농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

요약

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

초록

종양 면역 microenvironment (시간) 최근 특히 immunotherapies에 대 한 단단한 종양에서 치료 응답의 중요 한 중재자로 인정 받고 있습니다. 최근 임상 발전 immunotherapy 정확 하 고 철저 하 게 종양 및 그 관련된 면역 침투 특성 재현 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 종양 효소 소화 및 흐름 cytometric 분석 허용 광범위 한 특성 수많은 면역 세포 하위 집합 및 고기; 그러나, 분석의 깊이 종종 fluorophore 제한 패널 설계 및 큰 종양 샘플을 확보 하는 필요의 희귀 면역 인구를 관찰에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 분리 및 농축 비 면역 종양 구성 요소에서 종양 면역 침투에 대 한 효과적이 고 높은 처리량 방법을 개발 했습니다. 설명된 종양 소화와 밀도 기반 원심 분리 기술은 종양 및 종양에 대 한 별도 특성 면역 침투 분수 및 세포 생존을 유지 있으며 따라서 종양의 광범위 한 특성을 제공 합니다 면 역학적 상태입니다. 이 방법은 하는 광범위 한 공간 면역이 단단한 종양에서 더 일관 된 전체 종양 면역학 프로 파일링 기법에 대 한 필요성을 보여주는 사용 되었다. 이 방법은 피하 고체 murine 종양; 면 역학적 특성에 대 한 효과적이 고 융통성 있는 기법을 제공 하는 전반적으로, 이 도구를 사용 하 수 있다 더 나은 종양 면역학 기능을 특성화 하는 등, 소설 immunotherapeutic 전략의 전 임상 평가.

서문

진압 시간 최근 암의 각 인으로 인정을 받고 있다 그리고 immunotherapy¹그들의 민감성을 완화 뿐만 아니라 개발, 진행, 그리고 고체 종양 암의 보호에 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 에 수많은 세포 하위 집합 및 고기, 종양의 면 역학적 상태에 중요 한 통찰력을 제공 하는 모두는 구성 됩니다. 이러한 면 역학적 하위 집합 추가 함께 타고 난 및 적응형 면역 반응^2,3의 대다수를 구성 하는 림프 구 또는 골수성 근원의 세포로 층 화 될 수 있다. Immunotherapeutic 전략 (즉, 검사점 면역 억제제, 공상 항 원 수용 체 T-세포, 등) 튼튼한 암 유발 가능성이 있는 암 immunotherapy 분야의 최근 발전 증명 재발; 그러나, 그들은 상대적으로 단단한 종양 암^4,5에서 효과 유지. 수많은 그룹 시간 치료 성공^6,7을 재생할 수 및 따라서, 거기에 특별히 초점을 맞추고 전 임상 설정에서 새로운 immunotherapies 정확 하 게 평가할 필요가 남아 있다 중요 한 장애물이 나타났습니다 그들의 변조 또는⁸시간 극복 하는 능력.

일반적으로 시간을 특성화 하기 위해 현재 노력 중 현미경 활용 또는 항 체 면역 세포 하위 집합 및 그들의 기능^9,10식별 하는 전략을 라벨 함께 cytometry 흐름. 이 두 가지 전략 현미경 세포 하위 집합의 공간 감사 있으며 cytometry 제공 높은 처리량 및 세포 변화의 광범위 한 정량화 고유 하 게 서로 다른 정보를 제공 합니다. 형광 성 다중 immunohistochemistry 지금 최대 7 매개 변수를 지원할 수, 스펙트럼 이미징 시스템 최적화에 최근 개선에도 불구 하 고 제한 된 패널 크기 어려운 광범위 한 레벨 프로 파일링 면역 이며 따라서이 기술을 자주 자세한 예약 집중 분석. 결과적으로, cytometry는 가장 널리 사용 되는 면역 프로 파일링 기법 중 하나 남아 있다. 시간 특성에 그것의 광범위 한 사용, 처리 및 얼룩을 위해 사용 되는 방법을 매우 변수는 있습니다. 가장 자주 프로토콜 활용 종양 효소 해리 (즉, collagenases, DNase, 등) 및 수동 분리 방법은 단일 셀 정지를 달성 하기 위해 다음 항 체 얼룩이 지 고 분석⁷. 각 방법의 장점에도 불구 하 고 수많은 그룹¹¹이러한 기법 통해 유도 될 수 있는 광범위 한 다양성을 보여주었다. 이것은 종양 microenvironment 프로 파일링의 크로스-연구 비교 매우 어려운 동일한 murine 종양 모델을 평가 하는 경우에 합니다. 또한, 종양 세포를 평가 하기 위해 제한 된 잠재력을 제공 하는 이러한 메서드 및 종양 면역 침투 하지 구성 요소 독립적으로, 때문에 두 구성 요소는 소화 후 산재. 샘플 수량 다음 제한 멀티 패널 얼룩 및 분석, 희귀 면역학 하위 집합 특성 하려고 할 때 주요 문제 되는 (즉, 종양 관련 T-세포)¹². 대량 cytometry cytometry (CyTOF), 비행 시간 등 최근 기술 42 독립적인 매개 변수¹³보다 큰 패널 디자인을 지 원하는 일부 시스템 셀룰러 하위 집합의 차원 높은 phenotypic 분석 허용. CyTOF 기술에 면역 프로 파일링의 엄청난 힘에도 불구 하 고 그것은 비용, 분석 전문 및 장비에 대 한 액세스 제한 된 남아 있습니다. 또한, 많은 CyTOF 프로토콜 추천¹⁴, 신호 대 잡음 비율 개선 하기 위해 면역 하위 집합의 정화 그리고 따라서 좋습니다 우리의 농축 메서드를 사용할 수는 업스트림 데이터 품질 향상을 위한 CyTOF 분석의.

