纳米传感器检测体内蛋白酶活性的无创诊断

摘要

蛋白酶是严格调控的酶参与基本的生物学过程, 失调蛋白酶活动推动复杂疾病, 如癌症的进展。该方法的目的是创造纳米传感器, 以测量体内蛋白酶的活动, 产生一个可从宿主尿和歧视性疾病检测到的裂解信号。

摘要

蛋白酶是多功能酶, 专门研究肽键的水解和控制广泛的生物过程, 包括稳态和 allostasis。此外, 失调蛋白酶活性驱动发病机制, 是疾病的功能性生物标志物, 如癌症;因此, 检测体内蛋白酶活性的能力可以为生物医学诊断提供临床相关信息。该协议的目的是创造纳米传感器, 通过产生一个可量化的尿液信号, 探索体内蛋白酶的活性。这些蛋白酶纳米传感器由两个成分组成: 纳米粒子和基体。纳米微粒的作用是增加循环半衰期和基质输送到目标疾病地点。基板是一个短肽序列 (6-8 AA), 这是专门针对目标蛋白酶或一组蛋白酶。基体与纳米微粒的表面共轭, 并由记者 (如荧光标记) 终止, 用于检测。当失调蛋白酶切割肽基板时, 记者被过滤成尿液, 作为蛋白酶活性的生物标志物。本文描述了基质金属蛋白酶 9 (MMP9) nanosensor 的构建, 它与肿瘤的进展和转移有关, 用于在小鼠模型中检测大肠癌。

引言

蛋白酶是多功能酶, 专门研究肽键的水解, 对许多生物过程有显著的控制作用, 包括稳态、allostasis 和疾病¹。蛋白酶活性的改变状态与各种疾病相关, 包括癌症和心血管疾病, 使蛋白酶有吸引力的候选者发展成为临床生物标志物^2,3。此外, 蛋白酶活性在功能上与不同的梗死再发, 患者的结局和疾病的预后⁴。广泛地, 生物传感器被开发用于检测各种生物学现象和疾病, 如癌症, 神经退行性疾病, 电子转移过程^5,6,7,8,9. 更具体地说, 以基板为基础的蛋白酶传感器用于检测蛋白酶活性, 包括荧光探针, 用于诊断成像¹⁰和 isotopically 标记的肽基片体外质谱检测¹¹。此外, 还开发了基于活动的探针, 其中含有与基片类似的区域, 可以约束或修改目标蛋白酶¹²。采用这种方法, 当活性部位改变时, 目标蛋白酶不可逆转地受到抑制, 分析需要组织的收获, 这限制了体内的应用。然而,在体内对蛋白酶活性的感知是很重要的, 因为对蛋白酶活性的调节严重依赖于其他生物活动的上下文, 如内源性抑制剂的存在。

这项工作的目的是描述以活动为基础的纳米传感器的配方, 通过产生一个可测量的尿液来检测体内蛋白酶的活性。这个平台被用来作为一种无创诊断, 以鉴别复杂的疾病, 如癌症, 使用失调蛋白酶活动作为功能生物标志物。我们的 nanosensor 平台由氧化铁纳米粒子 (IONP) 与蛋白酶基体结合而成。这些基底被一个荧光记者终止, 当蛋白酶切割基体时释放。这些 IONPs在体内循环, 定位到疾病部位, 并暴露基质到活性疾病相关的蛋白酶。乳沟后, 荧光记者被释放, 由于其体积小, 被过滤成尿液, 而 uncleaved 基质上的 IONP 留在体内。因此,体内蛋白酶活性的增加会导致尿液中的记者浓度增高 (图 1)。由于我们的平台是尿液测试, 不需要成像平台和诊断信号丰富的尿液。

