Enriquecimiento y caracterización de los microambientes Tumor inmunes y no inmunes en tumores murinos subcutáneos establecidos

Resumen

Aquí se describe un método para separar y enriquecer los componentes del microambiente tumoral inmune y no inmune en tumores subcutáneos establecidos. Esta técnica permite el análisis separado de infiltrado inmune tumor y fracciones de tumor no inmune que pueden permitir una caracterización completa del microambiente tumoral inmune.

Resumen

El microambiente inmunológico del tumor (tiempo) se ha reconocido recientemente como un mediador crítico de la respuesta al tratamiento en tumores sólidos, especialmente para las inmunoterapias. Últimos avances clínicos en inmunoterapia destacan la necesidad de métodos reproducibles con precisión y completamente caracterizar el tumor y su infiltrado inmune asociada. Digestión enzimática del tumor y análisis cytometric del flujo permiten amplia caracterización de varios subconjuntos de células inmunitarias y fenotipos; sin embargo, profundidad del análisis a menudo está limitada por restricciones de fluoróforo en diseño del panel y la necesidad de adquirir muestras de tumor grande observar raras poblaciones inmunes de interés. Así, hemos desarrollado un método eficaz y alto rendimiento de separación y de enriquecer el infiltrado inmune del tumor de los componentes del tumor no inmunes. La digestión de tumor descrito y separación centrífuga de densidad permite caracterización independiente de tumor y el tumor fracciones infiltrado inmune y preserva la viabilidad celular y por lo tanto, proporciona una amplia caracterización del tumor estado inmunológico. Este método fue utilizado para caracterizar la heterogeneidad inmune espacial amplia en tumores sólidos, que demuestra la necesidad de técnicas perfiles inmunológicos tumor entero coherente. En general, este método proporciona una técnica eficaz y adaptable para la caracterización inmunológica de tumores murinos sólidos subcutáneos; como tal, esta herramienta puede utilizarse para caracterizar mejor las características inmunológicas tumorales y en la evaluación preclínica de nuevos estrategias de inmunoterapia.

Introducción

El momento represivo ha sido recientemente reconocido como un sello distintivo del cáncer y se sabe que juega un papel importante en el desarrollo, progresión y protección de los cánceres de tumor sólido así como reducir su susceptibilidad a la inmunoterapia¹. El tiempo se compone de numerosos subconjuntos celulares y fenotipos, que proporcionan una visión crítica del estado inmunológico del tumor. Estos subconjuntos inmunológicos pueden ser estratificados más en células de origen mieloide, o linfocitos que juntos constituyen la mayoría de las respuestas inmunitarias innata y adaptativa^2,3. Los avances recientes en el campo de la inmunoterapia de cáncer han demostrado que estrategias de inmunoterapia (es decir, los inhibidores de control inmune, receptor del antígeno quimérico de las células T, etc.) tienen el potencial para inducir cáncer durable regresiones; sin embargo, siguen siendo relativamente ineficaz en cánceres de tumor sólido^4,5. Numerosos grupos han mostrado el obstáculo fundamental que puede jugar en el tiempo en tratamiento éxito^6,7, y por lo tanto, existe una necesidad de evaluar con precisión nuevas inmunoterapias en el ajuste pre-clínico centrándose específicamente en su capacidad de modular o superar el tiempo⁸.

Los esfuerzos actuales para caracterizar el tiempo típicamente utilizan cualquiera microscopia o fluyen cytometry junto con anticuerpo etiquetado estrategias para identificar subconjuntos celulares inmunes y sus características^9,10. Estas dos estrategias proporcionan únicamente información, como microscopía permite apreciación espacial de subconjuntos celulares y citometría de flujo proporciona alto rendimiento y cuantificación más amplio de los cambios celulares. A pesar de las mejoras recientes en inmunohistoquímica multiplex fluorescente optimizando los sistemas de proyección de imagen espectrales, que ahora pueden soportar hasta 7 parámetros, tamaño del panel limitado dificulta amplio nivel inmune perfiles y por lo tanto esta técnica es a menudo reservado para más centrado el análisis. Como resultado, citometría de flujo sigue siendo uno de inmune más utilizada técnicas de perfiles. A pesar de su uso generalizado en la caracterización del tiempo, los métodos utilizados para el procesamiento y coloración son muy variable. Más a menudo los protocolos utilizan un tumor disociación enzimática (es decir, colagenasas, ADNasa, etc.) y métodos de disociación manual para lograr suspensiones unicelular, seguida de anticuerpos de tinción y análisis⁷. A pesar de las ventajas de cada método, numerosos grupos han demostrado la amplia variabilidad que puede ser inducida a través de estas técnicas¹¹. Esto hace comparaciones Cruz-estudio de perfiles de microambiente del tumor extremadamente difícil, incluso al evaluar el mismo modelo tumoral murino. Además, estos métodos proporcionan un potencial limitado para evaluar tumor celular e inmune tumor infiltra componentes independientemente, puesto que ambos componentes se entremezclan después de la digestión. Entonces límites de cantidad de muestra varios paneles de tinción y análisis, que se convierte en un problema de importancia cuando se intenta caracterizar subconjuntos inmunológicos raros (tumor-específicas, es decir, las células T)¹². Técnicas más recientes como la citometría de masas o citometría por tiempo de vuelo (CyTOF), permiten análisis fenotípico multidimensional de subconjuntos celulares con algunos sistemas de apoyo a diseños de panel de más de 42 parámetros independientes¹³. A pesar del tremendo poder de CyTOF tecnología en perfiles inmune, sigue siendo limitada debido a los gastos, conocimientos de análisis y el acceso al equipo. Además, muchos protocolos CyTOF recomiendan purificación de inmunes subconjuntos para mejorar cocientes signal-to-noise¹⁴, y por lo tanto sugerimos que se podría utilizar nuestro método de enriquecimiento de CyTOF análisis para mejorar la calidad de los datos.