여기 우리가 종양 microenvironment 소화 및 분석 분리를 침투 하는 종양 면역을 통합 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법의 목적은 종양 면역 침투 및 종양 microenvironment의 광범위 한 특성 분석을 위한 종양 세포 분수의 독립적인 높은 처리량 프로 파일링 수 있도록. 이 방법을 사용 하 여, 더 설명 전체 종양 분석의 중요성으로 피하 고체 종양 모델은 중요 한 공간 면역학이 발견 합니다. 전반적으로,이 방법은 더 정확 하 고 일관 되 게 비교할 수 샘플 사이의 종양 내에서 면역 세포 하위 집합에 대 한 풍요롭게 종양 세포와 종양의 면역 분수의 독립적인 프로 파일링을 허용 하기 때문에.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 베일 러 대학의과 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 종양 수확 및 소화

참고: 수확에 필요한 시간은 3-5 분/종양, 및 처리에 필요한 시간 1 ~ h + 2-3 분/종양.

1. 이산화탄소 흡입 하 여 마우스를 안락사와 머리 오염을 방지 하기 위해 수확 하기 전에 70% 에탄올과 아래로 각 마우스 스프레이. 수술로 쥐에서 피하 종양을 제거 하 고 종양 어떤 오염 조직 (즉, 머리, 피부, 복 막, 등)의 무료 인지 확인. 각 종양 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 24-잘 접시에서 없이 기본 RPMI 1640 미디어의 1.8 mL에 놓습니다. 큰 수확에 대 한 계속 판 찬 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에.
   참고: 불 임이 필요한 경우 모든 종양 ╂ biosafety 어떤 추가 단계 뿐 아니라 불 임 수술 도구 (즉, 가 위, 집게, 등), 캐비닛에서 필요 합니다. 0.5-1 ㎝ 사이 가장 긴 직경이 종양은 최적의 그리고 더 큰 또는 작은 종양 시 약의 스케일링 필요 합니다.
2. 가 위를 사용 하 여 각 잘 내³ 조각을 1 m m 미만으로 종양을 잘라.
3. 콜라를 용 해 하 여 소화 칵테일 x 10을 준비 10 mg/mL, 2500 U/mL, 그리고 DNase에서 콜라 4에서 나 기본 RPMI 1640 미디어 (FBS) 없이 200 U/mL에서 나.
   참고: 소화 칵테일 사전에 하루를 준비 하 고 수-20 ° C에 저장 그러나, 효소 활동 한번 해산 시간이 지남에 잃게됩니다 장기간된 보관 권장 하지 않습니다.
4. 난, 콜라 4, 및 DNase 콜라를 포함 하는 분리 칵테일 x 10의 200 µ L을 추가 나 1 m m³ 조각으로 각 잘 하.
5. 60-100 rpm 궤도 격판덮개 셰이 커를 사용 하 여 가볍게 흔들어 동안 37 ° C에서 1 시간에 대 한 소화 샘플 수 있습니다.
   참고: 효소 소화 하는 동안 37 ° C에 온도를 상승 면역 세포 활성화를 발생할 수 있습니다.
6. 1 시간 후 RPMI 1640 미디어 각 음을 5 %FBS 2 mM EDTA와 보충의 1 mL을 추가 하 여 반응 중화.
7. 50 mL 원심 분리기 튜브 위에 앉아 40 µ m 셀 스 트레이너로 종양 소화와 나머지 종양 조각 플라스틱.
   참고: 종양 소화는 스 트레이너를 쉽게 전송에 대 한 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라.
8. 10 mL 주사기 플런저를 사용 하 여 기계적으로 스 트레이너를 통해 종양 조각 세분화. 주기적으로 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL와 여과기를 헹 굴 (포함 하는 5 %FBS) 셀 스 트레이너는 종양의 명확한 때까지 반복.
   참고: 전체 미디어의 약 4-10 mL 적절 하 게 종양의 여과기를 헹 구 게 충분 해야 한다.
   참고:이 단계는 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 모든 샘플에 대 한 완료 될 때까지 얼음에 샘플을 놓습니다.
9. 각 50ml 원심 분리기 튜브 보충된 RPMI 1640 미디어를 사용 하 여 동일한 볼륨을 조정 합니다.
   참고: 볼륨 조정은 원심 분리기 균형 중요 합니다. 이 단계를 건너뛰는 원심 분리기 손상 또는 상해 될 수 있습니다.
10. 셀 정지 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 원심 supernatants, 삭제 하 고, 다시 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 일시 중단.
    참고: 셀 집계를 resuspend 어려운 원심 분리에 따라 형성 수 있습니다. 계속 하기 전에 헤어 5 mL 혈 청 학적인 피 펫과 혼합 빠르게 사용 합니다.