这个平台可以被设计来检测各种疾病, 包括癌症, 纤维化, 血栓形成^13,14。在这里, 我们描述了纳米传感器的设计, 以检测基质 metallopeptidase 9 (MMP9) 活性作为结直肠癌的生物标志物的海拔。大肠癌是美国癌症死亡的第二大原因, 估计仅在2014年就有136800例新病例和50300人死亡.结直肠肿瘤细胞产生 MMP9, 这已经显示出推动恶性进展, 基质退化, 以及转移¹⁶。此外, 我们确定了一个合适的肽基质 (PLGVRGK) 为 MMP9 从文献¹⁷。该平台可用于早期癌症检测和低成本的护理点诊断^{13,14,18,19,20,21}。

图 1:体内Nanosensor 活动示意图.纳米传感器循环通过身体和本地化到疾病的地点。然后, IONPs 提出了与疾病相关的蛋白酶劈裂肽基。切割碎片的大小允许肾脏清除, 导致他们在尿中定位。在动物小便后, 这些肽片段可以通过他们的记者分子来分析。请单击此处查看此图的较大版本.

研究方案

在研究机构的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的机构批准是进行以下动物实验的必要。此外, 标准的动物保育设施 (例如,住房室、无菌的动物罩、麻醉的 isofluorane 室和为道德端点 euthanization 的 CO₂室) 是必要的, 以便适当地执行这些实验。对这些设施的特殊培训和协助可以由一个机构的生理学研究实验室提供。所有的动物工作都是通过 IACUC 在佐治亚理工大学 (礼宾: A14100) 批准的。

