濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

要約

ここで分離し、確立された皮下腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小環境のコンポーネントを豊かにする方法をについて説明します。この手法は、腫瘍免疫浸潤と非免疫腫瘍腫瘍免疫微小環境の包括的な評価を可能にすることができます独立した分析のためことができます。

要約

腫瘍免疫微小環境 (時間) は最近特に免疫療法のための固形腫瘍の治療反応の重要な仲介人として認識されています。免疫療法の臨床的進歩は、再現可能な方法で正確かつ完全に特徴付ける腫瘍とその関連付けられた免疫潜入の必要性を強調表示します。腫瘍の酵素消化とフローサイトメトリーによる解析により、多数の免疫細胞サブセットおよび表現型; の広範な評価しかし、分析の深さは多くの場合パネルのデザインと大きな腫瘍のサンプルを取得する必要があります興味のまれな免疫個体を観察する fluorophore 制限によって制限されます。したがって、分離・非免疫腫瘍コンポーネントから腫瘍免疫潜入を豊かに高スループットの効果的な方法を開発しました。記載されている腫瘍消化と遠心密度ベースの分離技術により、腫瘍と腫瘍の個別特性免疫潜入分数と細胞生存率を保持し、したがって、腫瘍の広範な評価を提供します免疫学的状態。このメソッドは、さらに一貫性のある全体の腫瘍免疫学的プロファイリング技術の必要性を示す固形腫瘍広範なの空間的免疫不均一を特徴付けるために使用されました。全体として、このメソッドは固体マウス皮下腫瘍の免疫学的特性に対する効果的かつ適応手法を提供します。よい腫瘍の免疫学的機能を特徴付けるためのこのツールの使用など、新しい免疫療法戦略の前臨床評価。

概要

抑制時間は、最近、癌の特徴として認識されているし、開発、進行固形腫瘍癌の保護に重要な役割を果たすだけでなく、免疫療法¹感受性を緩和する知られています。時間は、多数の細胞サブセットと腫瘍の免疫学的状態に重要な洞察力を提供するすべての表現型で構成されます。これらの免疫のサブセットは、一緒に自然免疫と適応免疫応答^2,3の大半を構成するリンパ球や骨髄由来の細胞にさらに層化できます。がん免疫療法の分野の最近の進歩は免疫療法戦略(すなわち、免疫チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体の T 細胞等)に耐久性のある癌を誘発する可能性があることを示しています。リグレッションただし、固形腫瘍の癌^4,5で比較的効果が残ります。多数のグループでは、時間治療成功^6、7、遊ぶことができる、したがって、特に中心前臨床設定の新しい免疫療法を正確に評価する必要があるいる、重要なハードルを示されている、変調または⁸時間を克服する機能。

通常時間を特徴付ける現在の努力はどちらか顕微鏡を利用またはフローサイトメトリー抗体の免疫細胞サブセットと^9,10代の機能を識別するための戦略を分類と共に。これらの 2 つの戦略顕微鏡により細胞サブセットの空間感謝されフローサイトメトリー高スループット、携帯電話の変更のより広範な定量化一意に異なる情報を提供します。今まで 7 つのパラメーターをサポートできる、スペクトル イメージング システムの最適化多重免疫組織染色の最近の改善にもかかわらず限定パネル サイズ広範なレベル プロファイリング免疫困難は、したがってこの手法はしばしば予約詳細解析に焦点を当てた。その結果、フローサイトメトリーはプロファイリング技術最も広く使われている免疫の一つであります。時間評価技術の広範な使用、にもかかわらず処理と染色に使用される方法は非常に変数です。多くの場合プロトコル利用酵素の分離腫瘍 (すなわちコラゲナーゼ、DNase、等) と単一細胞懸濁液を達成するために手動の解離メソッドの後に抗体染色と分析⁷。それぞれの方法の利点があるにもかかわらず多数のグループはこれらテクニック¹¹まで誘導することができます大規模な変動を示しています。これにより、同じマウス腫瘍モデルを評価する際にも、腫瘍微小環境のプロファイリングのクロス研究比較が非常に困難になります。さらに、これらのメソッドは、腫瘍細胞を評価する限られた可能性を提供し、腫瘍免疫侵入、独立していないコンポーネント消化後両方のコンポーネントが点在するので。サンプル量は、マルチパネル染色とまれな免疫学的サブセットを特徴付けるように試みとが主要な問題の分析を制限 (すなわち、腫瘍特定の T 細胞)¹²。質量 cytometry など (CyTOF)、飛行時間によってフローサイトメトリー最新技術は、42 の独立したパラメーター¹³以上のパネル デザインをサポートいくつかのシステムと細胞サブセットの高次元の表現型解析を許可します。CyTOF 免疫プロファイリング技術の驚異的なパワー、にもかかわらず、それは費用、解析の専門知識、および機器へのアクセスのため限られています。さらに、CyTOF プロトコルの多くは、信号対雑音比の¹⁴を改善するために免疫のサブセットの浄化をお勧めします、したがって私たちの濃縮方法を使用できることを提案 CyTOF 分析データの品質を向上させるための上流。

