro.
8. Utilizzare un pistone della siringa da 10 mL per disaggregare meccanicamente i pezzi del tumore attraverso il colino. Sciacquare periodicamente il filtro con 2 mL di completati RPMI-1640 media (contenente 5% FBS) e ripetere fino a quando il filtro cella è chiaro del tumore.
   Nota: 4-10 mL circa di media totale dovrebbe essere sufficiente adeguatamente sciacquare il filtro del tumore.
   Nota: Posizionare il campione sul ghiaccio fino al completamento di questo passaggio per tutti i campioni preservare la vitalità cellulare.
9. Regolare ogni 50 mL provetta dello stesso volume utilizzando il supporto di RPMI-1640 completato.
   Nota: La regolazione del volume è fondamentale per il bilanciamento della centrifuga. Saltare questo passaggio potrebbe provocare lesioni personali o danni della centrifuga.
10. Centrifugare le sospensioni delle cellule (5 min, 805 x g, 4 ° C), eliminare i sovranatante e risospendere in 2 mL di completati RPMI-1640 media.
    Nota: Un aggregato di cellule può formare dopo la centrifugazione che è difficile risospendere. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 mL e mescolare velocemente per rompere in su prima di procedere.

2. separazione delle frazioni cellulari del tumore e immunitario

Nota: Il tempo necessario per questo passaggio è circa 1 h.

1. Aggiungere 3 mL di terreno di gradienti di densità sul fondo di una provetta da centrifuga da 15 mL. Preparare ed etichettare il numero necessario di provette per ogni tumore.
2. Strato da 2 mL di sospensione cellulare del tumore in cima il mezzo di gradienti di densità pipettando lentamente lungo il lato del tubo per evitare la miscelazione dei due strati.
3. Posizionare i tubi a più livelli nella centrifuga e spin per 20 min a 805 x g, 20 ° C, con freno non.
   Nota: È estremamente importante verificare il corretto bilanciamento e assicurarsi che nessun freno viene utilizzato durante la centrifugazione. Qualsiasi interruzione di questo processo si tradurrà in strato di miscelazione e il recupero completo del campione sarà difficile.
4. Trasferire con cautela il tumore infiltrante del leucocita (TIL) strato e lo strato superiore media ad un nuovo tubo da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento. Eliminare tutti i rimanenti densità gradiente terreno e risospendere il pellet di tumore nella parte inferiore del tubo in 2 mL di RPMI-1640 completati.
   Nota: Dopo la centrifugazione ci saranno quattro livelli visibili dall'alto verso il basso che corrispondono rispettivamente a: media, TILs, densità gradiente medio e pellet cellulare del tumore. Vedere la Figura 2A per un esempio dei vari strati.
5. Centrifugare l'entrambi TIL e campioni di tumore in separano tubi (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il surnatante.
6. Risospendere il campione TIL in 200 µ l e il pellet di tumore in 2 mL di completati RPMI-1640 media. Tenere sul ghiaccio per preservare la vitalità.

3. placcatura e colorazione

Nota: Il tempo richiesto per la placcatura è 30 s/tumore; il tempo richiesto per la marcatura di superficie è 1h; il tempo necessario per la colorazione intracellulare è 40 min; il tempo necessario per l'analisi di citometria a flusso è 1 - 4 min/tumore.