1. 氧化铁纳米颗粒 (IONP) 合成

注: 安全: 整个氧化铁纳米颗粒的合成应使用个人防护设备和在化学油烟机下面。

1. 在一个15毫升圆锥管, 冷却1毫升30% 氢氧化铵在一个冰桶30分钟。
2. 用去离子水洗250毫升锥形瓶, 加入10毫升双蒸馏水 (ddH₂O)。将瓶子的外面浸入一个放在搅拌/热板上的冰浴中。使用塑料吸管将 N₂气体流动到瓶中的 ddH₂O。气泡15分钟, N₂到 deoxygenate。
3. 称224µmol (4.5 克) 葡聚糖 (分子量 (兆瓦) = 20 kDa) 为50毫升圆锥管。添加 H₂O, 使混合物的最终体积, 包括葡聚糖, 是20毫升。漩涡大力溶解葡聚糖。
4. 将290µmol (78.5 克) 的氯化铁 (III) 的重量加到六水合物中, 加入葡聚糖溶液和涡旋溶解。
5. 通过0.2 µm 筛选器筛选结果解决方案。
6. 将1毫升冷却氢氧化铵转化为9毫升的脱氧水。返回到4°c。
7. 重367µmol (73.0 克) 的氯化铁 (II), 溶解在1毫升无氧 ddH₂O, 并过滤通过0.2 µm 过滤器。
8. 将葡聚糖铁 (III) 溶液转化成250毫升锥形瓶和 deoxygenate, 在冰上15分钟。与 1600 rpm 旋转的磁力搅拌杆混合。
9. 要创造一个均匀的氮气气氛, 用橡胶隔膜盖上烧瓶。用18口径的针刺穿隔膜, 将₂到烧瓶中流动。插入一个单独的18测量针作为流量出口。
10. 添加467µL 的铁 (II) 溶液的葡聚糖铁 (III) 溶液与1毫升注射器, 搅拌与磁搅拌杆在 1600 rpm。铁 (II) 与铁 (III) 的比值导致了平衡反应, 将产生磁铁矿, 或 Fe₃O₄。
11. 加入冷稀释氢氧化铵滴入铁 (II)-铁 (III)-葡聚糖溶液, 以启动成核过程²¹。确保每个液滴在掉入另一粒之前混合良好。在加入1-2 毫升氢氧化铵后完成反应。
12. 停止流动的 N₂和消除橡胶隔膜。除去冰浴, 用温水浴代替, 同时继续搅拌溶液。确保溶液的温度达到75摄氏度, 孵育75分钟。
13. 从搅拌/热板中取出烧瓶, 然后通过0.2 µm 0.1 µm 过滤器将溶液加倍过滤, 去除粗颗粒。
14. 缓冲液将微粒转化成 ddH₂O, 使用 100 kDa 分子量切断 (m.w.c.) 选矿厂, 从溶液中去除多余的葡聚糖, 这应该是非常粘性的。如果在 2-3 旋转之后, 即使流通过仍然是暗的, 则替换筛选器, 这表明筛选器可能已损坏。
    1. 要使用自旋过滤器进行缓冲交换, 离心机在4°c 4800 X g 处15分钟, 丢弃流程, 并向 IONP 解决方案中添加新缓冲区。重复3-5 次。
15. 用分光光度计/平板阅读器测定纳米粒子的浓度。吸光度测量在400毫微米和使用 IONP 的摩尔吸收率在这个波长 (ε = 2.07 x 10⁶ cm^-1 M^-1) 确定 IO 微粒的浓度。
16. 并用重悬 IONPs 到10毫克/毫升在 ddH₂O (通常总体积是 ~ 3 毫升), 并确保使用聚丙烯管这一步骤的化学相容性。添加1.6 卷5米氢氧化钠, 然后添加0.65 容量的环氧氯丙烷。严格混合在室温下的平板振动筛12小时, 以交联葡聚糖。
17. 使用一个20毫升注射器与一个18口径的针将 IONP 溶液转移到 50 kDa m.w.c. 透析膜。将透析膜放入4升 ddH₂o, 并更换 H₂o 数次 (每 2-3 小时)。孵化过夜。
18. 测量浓度, 使 IONPs 5 毫克/毫升 (见步骤 1.15)。加入氢氧化铵达到 20% (v/v), 在室温下摇动 > 12 小时, aminate IONPs 表面。使用 30 kDa m.w.c. 过滤器进行缓冲交换 (见 1.14)。
19. 用快速蛋白液相色谱法 (FPLC) 在最终纯化前, 将音量调低至 2.5-3.5 毫升; 见凝胶过滤柱材料表)。
20. 使用动态光散射 (dl) 确定 IONPs 的水动力半径 (预期范围 10-100 nm, 平均大小 40-50 nm)。这样做, 通过 aliquoting 1 毫升100X 稀释 IONP 样品在试管, 在机器的地方, 并使用制造商的软件采取的测量。
    注: IONPs 的总人口将在10和100毫微米之间由 dl 测量, 但多数人口是在平均直径附近, 范围从 40-50 毫微米。如果你想要限制大小范围, 你可以进一步使用大小排除色谱分离分数以不同的直径。IONPs 应存放在4摄氏度。