本腫瘍微小環境消化と腫瘍免疫を組み込む方法は侵入分離解析について述べる。このメソッドの目的は、腫瘍免疫浸潤、腫瘍微小環境の広範な評価の腫瘍細胞の一部分の独立した高スループット プロファイルを許可することです。このメソッドを使用すると、さらに示す全腫瘍の分析の重要性と皮下腫瘍モデル発見された重要な免疫不.全体的にみて、このメソッドより正確かつ一貫して比較できますサンプル間腫瘍内免疫細胞サブセットの豊か、独立した腫瘍細胞と腫瘍の免疫分数のプロファイリングが可能になります。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の薬の Baylor の大学によって承認されています。

1. 腫瘍の収穫と消化

注: 収穫に要する時間は 3 ~ 5 分/腫瘍と処理に必要な時間は ~ 1 + 2-3 min/腫瘍。

1. 炭酸ガス吸入によるマウスを安楽死させるし、髪の汚染を防ぐために収穫前に各マウスをダウン 70% エタノールをスプレーします。マウス皮下腫瘍を削除し、腫瘍が任意の汚染組織(すなわち髪、肌、腹膜等)の無料手術。24 ウェル プレートでのウシ胎児血清 (FBS) なし基本 RPMI 1640 メディアの 1.8 mL の各腫瘍を配置します。大きな収穫の細胞を維持するために氷の寒さのプレートを維持します。
   注: 不妊が必要なすべての腫瘍の解剖必要がありますバイオ セーフティ キャビネット (すなわちハサミ、鉗子、等)、生殖不能の外科ツールとして次のステップで実行します。0.5 - 1 cm 最長の直径が付いている腫瘍が最適とより大きいまたは小さい腫瘍試薬のスケーリングが必要になります。
2. 各ウェル内の³個セット 1 mm 以下に腫瘍をカットするのにはさみを使用します。
3. コラゲナーゼを溶解することにより消化カクテル x 10 の準備で 10 mg/mL、コラゲナーゼ IV 2,500 U/mL と DNase 私 200 U/mL 基本 RPMI 1640 メディア (FBS) なしで私。
   注: カクテルの消化日を前もって準備して格納できます-20 ° c;ただし、酵素は一度解散時間をかけて活動を失うので、長期の保管はお勧めしません。
4. 私、コラゲナーゼ IV、DNase コラゲナーゼを含む解離カクテル × 10 の 200 μ l 添加 1 mm の³個の各ウェルに。
5. 軌道プレート シェーカーを使用しての 60-100 rpm で軽く振りながら 37 ° C で 1 時間のダイジェスト サンプルを許可します。
   注: 酵素消化中に 37 ° C までの温度の上昇は、免疫細胞の活性化を引き起こす可能性があります。
6. 1 時間後の各ウェルに 5 %fbs と 2 mM EDTA 添加 RPMI 1640 メディアの 1 つの mL を追加することによって反応を中和します。
7. 50 mL の遠心管の上に座っている 40 μ m セル ストレーナーに腫瘍消化、残りの腫瘍部分をピペットします。
   注: は、ストレーナーに腫瘍消化を容易に転送する 1 mL ピペット チップの先端をカットします。
8. こし器を通して腫瘍部分を機械的に細かく分けた 10 mL シリンジのプランジャーを使用します。定期的に 2 ml の補われた RPMI 1640 メディアのストレーナーを洗浄 (5% を含む FBS) セル ストレーナーが腫瘍のクリアされるまでを繰り返します。
   注: メディア総数の約 4-10 mL は十分に腫瘍のストレーナーを洗浄するための十分なはずです。
   注: は、細胞生存率を維持するためにすべてのサンプルのこのステップを完了するまで氷にサンプルを配置します。
9. 補足 RPMI 1640 メディアを使用して同じボリュームに各 50 mL 遠心管を調整します。
   注: ボリュームの調整は、遠心力のバランスをとるため重要です。遠心分離機の損傷やけがこのステップをスキップ可能性があります。
10. (5 分、805 × g、4 ° C) 細胞懸濁液を遠心分離、培養上清を破棄し、再補足 RPMI 1640 メディアの 2 mL で中断します。
    注: セルの集計は次の再懸濁しますにくい遠心分離フォームがあります。続行する前にそれを破るため急速に 5 mL の血清ピペットとミックスを使用します。