2. 면역과 종양 세포 분수의 분리

참고:이 단계에 필요한 시간은 약 1 시간입니다.

1. 15 mL 원심 분리기 튜브의 하단에 밀도 그라데이션 매체의 3 mL를 추가 합니다. 준비 하 고 각 종양에 대 한 충분 한 튜브 라벨.
2. 레이어 2 개의 층의 혼합을 방지 하기 위해 튜브의 측면 아래로 천천히 pipetting으로 밀도 그라데이션 매체 위에 종양 세포 현 탁 액 2 mL.
3. 조심 스럽게 원심 분리기에 스핀 805 x g, 20 ° C, 아니 브레이크에서 20 분에 대 한 계층화 된 튜브를 놓습니다.
   참고: 그것은 매우 적절 한 균형을 확인 하 고 아무 브레이크 원심 분리 하는 동안 사용 되도록 하는 것이 중요입니다. 이 과정의 혼선 레이어 혼합 되며 전체 샘플 복구는 어려울 것 이다.
4. 조심 스럽게 (틸) 계층과 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브에 최고의 미디어 계층 백혈구 침투 종양 전송. 모든 나머지 밀도 그라데이션 매체를 삭제 하 고 보충된 RPMI-1640의 2 ml에서 튜브의 하단에 종양 펠 릿 resuspend.
   참고: 원심 분리 후 있을 것입니다 아래로 각각 해당 하는 위에서 보이는 4 개의 층: 미디어, TILs, 밀도 그라데이션 매체, 및 종양 세포 펠 릿. 그림 2 다양 한 계층의 예를 참조 하십시오.
5. 모두 때까지 원심 종양 샘플 튜브 (5 분, 805 x g, 4 ° C)를 분리 하 고 삭제는 상쾌한.
6. Resuspend 200 µ L에 때까지 샘플 및 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 종양 펠 릿. 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에 계속.

3. 도금 및 얼룩

참고: 도금에 필요한 시간은 30 s/종양; 표면 얼룩에 필요한 시간은 1 시간; 세포내 얼룩에 필요한 시간은 40 분; 필요한 흐름 cytometry 분석-1 시간 4 분/종양.

