Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

Resumo

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Resumo

O microambiente imune tumor (tempo), recentemente, tem sido reconhecida como um mediador crítico da resposta do tratamento em tumores sólidos, especialmente para imunoterapias. Recentes avanços clínicos em imunoterapia destacam a necessidade de métodos pode ser reproduzidos com precisão e completamente caracterizar o tumor e seu associado infiltrado imune. Digestão enzimática do tumor e análise do fluxo cytometric permitam ampla caracterização dos vários subconjuntos de células imunes e fenótipos; no entanto, profundidade de análise muitas vezes é limitada pela fluoróforo restrições no projeto do painel e a necessidade de adquirir amostras de tumor grande observar raras populações imunes de interesse. Assim, nós desenvolvemos um método eficaz e alta taxa de transferência para separar e enriquecendo o infiltrado imune tumor dos componentes não imune tumor. A digestão de tumor descrito e separação centrífuga baseado em densidade técnica permite separada caracterização do tumor e tumor infiltrar imune fracções e preserva a viabilidade celular e assim, fornece uma ampla caracterização do tumor estado imunológico. Este método foi usado para caracterizar extensa espacial imune heterogeneidade em tumores sólidos, que demonstra ainda mais a necessidade de técnicas de perfil imunológica de tumor todo consistente. Em geral, esse método proporciona uma técnica eficaz e adaptável para a caracterização imunológica do subcutâneos tumores sólidos de murino; como tal, esta ferramenta pode ser usada para melhor caracterizar as características imunológicas tumorais e na avaliação pré-clínica de novas estratégias de imunoterapia.

Introdução

O tempo supressivo recentemente tem sido reconhecido como uma marca registrada de câncer e é conhecido por desempenhar um papel significativo no desenvolvimento e progressão, proteção de cânceres de tumor sólido, bem como atenuar sua susceptibilidade à imunoterapia¹. O tempo é composto por vários subconjuntos celulares e fenótipos, os quais fornecem a introspecção crítica do estado imunológico do tumor. Estes subconjuntos imunológicos podem ser ainda mais estratificados em células de origem mieloide, ou linfócitos, que juntos constituem a maioria das respostas de imune inata e adaptativa^2,3. Recentes avanços no campo da imunoterapia têm demonstrado que as estratégias de imunoterapia (i.e., inibidores da barreira imune, receptor de antígeno quimérico células-T, etc.) têm o potencial para induzir câncer durável regressões; no entanto, eles permanecem relativamente ineficazes em tumores sólidos cancros^4,5. Numerosos grupos mostraram o obstáculo crítico que o tempo pode jogar no tratamento sucesso^6,7, e ainda assim, há uma necessidade de avaliar com precisão novas imunoterapias no cenário pré-clínico enfocando especificamente seus capacidade de modular ou superar o tempo⁸.

Os esforços atuais para caracterizar o tempo normalmente utilizam ou microscopia ou fluem cytometry juntamente com anticorpo rotulagem estratégias para identificar subconjuntos de celulares imunes e suas características^9,10. Estas duas estratégias fornecem informações excepcionalmente diferentes, como microscopia permite valorização espacial de subconjuntos de celulares e citometria de fluxo fornece alto rendimento e quantificação mais ampla de mudanças celulares. Apesar das recentes melhorias no multiplex fluorescente imuno-histoquímica otimizando sistemas de imagem espectrais, que agora podem suportar até 7 parâmetros, tamanho limitado do painel torna nível mais amplo imune de perfil difícil e, portanto, esta técnica é frequentemente reservados para mais focada análises. Como resultado, citometria de fluxo permanece um do mais amplamente utilizado imunológico técnicas de criação de perfil. Apesar de seu uso generalizado na caracterização do tempo, os métodos utilizados para processamento e coloração são bastante variável. Mais frequentemente protocolos utilizam um tumor dissociando enzima (ou seja, colagenases, DNase, etc.) e métodos de dissociação manual para atingir as suspensões de célula única, seguido por anticorpo manchando e análise⁷. Apesar dos benefícios de cada método, numerosos grupos mostraram a extensa variabilidade que pode ser induzida através destas técnicas¹¹. Isto faz comparações de estudo transversal de tumor microambiente perfil extremamente difícil, mesmo quando avaliar o mesmo modelo de tumor murino. Além disso, esses métodos fornecem um potencial limitado para avaliar tumor celular e imunológico tumor infiltrar componentes independente, desde que ambos os componentes são intercalados após a digestão. Quantidade de amostra então limita multi-painel manchando e análise, que se torna um grande problema ao tentar caracterizar subconjuntos imunológicos raros (i.e., tumor-específicas células T)¹². Técnicas mais recentes como citometria de massa ou citometria por hora de voo (CyTOF), permitem alta dimensão análise fenotípica de subconjuntos de celulares com alguns sistemas de apoio a projetos de painel superior a 42 parâmetros independente¹³. Apesar do enorme poder da CyTOF tecnologia em perfil imune, continua a ser limitada devido a despesa, conhecimentos de análise e o acesso ao equipamento. Além disso, muitos protocolos de CyTOF recomendam purificação de subconjuntos imunes para melhorar a relação sinal-ruído¹⁴, e, assim, sugerimos que o nosso método de enriquecimento poderia ser usado a montante da análise CyTOF para melhorar a qualidade dos dados.