2. 免疫と腫瘍細胞分画の分離

注: この手順の所要時間は約 1 時間です。

1. 密度勾配媒体の 3 mL を 15 mL 遠心管の下部に追加します。準備し、ラベルを各腫瘍に対する十分なチューブ。
2. 層の 2 つの層の混合を防ぐために管の側をゆっくりとピペッティングによる密度勾配媒体上に腫瘍細胞懸濁液 2 mL。
3. 慎重に遠心分離機で 805 x g は、20 ° C、ないブレーキで 20 分間スピン多層チューブを配置します。
   注: 適切なバランスを確認し、遠心分離中にブレーキを使用しないことを非常に重要です。このプロセスを中断する層の混合になります、サンプルの完全回復が困難になります。
4. (ゴマ) 層と転送ピペットを使用して新しい 15 mL チューブにトップ メディア層白血球浸潤腫瘍を慎重に転送します。すべての残りの密度勾配媒体を破棄し、補われた RPMI 1640 の 2 mL でチューブの下部に腫瘍ペレットを再懸濁します。
   注: 遠心分離後がありますそれぞれに対応する下に上から 4 つの可視レイヤー: 腫瘍細胞ペレット密度勾配媒体、ティルズ メディア。図 2さまざまな層の例についてはを参照してください。
5. 両方のティルを遠心し、腫瘍のサンプル チューブ (5 分、805 × g、4 ° C) を分離し、上澄みを廃棄します。
6. 200 μ L のティル サンプルと補われた RPMI 1640 メディアの 2 mL で腫瘍ペレットを再懸濁します。生存率を維持するために氷の上を保ちます。

3. めっきと染色

注: めっきに必要な時間は 30 s/腫瘍;表面の汚損のための所要時間は 1 時間です。細胞内染色に要する時間は 40 分です。フローサイトメトリー解析は 1 - を必要な時間 4 分/腫瘍。