2. 肽的设计, 共轭到 IONP, 并在体外验证

1. 合成一种多肽基质 (例如,由核心设施或商业) 的目标蛋白酶与 n-终端荧光记者, 如荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 和 C 末端半胱氨酸残渣, 以允许硫醇介导的耦合。
   注: 在本研究的情况下 MMP9, 使用的肽是 FITC-PLGVRGK C, 与 k_猫/k_m ~ 2.0 x 10⁵ m^-1s^-1。
2. 整除0.5 毫克的 IONP (1 毫克/毫升) 和缓冲交换成耦合缓冲 (50 毫米硼酸钠与1毫米 EDTA, pH = 8.5) 使用 10 kDa m.w.c. o. 旋转过滤器 (见步骤 1.14)。
3. 溶解琥珀酰亚胺碘乙酸 (新加坡) 在甲基酰胺 (DMF) 达到浓度为30毫克/毫升, 并增加新加坡航空 IONP 摩尔比500新加坡航空: IONP。
   注意: 新加坡航空是一种 heterobifunctional 交叉链接器, 它介导胺类在 IONPs 上的偶联与肽基板上的巯基团。
4. 在黑暗的室温下孵育 1-2 小时。如果一夜之间离开, 孵育4摄氏度。
5. 使用 10 kDa m.w.c. 旋转过滤器将缓冲区交换到耦合缓冲区中以删除反应 (参见步骤 1.14)。
6. 将最终产品解决方案带到1毫克/毫升 (0.5 毫升溶液)。将感兴趣的肽与 90:1 (肽: IONP) 的摩尔比与 20 kDa 硫醇终止的聚乙二醇 (peg) 混合, 摩尔比为 20:1 (peg: IONP)。将这种肽 PEG 溶液与 IONP 混合。
7. 在室温下以最高速度在平板振动筛上孵化, 以防止荧光分子漂白。
8. 添加 l-半胱氨酸的摩尔比为 500:1 (C: IONP), 以中和任何反应的新加坡航空分子。在室温下以最高速度在25摄氏度上孵育1小时。
9. 通过 FPLC 净化 (见 1.1.19)。使用分光光度计测量样品溶液的吸光度, 并计算肽: IONP 比根据以下。提纯后, 在 PBS 的4摄氏度贮存1毫克/毫升的产品。
   1. 使用分光光度计测量样品溶液在 400 nm (_sample,400) 的吸光度, 以及荧光所用的最大吸光度波长, 为 FITC (_sample,488) 的 488 nm。测量同一两个波长 (400 nm 和 488 nm) 的股票胺 IONP 溶液的吸光度, 分别表示为_NP,400和_NP,488。
   2. 使用等式1和2计算规范化的₄₀₀和₄₈₈值。
      等式1
      等式2
   3. ₄₀₀和₄₈₈表示样本的归一化值。使用这些值计算肽的比率: IONP 与等式3。
      等式3
   4. IONP 和荧光的摩尔 absorptivities 分别在哪里和哪里。为这些微粒 = 2.06 x 10⁶ M^-1cm^-1和为 FITC = 7.2万 M^-1cm^-1, 因此价值应该是28.75。典型肽: IONP 比应在20:1 到50:1 的范围内。
10. 通过进行体外裂解试验验证探针的功能。
    1. 与 PBS (1% BSA), 使一个18µL 纳米粒子溶液与 200 nM 浓度的肽。混合2µL 的蛋白酶的兴趣 (MMP9; 0.1-1 毫克/毫升)。
    2. 在37摄氏度的平板阅读器中孵育1小时, 进行荧光测量 (使用适当的激发和发射波长, 分别为 FITC 485 nm 和 528 nm), 每 1-2 分钟来监测裂解。