Neste documento descrevemos uma digestão de microambiente do tumor e análise método que incorpora imune tumor infiltrar na separação. A finalidade desse método é permitir que independente da elevado-produção de perfil do infiltrado imune tumor e frações celulares do tumor para caracterização mais ampla do microambiente do tumor. Usando esse método, demonstramos ainda mais a importância da realização de análises de todo tumor, como um modelo de tumor sólido subcutânea foi encontrado para ter significativa heterogeneidade espacial de imunológica. Em geral, esse método pode com mais precisão e de forma consistente comparar entre amostras porque enriquece para subconjuntos celulares imunes dentro do tumor e permite a caracterização independente das células do tumor e imunes frações de um tumor.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do Baylor College of Medicine e institucional Cuidado Animal.

1. digestão e colheita tumor

Nota: O tempo necessário para a colheita é ~ 3-5 min/tumor e o tempo necessário para o processamento é ~ 1 h + 2-3 min/tumor.

1. Eutanásia em ratos por inalação de dióxido de carbono e uma mangueirada cada rato com etanol a 70% antes da colheita para evitar a contaminação de cabelo. Cirurgicamente remover tumores subcutâneos de ratos e certifique-se de que os tumores são livres de qualquer contaminante tecido (i.e., cabelo, pele, peritônio, etc.). Coloque cada tumor em 1,8 mL de base RPMI-1640 mídia sem soro fetal bovino (FBS) em uma placa de 24. Para maiores colheitas, manter placas frias no gelo para preservar a viabilidade celular.
   Nota: Se esterilidade é necessária, todas as dissecções de tumor precisará ser realizada em uma armário com instrumentos cirúrgicos estéreis (i.e., tesouras, pinças, etc.), bem como quaisquer outras medidas de biossegurança. Tumores com o maior diâmetro entre 0,5 - 1 cm são ideais, e tumores de maiores ou menores exigirá dimensionamento dos reagentes.
2. Use uma tesoura para cortar os tumores em menos de 1 mm³ peças dentro de cada poço.
3. Preparar um cocktail de digestão de 10x dissolvendo colagenase que 10mg/mL, IV de colagenase em 2.500 U/mL e DNase eu a 200 U/mL em base meios de RPMI-1640 (sem FBS).
   Nota: A digestão cocktail pode ser preparada um dia de antecedência e armazenada a-20 ° C; no entanto, um armazenamento prolongado não é recomendado como enzimas vão perder atividade ao longo do tempo uma vez dissolvido.
4. Adicionar 200 µ l de 10 x dissociação cocktail contendo colagenase I, IV colagenase e DNase I para cada poço com pedaços de³ a 1 mm.
5. Permitir que as amostras digerir durante 1 h a 37 ° C, agitando levemente 60-100 RPM usando um agitador orbital de placa.
   Nota: A elevação da temperatura a 37 ° C durante a digestão enzimática pode causar ativação de células imunes.
6. Depois de 1 h, neutralize a reação adicionando 1 mL de RPMI-1640 mídia suplementada com 5% FBS e 2 mM de EDTA para cada poço.
7. Pipete a digestão do tumor e o restante do tumor em um coador de célula de 40 µm sentado em cima de um tubo de centrífuga de 50 mL.
   Nota: Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL para fácil transferência de digestão do tumor para o filtro.
8. Use um êmbolo de seringa de 10 mL para desagregar mecanicamente as peças do tumor através do filtro. Periodicamente, lave o filtro com 2 mL de completados mídia RPMI-1640 (contendo 5% FBS) e repita até que o filtro célula está livre de tumor.
   Nota: Cerca de 4-10 mL de mídia total deve ser suficiente para enxaguar adequadamente o coador de tumor.
   Nota: Colocar as amostras no gelo, até que essa etapa for concluída para todas as amostras preservar a viabilidade celular.
9. Ajuste cada tubo de centrífuga de 50 mL para o mesmo volume utilizando o meio RPMI 1640 completado.
   Nota: O ajuste do volume é essencial para balanceamento de centrífuga. Pular esta etapa pode resultar em lesões pessoais ou danos de centrífuga.
10. Centrifugar as suspensões celulares (5 min, 805 x g, 4 ° C), descartar os sobrenadantes e ressuspender em 2 mL de completados mídia RPMI-1640.
    Nota: Um agregado de células pode formar a centrifugação que é difícil Ressuspender a seguir. Use uma pipeta sorológica 5ml e misture rapidamente para quebrá-lo antes de prosseguir.

