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Neste Artigo

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Resumo

Proteases são rigidamente regulamentadas enzimas envolvidas em processos biológicos fundamentais e desregulação protease atividade unidades de progressão de doenças complexas como câncer. O objetivo do método é criar nanosensors que medem protease atividade na vivo , produzindo um sinal de clivagem que é detectável de urina de anfitrião e discrimina a doença.

Resumo

Proteases são enzimas multi-funcional que especializa-se na hidrólise das ligações peptídicas e controlam grandes processos biológicos incluindo a homeostase e allostasis. Além disso, a atividade de protease de desregulação drives patogênese e é um biomarcador funcional de doenças como o câncer; Portanto, a capacidade de detectar protease atividade na vivo pode fornecer informações clinicamente relevantes para diagnósticos biomédicos. O objetivo do presente protocolo é criar nanosensors que sondam protease atividade na vivo , produzindo um sinal quantificável na urina. Estes nanosensors da protease consistem em dois componentes: uma de nanopartículas e substrato. As funções de nanopartículas para aumentar a circulação Half-Life e substrato entrega doença nos sites de destino. O substrato é uma sequência do peptídeo curto (6-8 AA), que é projetada para ser específico para uma protease alvo ou grupo de proteases. O substrato é conjugado com a superfície da nanopartículas e é terminado por um repórter, como um marcador fluorescente, para a deteção. Como desregulação proteases fendem o substrato de peptídeo, o repórter é filtrado na urina para quantificação como um biomarcador de atividade de protease. Neste documento descrevemos a construção de um nanosensor para matriz metaloproteinase 9 (MMP9), que está associado a progressão do tumor e metástases, para detecção do câncer colorretal em um modelo do rato.

Introdução

Proteases são enzimas multi-funcional que especializa-se na hidrólise das ligações peptídicas e tem um controlo significativo sobre muitos processos biológicos, incluindo a homeostase, allostasis e doença1. Um estado alterado de atividade de protease tem sido correlacionado a uma variedade de doenças, incluindo câncer e doenças cardiovasculares, tornando atraente candidatos de proteases para desenvolvimento em biomarcadores clínicos2,3. Além disso, a atividade de protease é pathogeneses funcionalmente vinculados a distintos, os resultados dos pacientes e prognóstico da doença4. Amplamente, biosensores foram desenvolvidos para detectar vários fenômenos biológicos e doenças, como câncer, doenças neurodegenerativas e transferência de elétrons processa5,6,7,8 , 9. mais especificamente, sensores de protease baseada no substrato foram desenvolvidos para detectar atividade de protease e incluem fluorogenic sondas para diagnóstico por imagem10 e desvendar rotulados substratos de peptídeo para in vitro deteção por espectrometria de massa11. Além disso, baseado na atividade sondas têm sido desenvolvidas, que contêm o substrato, como regiões que ligam ou modificar o destino protease12. Com este método, a protease alvo é irreversivelmente inibida quando o sítio ativo é modificado, e análise requer a colheita de tecidos, que limita em vivo aplicações. No entanto, é importante sentir protease atividade na vivo, porque a regulação da atividade de protease é fortemente dependente do contexto de outras atividades biológicas, tais como a presença de inibidores endógenos.

O objetivo deste trabalho é descrever a formulação de nanosensors actividades que detectam protease atividade na vivo , produzindo um sinal mensurável na urina. Esta plataforma é usada como um diagnóstico não-invasivo para discriminar doenças complexas como câncer, usando a atividade de protease de desregulação como biomarcador funcional. Nossa plataforma de nanosensor consiste em nanopartículas de óxido de ferro (IONP) conjugadas com substratos da protease. Estes substratos são terminados por um repórter fluorescente que é liberado quando proteases fendem o substrato. Estes IONPs circulam na vivo, localizar sites de doença e expõem os substratos de proteases associada a doença ativas. Após a clivagem, repórteres fluorescentes são liberados e, devido ao seu pequeno tamanho, são filtrados na urina, enquanto os substratos uncleaved sobre a IONP permanecem no corpo. Portanto, um aumento em protease atividades na vivo resultará em concentrações mais altas de repórter na urina (Figura 1). Desde que nossa plataforma é um teste de urina, sem plataforma de imagem é necessária e sinais de diagnóstico são enriquecidos na urina.