3. 癌症的纳米传感器和尿检管理

注: 有关示例模型的详细信息, 请参阅我们以前的报告¹³。

1. 建立一个新陈代谢的笼子, 通过确保一个圆柱套到96井板顶部的尿收集。在收集尿液时, 将一只老鼠放在袖子内, 用培养皿盖盖住, 以防动物逃跑。
2. 在无菌盐水中, 用肽在3000毫克/千克 (~ 50 µmol) 的浓度下, 准备注射液 (200 µL 最大容积)。
3. 在雌性, 8 周大的裸鼠, 携带异种 LS174T 大肠肿瘤的负担约100-300 毫米³, 这应该发生在大约10天, 通过尾静脉注射管理 nanosensor 溶液。注射后立即将老鼠放入新陈代谢的笼子里, 注意每只老鼠注射的时间。
4. 注射后 60-90 分钟, 从96井板中取出圆柱套筒。抑制小鼠, 对膀胱施加轻微的压力, 诱导小鼠将剩余的尿液放到盘子里。收集所有尿液 (200-500 µL)。
5. 通过免疫沉淀分析尿样, 从尿液中纯化 FITC, 提高灵敏度。使用磁性珠子加上抗 FITC 抗体。
   1. 首先, 用涂层缓冲器清洗25毫克的磁珠3次, 并将最终体积带到225µL。
      注意: 要使涂层缓冲 (0.1 米硼酸钠) 是很重要的, ph 值 9.5), 阻断缓冲 (pbs, 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, pH 7.4) 和洗涤缓冲 (PBS, 0.1% BSA, 0.05% Tween-20, pH 7.4) 每次新鲜, 每一个大约20毫升是必要的。
   2. 添加200µL 抗 FITC (5 毫克/毫升) 和200µL 硫酸铵 (3 米)。在旋转的 37 C 上孵育16-24 小时。
   3. 将解决方案添加到磁选机上, 取出上清, 替换为625Λ阻塞缓冲器, 并在一夜之间孵化 37 C。然后用洗涤缓冲器清洗3次, 然后在1.25 毫升的洗涤缓冲器中储存。
   4. 孵化2µL 尿与5µL 磁性珠 (20 毫克/毫升) 和带来到总容量到50µL 与 PBS (0.01% 吐温 20)。孵育60分钟。
   5. 每洗一次后, 用磁选机将50µL PBS (0.01% 吐温 20) 洗两次, 收集磁性珠子。
   6. 洗脱两次, 32.5 µL 5% 冰乙酸。中和池洗脱 (70 µL) 与35µL 2 米三, 以达到最终的 pH 值为7。
   7. 阅读在一个板块阅读器 (见材料表) 在适当的激发和发射波长, 以量化尿荧光。计算荧光记者对已知的自由荧光浓度阶梯的浓度。

结果

IONPs 的人口的多数是在平均直径附近, 范围从 40-50 毫微米。在聚乙二醇化之后, 这个大小范围有循环半衰期大约6小时¹³ 在体内(参见图 2a)。如果你想选择一个特定的大小范围, 你可以使用大小排除色谱分离 IONP 分数与不同的直径。纳米粒子的透射电镜将显示为单独的球形氧化铁纳米粒子交联在一起的外层葡聚糖。^...

讨论

该方法描述了由共轭纳米粒核的蛋白酶基质组成的活性纳米传感器的发展。蛋白水解的事件被称为 "药代动力学开关", 因为裂解肽产品小于肾脏大小的过滤限制5毫微米²³和过滤成尿产生无创信号。因此, 重要的是使用纳米粒子或载体的水动力半径大于 5 nm, 因为任何更小的将被肾脏迅速清除和混淆尿信号。我们使用 pegylated IONPs, 因为他们是 FDA 批准, 耐受性好, 并有循环半衰期 3-5 小...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm syringe filters	VWR	4652
18G needle	VWR	89134-024
15 mL conicals	VWR	89039-670
250 mL Erlenmeyer flask	VWR	89000-362
Stir bar	VWR	58949-006
Hot Plate/Magnetic Stirrer	VWR	97042-634
Glacial acetic acid	VWR	97064-482
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Thermo Fisher	A13100
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma	236489
Iron (II) chloride tetrahydrate	Sigma	44939
Epichlorohydrin	Sigma	45340-500ML-F
DMF	Sigma	D4551
Ammonium Hydroxide	Sigma	320145-500ML
Sodium Hydroxide pellets	Sigma	221465-500G
EDTA	Sigma	E9884
Sodium Borate	Sigma	B9876
L-Cysteine	Sigma	168149-100G
Tris-HCl	Sigma	T5941
Tris base	Sigma	T6066
PBS tablets	Sigma	P4417
Dextran	Pharmacosmos	5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk	Millipore	UFC901024
Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk	Millipore	UFC903024
Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk	Millipore	UFC910024
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	NanoZS
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette	LifeTech	66130
Dynabeads MyOne Tosylactivated	LifeTech	65501
SIA	Life Tech	22349
PEG 20k	Laysan Bio	MPEG-SH-20K-1g
Fluorescein Antibody [2A3]	GeneTex	GTX10257
Hiload 16/600 superdex 200	GE Healthcare	45-002-490
Plate Reader	Fisher	BTCYT5M
BD Insulin Syringes	Fisher	NC0872854