1. Preparare e conta di targhetta di identificazione un fondo U 96 pozzetti per ogni immunitario macchiatura pannello e una targhetta supplementare per cella.
   Nota: In genere, tre piatti sono preparati in totale: un concentrato del linfocita pannello piatto, un piatto di pannello mieloide-messa a fuoco e un piatto di conteggio delle cellule.
2. Aliquotare le sospensioni unicellulari in ciascuna della colorazione pannello piastre e un volume impostato nella piastra del conteggio.
   Nota: La piastra di conteggio viene utilizzata per calcolare il numero totale di celle aggiunte ad ogni pannello di colorazione, consentendo in tal modo i conteggi delle cellule accurata della popolazione. Un citometro a flusso con capacità di campionamento e analisi volumetrica di piastra a 96 pozzetti può fornire il numero di cellule per µ l di ciascun campione e quindi, calcolare il numero di celle aggiunte ad ogni pannello di colorazione. Piastre di conteggio possono essere acquistati il giorno seguente dopo la fissazione durante la notte a 4 ° C, risciacquo con buffer di FACs (tampone fosfato salino (PBS) con 2% FBS) e risospendere in un volume di tampone di FACs.
3. Lavare le cellule due volte con 200 µ l di soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) per campione di centrifugazione (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il supernatante tra ogni risciacquo per rimuovere qualsiasi FBS gratis.
4. Aggiungere 50 µ l di blocco Fc, mescolare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e incubare per 20 min a 4 ° C.
5. Aggiungere 50 µ l di 2x concentrato anticorpo targeting extracellulare e attuabilità risolvibile macchia miscela, mescolare utilizzando una pipetta multicanale ed incubare per 30 min al buio a RT o 4 ° C.
   Nota: Le esatte condizioni che macchia per l'anticorpo dipendono le istruzioni del produttore. Tutte le diluizioni di colorazione devono essere in DPBS, con nessun FBS aggiunto per evitare la saturazione della tintura attuabilità risolvibile. Si prega di consultare la Tabella dei materiali/attrezzature per le diluizioni ottimale del pannello di colorazione utilizzata in questo manoscritto. Dell'anticorpo e risolvibile vitalità colorazione soluzione è preparato ad una concentrazione di 2 x per fornire un finale 1 x colorazione concentrazione in 100 µ l di volume totale colorazione quando aggiunto al blocco Fc.
6. Lavare i campioni due volte con tampone di FACs centrifugazione (5 min, 805 x g, 4 ° C) ed eliminando i surnatanti tra ogni risciacquo.
7. Risospendere in 200 µ l di soluzione di fissazione/permeabilizzazione 1x e incubare per una notte a 4 ° C al riparo dalla luce.
   Nota: L'esperimento può essere messo in pausa durante la notte a questo punto: conservare i campioni a 4 ° C al riparo dalla luce.
8. Il giorno seguente, centrifugare le piastre (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il surnatante.
9. Sciacquare una volta con 200 µ l di tampone di permeabilizzazione, centrifugare (5 min, 805 x g, 4 ° C), 1x e scartare il surnatante.
10. Aggiungere 100 µ l di 1 pannello colorazione x anticorpo intracellulare concentrato preparato in tampone di permeabilizzazione 1x e incubare per 30 min al buio a RT o a 4 ° C (questo dipende dalla colorazione consigli dal produttore).
11. Sciacquare una volta con permeabilizzazione 1x buffer (5 min, 805 x g, 4 ° C), scartare il surnatante e risciacquare una seconda volta con buffer di FACs (PBS con 2% FBS).
12. Risospendere i campioni a 300 µ l di tampone di FACs (PBS con 2% FBS), trasferire i campioni a tubi di flusso cytometry ed eseguire analisi di citometria a flusso.

Risultati

I nostri risultati dimostrano il beneficio significativo di TIL separazione da componenti del tumore non immune, come spiegato nel protocollo. Inoltre, utilizzando il metodo descritto dimostriamo la significativa eterogeneità immunologica dei tumori solidi stabiliti.

Un problema significativo con molte tecniche di dissociazione del tumore è la perdita di vitalità del campione, più spesso a causa delle condizioni difficili di...

Discussione

Il tempo è composto di molecole e componenti cellulari diversi e complessi. La prova recente suggerisce che accurata caratterizzazione di questo ambiente in grado di fornire una migliore comprensione del trattamento esito positivo o negativo e può anche aiutare a identificare i meccanismi di resistenza terapeutica. Ad esempio, aumentando i livelli di intratumoral di varie cellule immunosoppressive (cioè, MDSC, cellule T regolatorie, ecc.) possa attenuare le risposte immunitarie effettrici ed abrogare...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	N/A	Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line	Acquired from collaborator	N/A	E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line
70% isopropyl alcohol	EMD Milipore	PX1840
Murine surgical tool kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.
24-well plate	Denville Scientific Inc.	T1024	Or any 24-well flat bottom plate.
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R0883
Collagenase I	EMD Milipore	234153
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
DNase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Low Speed Orbital Shaker	BioExpress (supplier: Genemate)	S-3200-LS	Or any orbital shaker.
Thermoregulating incubator	Fisher Scientific	13-255-27	Or any other thermo-regulated incubator
FBS	Sigma-Aldrich	F8192
EDTA	AMRESCO	E177
1 mL Pipette and tips	Eppendorf	13-690-032	Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers	Fisher Scientific	22363547
50 mL Centrifuge Tubes	Denville Scientific Inc.	C1062-P
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific Inc.	C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles	BD	309604
Lymphoprep Density Gradient Medium	STEMCELL Technologies	7811
Transfer Pipettes	Denville Scientific Inc.	P7212
96-well U-bottom plates	Denville Scientific Inc.
DPBS	Sigma Aldrich	D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher Scientific	00-5523-00	Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For 96-well cell volumetric counting
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2	ThermoFisher Scientific	553141	Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	ThermoFisher Scientific	L34962	Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780	ThermoFisher Scientific	47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC	ThermoFisher Scientific	17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE	Santa Cruz Biotechnology	sc-53473
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700	ThermoFisher Scientific	56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450	ThermoFisher Scientific	48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC	ThermoFisher Scientific	17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE	ThermoFisher Scientific	12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	ThermoFisher Scientific	25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710	ThermoFisher Scientific	46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711	BD Biosciences	563755