Adjunto describimos un análisis método que incorpora a inmune tumor infiltra la separación y digestión de microambiente del tumor. El propósito de este método es permitir perfiles de alto rendimiento independiente del infiltrado inmune tumor y fracciones celulares de tumor para una caracterización más amplia del microambiente tumoral. Usando este método, más demostramos la importancia de realizar análisis de todo tumor, como un modelo de tumor sólido subcutáneo fue encontrado para tener heterogeneidad inmunológica espacial significativa. En general, este método puede más exactamente y constantemente comparar entre muestras porque se enriquece en un subgrupo celular inmune dentro del tumor y permite perfiles independientes de la célula tumoral y fracciones inmunes de un tumor.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Baylor College of Medicine.

1. digestión y la cosecha tumor

Nota: El tiempo requerido para la cosecha es ~ 3-5 min/tumor y el tiempo requerido para el procesamiento de es ~ 1 h + 2-3 min/tumor.

1. Eutanasia a ratones por la inhalación de dióxido de carbono y rocíe cada ratón abajo con etanol al 70% antes de la cosecha para evitar la contaminación del cabello. Quirúrgicamente quitar tumores subcutáneos de los ratones y asegúrese de que los tumores estén libres de cualquier contaminante del tejido (es decir, pelo, piel, peritoneo, etc.). Coloque cada tumor en 1,8 mL de base medios RPMI-1640 sin suero fetal bovino (FBS) en una placa de 24 pozos. Para las cosechas más grandes, mantener las placas frías sobre hielo para preservar la viabilidad celular.
   Nota: Si la esterilidad es necesaria, todas las disecciones tumor tendrá que realizarse en un gabinete con instrumentos quirúrgicos estériles (es decir, tijeras, pinzas, etc.), así como cualquier otras medidas de bioseguridad. Tumores con el diámetro más largo entre 0.5 - 1 cm son óptimos, y los tumores más grandes o más pequeños requerirá escala de reactivos.
2. Utilice tijeras para cortar los tumores menos de 1 mm³ piezas de cada pozo.
3. Preparar un 10 x digestión cóctel disolviendo colagenasa en 10 mg/mL, colagenasa IV en 2.500 U/mL y DNasa I en 200 U/mL de base medios RPMI-1640 (sin equipos).
   Nota: La digestión cóctel puede ser preparada un día de antelación y almacenada a-20 ° C; sin embargo, un almacenamiento prolongado no se recomienda que las enzimas pierden actividad con el tiempo una vez disuelto.
4. Añadir 200 μL de 10 x Cóctel de disociación que contienen colagenasa I, colagenasa IV y DNasa I para cada pozo con los trozos de 1 mm³ .
5. Permita que las muestras a digerir por 1 h a 37 º C agitando ligeramente a 60-100 rpm usando un agitador de placa orbital.
   Nota: La elevación de la temperatura a 37 ° C durante la digestión enzimática puede causar activación inmune de la célula.
6. Después de 1 h, neutralizar la reacción mediante la adición de 1 mL de Medio RPMI-1640 suplementado con 5% FBS y 2 mM EDTA a cada pocillo.
7. Pipetear la digestión del tumor y las piezas restantes del tumor en un tamiz de 40 μm celular sentado encima de un tubo de centrífuga de 50 mL.
   Nota: Cortar la punta de una pipeta de 1 mL para transferir más fácil la digestión del tumor a la coladera.
8. Utilice un émbolo de la jeringa de 10 mL para separar mecánicamente las piezas tumor a través de la coladera. Periódicamente enjuague el filtro con 2 mL de Medio RPMI-1640 suplementado (que contiene 5% SBF) y repita hasta que el filtro de la celda esté libre de tumor.
   Nota: Aproximadamente 4-10 mL de medio total debe ser suficiente para limpiar adecuadamente el filtro del tumor.
   Nota: Coloque las muestras en hielo hasta que se complete este paso para que todas las muestras preservar la viabilidad celular.
9. Ajustar cada tubo de centrífuga de 50 mL para el mismo volumen utilizando los medios RPMI-1640 suplementados.
   Nota: El ajuste de volumen es crítico para el equilibrio de la centrífuga. Saltarse este paso podría resultar en la centrifugadora daños o lesiones personales.
10. Centrifugar la suspensión celular (805 x g, 5 min, 4 ° C), desechar el sobrenadante y resuspender en 2 mL de Medio RPMI-1640 suplementado.
    Nota: Se puede formar un agregado celular después de la centrifugación que es difícil de volver a suspender. Utilice una pipeta serológica de 5 mL y mezclar rápidamente para romper antes de proceder.