1. 준비 하 고 얼룩 패널 및 셀에 대 한 추가 판 각 면역에 대 한 레이블 96 잘 U-하단 플레이트 계산.
   참고: 일반적으로, 3 개의 접시 준비가 총에서: 림프 구 집중 패널 판, 골수성 집중 패널 플레이트, 그리고 셀 수 접시.
2. Aliquot는 얼룩의 각 단일 셀 정지 패널 접시와 설정된 볼륨 수 접시에.
   참고: 카운트 접시 정확한 세포 인구 수 수 있도록 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 총 수를 계산 하는 데 사용 됩니다. 96 잘 접시 샘플링 및 volumetric 분석 기능 교류 cytometer 각 샘플 µ L 당 세포 수를 제공 하 고 그러므로, 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 수를 계산 수 있습니다. 수 판 고정 FACs 버퍼와 rinsing 4 ° C에서 하룻밤 후 다음 날 취득 될 수 있다 (인산 2% 식 염 수 (PBS) 버퍼링 FBS), FACs 버퍼의 설정된 볼륨에서 resuspending 및.
3. (5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 모든 무료 FBS를 제거 하려면 각 린스 사이 상쾌한 삭제 샘플 당 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 200 µ L로 두 번 셀 워시.
4. Fc 블록의 50 µ L 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플 혼합 및 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 추가
5. 2 x의 50 µ L 집중 extracellular 대상 항 체와 고칠 수 생존 얼룩 혼합물, 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 혼합 하 고 RT 또는 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어 추가
   참고: 정확한 착 조건 항 체에 대 한 제조업체의 지침에 따라 달라 집니다. 모든 얼룩 희석 DPBS, 고칠 수 생존 염료의 포화를 방지 하기 위해 아무 추가 FBS와 이어야 합니다. 이 원고에 사용 되는 착 색 패널의 최적의 희석에 대 한 테이블의 재료/장비 를 참조 하십시오. 항 체와 고칠 수 생존 솔루션 얼룩 얼룩 Fc 블록에 추가 될 때 전체 얼룩 볼륨 100 µ L에서 농도 x 최종 1을 2 배 농도에서 준비가 되어 있습니다.
6. (5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 각 린스 사이 supernatants 삭제 FACs 버퍼와 두 번 샘플을 씻으십시오.
7. 고정/permeabilization 솔루션 x 1의 200 µ L에서 resuspend 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 밤새 품 어.
   참고: 실험 일시 중지할 수 있습니다 하룻밤이 시점에서: 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 샘플을 계속.
8. 다음 날, 원심 판 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 그리고는 상쾌한 삭제.
9. Permeabilization 버퍼, 원심 분리기 (5 분, 805 x g, 4 ° C), x 1의 200 µ L로 한 번 헹 구 고는 상쾌한 삭제.
10. 1 x 집중된 세포내 항 체 얼룩 패널 1 x permeabilization 버퍼에 준비의 100 µ L을 추가 하 고 실시간 또는 (이 제조 업체에서 얼룩 권장 사항에 따라 달라 집니다) 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.
11. 1 x permeabilization와 버퍼 (5 분, 805 x g, 4 ° C), 상쾌한, 삭제 되 면 헹 구 고 린스 FACs 버퍼와 함께 두 번째 시간 (PBS 2 %FBS).
12. FACs 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend (PBS 2 %FBS), 교류 cytometry 튜브 샘플 전송 및 흐름 cytometry 분석 수행.

결과

우리의 결과 프로토콜에 설명 된 대로 비 면역 종양 구성 요소에서 분리 할 때의 중요 한 혜택을 보여 줍니다. 또한, 설립된 단단한 종양의 중요 한 면역학이 설명한 방법을 사용 하 여 설명 합니다.

많은 종양 분리 기술로 중요 한 문제는 가혹한 소화 조건 (즉, 높은 온도, 부적절 한 영양 공급, 등)의 결과로 수시로...

토론

에 다양 하 고 복잡 한 세포 구성 성분과 분자의 구성 됩니다. 최근 기록은이 환경의 정확한 특성 치료 성공 또는 실패의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다 식별할 수 있습니다 심지어 치료 저항 메커니즘 제안. 예를 들어 intratumoral 수준 (즉, MDSCs, T 규정 하는 세포, 등) 다양 한 면역 세포의 증가 이펙터 면역 반응을 완화를 immunotherapeutic 효과 파기 됩니다. 다른 한편으로, 이펙터 면역...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice	Jackson Laboratory	N/A	Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line	Acquired from collaborator	N/A	E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line
70% isopropyl alcohol	EMD Milipore	PX1840
Murine surgical tool kit	World Precision Instruments	MOUSEKIT	Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.
24-well plate	Denville Scientific Inc.	T1024	Or any 24-well flat bottom plate.
RPMI-1640 media	Sigma-Aldrich	R0883
Collagenase I	EMD Milipore	234153
Collagenase IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004189
DNase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Low Speed Orbital Shaker	BioExpress (supplier: Genemate)	S-3200-LS	Or any orbital shaker.
Thermoregulating incubator	Fisher Scientific	13-255-27	Or any other thermo-regulated incubator
FBS	Sigma-Aldrich	F8192
EDTA	AMRESCO	E177
1 mL Pipette and tips	Eppendorf	13-690-032	Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers	Fisher Scientific	22363547
50 mL Centrifuge Tubes	Denville Scientific Inc.	C1062-P
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific Inc.	C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles	BD	309604
Lymphoprep Density Gradient Medium	STEMCELL Technologies	7811
Transfer Pipettes	Denville Scientific Inc.	P7212
96-well U-bottom plates	Denville Scientific Inc.
DPBS	Sigma Aldrich	D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher Scientific	00-5523-00	Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Attune NxT Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For 96-well cell volumetric counting
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2	ThermoFisher Scientific	553141	Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	ThermoFisher Scientific	L34962	Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780	ThermoFisher Scientific	47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC	ThermoFisher Scientific	17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE	Santa Cruz Biotechnology	sc-53473
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700	ThermoFisher Scientific	56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5	ThermoFisher Scientific	15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450	ThermoFisher Scientific	48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC	ThermoFisher Scientific	17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE	ThermoFisher Scientific	12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	ThermoFisher Scientific	25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710	ThermoFisher Scientific	46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711	BD Biosciences	563755