2. separação de frações celulares imunológico e Tumor

Nota: O tempo necessário para esta etapa é de cerca de 1 h.

1. Adicione 3 mL de meio de gradiente de densidade para o fundo de um tubo de centrífuga de 15 mL. Preparar e rotular suficiente tubos para cada tumor.
2. A 2 mL de suspensão de células de tumor em cima do meio de gradiente de densidade da camada pipetando lentamente para baixo do lado do tubo para evitar a mistura das duas camadas.
3. Cuidadosamente coloque os tubos em camadas no centrifugador e rotação por 20 min a 805 x g, 20 ° C, com o sem freio.
   Nota: É extremamente importante verificar o correcto balanceamento e certifique-se de que o freio não é usado durante a centrifugação. Qualquer interrupção deste processo resultará em camada de mistura e a recuperação completa de amostras será difícil.
4. Transferi com cuidado o tumor infiltração leucocitária (TIL) camada e a camada superior de mídia para um novo tubo de 15 mL com uma pipeta de transferência. Descartar todos os restantes médio de gradiente de densidade e ressuspender o tumor na parte inferior do tubo em 2 mL de RPMI-1640 completados.
   Nota: Após a centrifugação haverá quatro camadas visíveis de cima para baixo, que correspondem respectivamente a: mídia, TILs, médio gradiente de densidade e aglomerados de células do tumor. Consulte a Figura 2A para a exemplo das várias camadas.
5. Centrifugar os dois o TIL e amostras de tumor em separam os tubos (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartar o sobrenadante.
6. Resuspenda amostra TIL em 200 µ l e a pelota de tumor em 2 mL de completados mídia RPMI-1640. Manter-se no gelo para preservar a viabilidade.

3. chapeamento e coloração

Nota: O tempo necessário para o chapeamento é 30 s/tumor; o tempo necessário para a coloração da superfície é de 1 h; o tempo necessário para coloracao intracelular é 40 min; o tempo necessário para análise de citometria de fluxo é 1 - 4 min/tumor.