2. separación de fracciones celulares inmunes y Tumor

Nota: El tiempo necesario para este paso es aproximadamente de 1 h.

1. Añadir 3 mL de medio de gradiente de densidad en la parte inferior de un tubo de centrífuga de 15 mL. Prepare y etiquete suficientes tubos para cada tumor.
2. Los 2 mL de suspensión de células de tumor en la parte superior del medio de gradiente de densidad de la capa transfiriendo poco a poco hacia el lado del tubo para evitar la mezcla de las dos capas.
3. Coloque cuidadosamente los tubos de capas en la centrifugadora y vuelta por 20 min a x g 805, 20 ° C, con ningún freno.
   Nota: Es muy importante verificar el equilibrio adecuado y asegurarse de que no hay freno se utiliza durante la centrifugación. Cualquier interrupción de este proceso resultará en la capa de mezcla y la recuperación completa de la muestra va a ser difícil.
4. Transferir cuidadosamente el tumor infiltración leucocitaria (TIL) capa y la capa superior a un nuevo tubo de 15 mL con una pipeta de transferencia. Deseche todo medio de gradiente de densidad restante y resuspender el precipitado de tumor en la parte inferior del tubo 2 ml de RPMI-1640 suplementado.
   Nota: Después de la centrifugación habrá cuatro capas visibles desde la parte superior a inferior que corresponden respectivamente a: los medios de comunicación, TILs, medio de gradiente de densidad y precipitado de células del tumor. Vea la figura 2A un ejemplo de las distintas capas.
5. Tanto el TIL de centrífuga y muestras tumorales en tubos (5 min, 805 x g, 4 º C) y descarte el sobrenadante.
6. Resuspender la muestra hasta 200 μl y la pelotilla del tumor en 2 mL de Medio RPMI-1640 suplementado. Mantenga en hielo para preservar la viabilidad.

3. galjanoplastia y la coloración

Nota: El tiempo necesario para la galjanoplastia es 30 s, tumor; el tiempo necesario para la tinción de la superficie es de 1 h; el tiempo necesario para la tinción intracelular es de 40 minutos; el tiempo necesario para el análisis de citometría de flujo es de 1 - 4 min, tumor.