1. 準備し、各免疫染色パネル、セルの追加プレート用ラベル 96 ウェルの U 底プレートをカウントします。
   注: 通常、3枚のプレートは、合計で用意をしています: リンパ球に焦点を当てたパネル プレート、骨髄性に焦点を当てたパネル プレート、セル数プレート。
2. 分注染色のそれぞれに単一細胞懸濁液パネル プレートとセットのボリューム カウント板に。
   メモ: カウント板により正確なセル人口それぞれの染色パネルに追加されるセルの合計数を計算するため使用されます。96 ウェル プレート サンプリングおよび容積測定分析機能を備えたフローサイトは各サンプルの μ L あたりのセル数を提供し、したがって、各染め色のパネルに追加されるセルの数を計算できます。数板は 4 ° C、FACs バッファーで洗浄で一晩固定後次の日を得ることができる (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 %fbs)、FACs バッファーの設定ボリュームで再と。
3. (5 min, 805 × g、4 ° C) を遠心分離し、任意の無料の FBS を削除する各リンス間清を破棄してサンプルあたりダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 200 μ L で 2 回細胞を洗ってください。
4. Fc ブロックの 50 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用してサンプルをミックスし、4 ° C で 20 分間インキュベートを追加します。
5. 2 倍の 50 μ L 濃縮細胞ターゲティング抗体と修正可能な生存汚れの混合物、マルチ チャンネル ピペットを使用してミックス、RT または 4 ° C で暗闇の中で 30 分間インキュベートを追加します。
   注: 抗体の正確な染色条件は、製造元によって異なります。すべての染色希釈は、修正可能性色素の飽和を防ぐためにない追加の FBS の DPBS でなければなりません。この原稿で使用されている染色パネルの最適な希釈液のためのテーブルの材料/機器を参照してください。Fc ブロックに追加される染色容量 100 μ L の濃度を染色 × 最終的な 1 を提供するために 2 倍の濃度では、抗体と修正可能性染色液を用意しています。
6. (5 分、805 × g、4 ° C) を遠心分離し、各リンス間培養上清を破棄して FACs バッファーで 2 回サンプルを洗います。
7. 1 x 固定/透過液 200 μ L で再懸濁します、光から保護 4 ° C で一晩インキュベートします。
   注: 実験を一時停止できる一晩この時点: 光から保護 4 ° c のサンプルを保ちます。
8. 次の日は (5 分、805 × g、4 ° C) プレートを遠心し、上澄みを廃棄します。
9. 濯ぎ 1 回 x 透過バッファー、遠心分離機 (5 分、805 × g、4 ° C)、1 の 200 μ L で、上澄みを廃棄します。
10. 1 x 透過バッファーの準備 1 x 集中細胞抗体染色パネルの 100 μ L を追加し、RT または 4 ° C (製造元から染色の推奨によって異なります) で暗闇の中で 30 分間インキュベートします。
11. 1 x 透過とバッファー (5 分、805 × g、4 ° C) は、上澄みを廃棄したらすすぎとリンス FACs バッファーと 2 回目 (PBS 2 %fbs)。
12. FACs バッファーの 300 μ L のサンプルを再懸濁します (PBS 2 %fbs)、流れの cytometry チューブにサンプルを転送およびフロー フローサイトメトリー分析を実施します。

結果

プロトコルで説明したように、非免疫腫瘍コンポーネントから分離までの大きな利点を示した。また、記載されているメソッドを使用して確立された固形腫瘍の重要な免疫学的不均一性を示す.

多くの腫瘍解離技術の大きな問題として、過酷な消化条件 (すなわち、上昇温度、不十分な栄養供給など) の結果と...

ディスカッション

時間は、多様で複雑な細胞成分と分子で構成されます。最近の証拠は、この環境の正確な特性評価が治療の成功または障害のよりよい理解を提供できる治療抵抗性のメカニズムを特定するを助けてもいいこと示唆しています。たとえば、エフェクター免疫反応を軽減することができ、免疫療法の効果を破棄する腫瘍様々 な免疫細胞 (すなわちMDSCs、T 細胞など) のレベルを上げま?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	N/A	Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line	Acquired from collaborator	N/A	E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line
70% isopropyl alcohol	EMD Milipore	PX1840
Murine surgical tool kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.
24-well plate	Denville Scientific Inc.	T1024	Or any 24-well flat bottom plate.
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R0883
Collagenase I	EMD Milipore	234153
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
DNase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Low Speed Orbital Shaker	BioExpress (supplier: Genemate)	S-3200-LS	Or any orbital shaker.
Thermoregulating incubator	Fisher Scientific	13-255-27	Or any other thermo-regulated incubator
FBS	Sigma-Aldrich	F8192
EDTA	AMRESCO	E177
1 mL Pipette and tips	Eppendorf	13-690-032	Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers	Fisher Scientific	22363547
50 mL Centrifuge Tubes	Denville Scientific Inc.	C1062-P
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific Inc.	C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles	BD	309604
Lymphoprep Density Gradient Medium	STEMCELL Technologies	7811
Transfer Pipettes	Denville Scientific Inc.	P7212
96-well U-bottom plates	Denville Scientific Inc.
DPBS	Sigma Aldrich	D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher Scientific	00-5523-00	Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For 96-well cell volumetric counting
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2	ThermoFisher Scientific	553141	Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	ThermoFisher Scientific	L34962	Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780	ThermoFisher Scientific	47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC	ThermoFisher Scientific	17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE	Santa Cruz Biotechnology	sc-53473
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700	ThermoFisher Scientific	56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450	ThermoFisher Scientific	48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC	ThermoFisher Scientific	17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE	ThermoFisher Scientific	12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	ThermoFisher Scientific	25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710	ThermoFisher Scientific	46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711	BD Biosciences	563755