1. Prepare-se e conta com placa de rótulo um U-fundo de 96 poços para cada imunológico coloração painel e uma placa adicional para celular.
   Nota: Normalmente, três pratos são preparados no total: uma placa do painel de linfócitos com foco, uma placa de painel mieloide focada e uma placa de contagem de células.
2. Alíquota as suspensões de célula única em cada um da coloração do painel placas e um volume definido na placa de contagem.
   Nota: A placa de contagem é usada para calcular o número total de células adicionado para cada painel de coloração, permitindo assim que a contagem de população de células precisos. Um citômetro de fluxo com capacidades de amostragem e de análise volumétrica de placa de 96 poços pode fornecer o número de células por µ l em cada amostra e portanto, calcular o número de células adicionado para cada painel de coloração. Placas de contagem podem ser adquiridas no dia seguinte após a fixação durante a noite a 4 ° C, enxágue com buffer de FACs (tampão fosfato salino (PBS), com 2% FBS) e resuspending em um volume definido de buffer de FACs.
3. Lave as células duas vezes com 200 µ l de solução salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) por amostra por centrifugação (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartar o sobrenadante entre cada enxágue para remover qualquer enciclopédia FBS.
4. Adicionar 50 µ l do bloco Fc, misturar as amostras usando uma pipeta multicanal e incube por 20 min a 4 ° C.
5. Adicionar 50 µ l de 2x concentrado anticorpo direcionamento extracelular e viabilidade fixável mancha mistura, misture com uma pipeta multicanal e incube por 30 min no escuro no RT ou 4 ° C.
   Nota: As condições exatas de coloração para o anticorpo dependem as instruções do fabricante. Todas as diluições de coloração devem ser em DPBS, com nenhum FBS adicionado para evitar a saturação do corante viabilidade fixável. Por favor, veja a Tabela de materiais e equipamentos para as diluições ideais do painel coloração usada neste manuscrito. Anticorpo e viabilidade fixável solução de coloração é preparado em uma concentração de 2 x para fornecer um final 1 x manchando a concentração de 100 µ l de volume total de coloração quando adicionado ao bloco de Fc.
6. Lave as amostras duas vezes com tampão de FACs por centrifugação (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartando os sobrenadantes entre cada lavagem.
7. Resuspenda em 200 µ l de solução de fixação/permeabilização de 1x e incubar durante uma noite a 4 ° C, protegido da luz.
   Nota: O experimento pode ser pausado a noite neste ponto: manter as amostras em 4 ° C, protegido da luz.
8. No dia seguinte, Centrifugar as placas (5 min, 805 x g, 4 ° C) e descartar o sobrenadante.
9. Lave uma vez com 200 µ l de tampão de permeabilização, centrifugador (5 min, 805 x g, 4 ° C), 1x e descartar o sobrenadante.
10. Adicione 100 µ l de 1 x concentrado anticorpo intracelular coloração painel preparado em tampão de permeabilização de 1x e incube por 30 min no escuro no RT ou 4 ° C (isso depende de coloração as recomendações do fabricante).
11. Lave uma vez com permeabilização 1x tampão (5 min, 805 x g, 4 ° C), desprezar o sobrenadante e lavar uma segunda vez com buffer de FACs (PBS com 2% FBS).
12. Resuspenda as amostras em 300 µ l de tampão de FACs (PBS com 2% FBS), transferir as amostras para tubos de citometria de fluxo e executar análise de citometria de fluxo.

Resultados

Nossos resultados demonstram o benefício significativo de TIL separação de componentes de tumor não imune, conforme explicado no protocolo. Além disso, usando o método descrito Demonstramos a heterogeneidade imunológica significativa de tumores sólidos estabelecidos.

Um problema significativo com muitas técnicas de dissociação de tumor é a perda da viabilidade da amostra, geralmente como resultado de condições de d...

Discussão

O tempo é composto de moléculas e componentes celulares diversos e complexos. Recentes sugerem que a caracterização exata deste ambiente pode fornecer um melhor entendimento do tratamento de sucesso ou fracasso e pode até mesmo ajudar a identificar os mecanismos de resistência terapêutica. Por exemplo, aumentando os níveis de intratumoral de várias células imunossupressoras (i.e., MDSCs, pilhas de T reguladoras, etc.) pode atenuar efetoras imune respostas e abrogar efeitos imunoterapia. Por ou...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	N/A	Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line	Acquired from collaborator	N/A	E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line
70% isopropyl alcohol	EMD Milipore	PX1840
Murine surgical tool kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.
24-well plate	Denville Scientific Inc.	T1024	Or any 24-well flat bottom plate.
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R0883
Collagenase I	EMD Milipore	234153
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
DNase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Low Speed Orbital Shaker	BioExpress (supplier: Genemate)	S-3200-LS	Or any orbital shaker.
Thermoregulating incubator	Fisher Scientific	13-255-27	Or any other thermo-regulated incubator
FBS	Sigma-Aldrich	F8192
EDTA	AMRESCO	E177
1 mL Pipette and tips	Eppendorf	13-690-032	Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers	Fisher Scientific	22363547
50 mL Centrifuge Tubes	Denville Scientific Inc.	C1062-P
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific Inc.	C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles	BD	309604
Lymphoprep Density Gradient Medium	STEMCELL Technologies	7811
Transfer Pipettes	Denville Scientific Inc.	P7212
96-well U-bottom plates	Denville Scientific Inc.
DPBS	Sigma Aldrich	D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher Scientific	00-5523-00	Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For 96-well cell volumetric counting
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2	ThermoFisher Scientific	553141	Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	ThermoFisher Scientific	L34962	Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780	ThermoFisher Scientific	47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC	ThermoFisher Scientific	17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE	Santa Cruz Biotechnology	sc-53473
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700	ThermoFisher Scientific	56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450	ThermoFisher Scientific	48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC	ThermoFisher Scientific	17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE	ThermoFisher Scientific	12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	ThermoFisher Scientific	25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710	ThermoFisher Scientific	46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711	BD Biosciences	563755