1. Preparar y cuenta con placa de etiqueta un fondo U de 96 pocillos para cada inmune coloración panel y una placa adicional para celular.
   Nota: Por lo general, tres platos se preparan en total: una placa panel centrado de linfocitos, una placa de panel mieloide centrado y una placa de recuento celular.
2. Las suspensiones unicelular en cada uno de la tinción alícuota panel de placas y un volumen del sistema en la placa de recuento.
   Nota: La placa de la cuenta se utiliza para calcular el número total de células a cada panel de tinción, permitiendo que preciso recuento de población. Un citómetro de flujo con capacidades de muestreo y análisis volumétrico de placa de 96 pocillos puede proporcionar el número de células por μl de cada muestra y por lo tanto, calcular el número de células a cada panel de tinción. Las placas de recuento se pueden adquirir al día siguiente después de la fijación durante la noche a 4 ° C, lavado con tampón FACs (tampón de fosfato salino (PBS) con 2% SBF) y resuspender en un volumen de tampón FACs.
3. Lavan las células dos veces con 200 μL de tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS) por muestra por centrifugación (5 min, 805 x g, 4 º C) y descartar el sobrenadante entre cada enjuague para remover cualquier FBS gratis.
4. Agregar 50 μl del bloque Fc, mezclar las muestras con una pipeta multicanal e incubar por 20 min a 4 ° C.
5. Añadir 50 μl de 2 x concentración extracelular anticuerpos dirigidos a mezcla de tinción de viabilidad fijable, se mezclan y usando una pipeta multicanal, incubar por 30 min en la oscuridad a RT o 4 ° C.
   Nota: Las condiciones exactas de la tinción para el anticuerpo dependen de las instrucciones del fabricante. Todas las diluciones de tinción deben estar en DPBS, con no FBS añadido para evitar la saturación del colorante de viabilidad pueden corregir. Consulte la Tabla de materiales y equipos para las diluciones óptimas del panel tinción utilizada en este manuscrito. Fijable viabilidad solución de tinción y el anticuerpo es preparado en una concentración de 2 x para proporcionar un final 1 x tinción concentración en 100 μl de volumen total de la coloración cuando se agrega al bloque de Fc.
6. Lavar las muestras dos veces con tampón FACs por centrifugación (5 min, 805 x g, 4 º C) y descartar los sobrenadantes entre cada enjuague.
7. Resuspender en 200 μL de solución de fijación/permeabilización 1 x e incubar durante la noche a 4 ° C protegido de la luz.
   Nota: El experimento puede hacer una pausa durante la noche en este punto: mantener las muestras a 4 ° C protegido de la luz.
8. Al día siguiente, Centrifugue las placas (805 x g, 5 min, 4 ° C) y descarte el sobrenadante.
9. Enjuague una vez con 200 μL de 1 x de buffer de permeabilización, centrífuga (5 min, 805 x g, 4 º C) y descarte el sobrenadante.
10. Añadir 100 μl de 1 x concentrado anticuerpo intracelular tinción panel preparado en buffer de permeabilización de 1 x e incubar durante 30 min en la oscuridad a RT o 4 ° C (esto depende de la tinción las recomendaciones del fabricante).
11. Enjuague una vez con permeabilización 1 x buffer (5 min, 805 x g, 4 º C), desechar el sobrenadante y enjuague una segunda vez con tampón FACs (PBS con 2% FBS).
12. Resuspender las muestras en 300 μL de tampón FACs (PBS con 2% SBF), transferir las muestras a tubos de citometría de flujo y realizar análisis de citometría de flujo.

Resultados

Nuestros resultados demuestran un beneficio significativo de hasta la separación de los componentes del tumor no inmune, como se explica en el protocolo. Además, usando el método descrito demuestran la heterogeneidad inmunológica significativa de tumores sólidos establecidos.

Un problema importante con muchas técnicas de disociación de tumor es la pérdida de la viabilidad de la muestra, más a menudo como resultado de la...

Discusión

El tiempo se compone de moléculas y componentes celulares diversos y complejos. La evidencia reciente sugiere que una caracterización precisa de este entorno puede proporcionar una mejor comprensión del tratamiento de éxito o fracaso y puede incluso ayudar a identificar mecanismos de resistencia terapéutica. Por ejemplo, aumentando los niveles de intratumoral de varias células inmunosupresoras (es decir, MDSCs, células de T reguladoras, etc.) puede atenuar la respuesta inmune efectora y derogar e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	N/A	Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line	Acquired from collaborator	N/A	E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line
70% isopropyl alcohol	EMD Milipore	PX1840
Murine surgical tool kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.
24-well plate	Denville Scientific Inc.	T1024	Or any 24-well flat bottom plate.
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R0883
Collagenase I	EMD Milipore	234153
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
DNase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Low Speed Orbital Shaker	BioExpress (supplier: Genemate)	S-3200-LS	Or any orbital shaker.
Thermoregulating incubator	Fisher Scientific	13-255-27	Or any other thermo-regulated incubator
FBS	Sigma-Aldrich	F8192
EDTA	AMRESCO	E177
1 mL Pipette and tips	Eppendorf	13-690-032	Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers	Fisher Scientific	22363547
50 mL Centrifuge Tubes	Denville Scientific Inc.	C1062-P
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific Inc.	C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles	BD	309604
Lymphoprep Density Gradient Medium	STEMCELL Technologies	7811
Transfer Pipettes	Denville Scientific Inc.	P7212
96-well U-bottom plates	Denville Scientific Inc.
DPBS	Sigma Aldrich	D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher Scientific	00-5523-00	Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For 96-well cell volumetric counting
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2	ThermoFisher Scientific	553141	Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	ThermoFisher Scientific	L34962	Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780	ThermoFisher Scientific	47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC	ThermoFisher Scientific	17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE	Santa Cruz Biotechnology	sc-53473
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700	ThermoFisher Scientific	56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450	ThermoFisher Scientific	48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC	ThermoFisher Scientific	17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE	ThermoFisher Scientific	12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	ThermoFisher Scientific	25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710	ThermoFisher Scientific	46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711	BD Biosciences	563755