Esta plataforma pode ser projetada para detectar uma variedade de doenças, incluindo câncer, fibrose e trombose13,14. Aqui descrevemos o projeto de nanosensors para detectar elevações em Matrix metallopeptidase 9 (MMP9) atividade como um biomarcador de câncer colorretal. O câncer colorretal é a segunda causa principal de morte por cancro nos Estados Unidos, com uma estimativa 136.800 novos casos e 50.300 mortes em 2014 só15. Células de tumor colorretal produzem MMP9, que foi mostrado para conduzir a progressão maligna, degradação de matriz, bem como metástase16. Além disso, nós identificamos um substrato adequado do peptide (PLGVRGK) para MMP9 da literatura17. Esta plataforma pode ser utilizada para detecção precoce de câncer e de baixo custo point-of-care diagnósticos13,14,18,19,20,21.

figure-introduction-4413
Figura 1: esquemático da Nanosensor atividade In vivo. Nanosensors circular através do corpo e localizar a locais de doença. Em seguida, doença relacionada com proteases cleave substratos de peptídeo apresentados pela IONPs. O tamanho dos fragmentos clivados permite a compensação renal, levando-os a localizar na urina. Depois que o animal urina, esses fragmentos de peptídeo podem ser analisados por sua molécula repórter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Aprovação institucional do cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) na instituição do pesquisador é necessária efectuar as seguintes experiências com animais. Além disso, instalações de cuidados de animais padrão (por exemplo, câmaras, capas de animais esterilizadas, isofluorano câmaras para anesthetization e CO2 câmaras para eutanásia de ponto de extremidade ética de habitação) são necessárias efectuar correctamente estas experimentos. Formação especial e assistência com estas instalações podem ser fornecidos pelo laboratório de pesquisa fisiológica (PRL) a instituição. Todo o trabalho animal foi aprovado pelo IACUC na Georgia Tech (protocolo: A14100).

1. síntese de nanopartículas (IONP) de óxido de ferro

Nota: Segurança: A síntese de nanopartículas de óxido de ferro inteira deve ser realizada utilizando equipamentos de proteção individual e por baixo de uma substância química fumos capuz.

  1. Em um tubo cônico de 15 mL, acalme-se 1 mL de hidróxido de amônio 30% em um balde de gelo por 30 min.
  2. Lavar um 250 mL frasco de Erlenmeyer com água desionizada e adicionar 10 mL de água destilada dobro (ddH2O). Submergi o exterior do frasco em um banho de gelo, descansando em um prato misture/calor. Use uma pipeta plástica de gás de fluxo N2 o ddH2O no frasco. Bolha para 15 minutos com N2 para deoxygenate.
  3. Pesar de 224 µmol (4,5 gramas) de dextrano (Peso Molecular (MW) = 20 kDa) em um tubo cónico de 50 mL. Adicione H2O tal que o volume final da mistura, incluindo o dextrano, é de 20 mL. Vórtice vigorosamente para dissolver o dextrano.
  4. Pesa 290 µmol (78,5 gramas) de cloreto de ferro (III) hexaidratado, adicionar a solução de dextran e vórtice para dissolver.
  5. Filtre a solução resultante através de um filtro de 0,2 µm.
  6. Transferi 1 mL refrigerada de hidróxido de amônio em 9 mL de água pobre em oxigênio. Retornar a 4 ° C.
  7. Pesar de 367 µmol (73,0 gramas) de tetra cloreto de iron(II), dissolver em 1 mL de oxigênio livre ddH2O e filtrar através de um filtro de 0,2 µm.
  8. Transferir a solução de dextran-iron(III) para o Erlenmeyer de 250 mL e deoxygenate com N2 por 15 minutos no gelo. Misture com uma agitação magnética bar girando a 1600 rpm.
  9. Para criar uma atmosfera de nitrogênio homogênea, tampa do frasco com um septo de borracha. Perfuração do septo com um 18 gauge agulha para fluxo N2 para o balão. Inseri uma agulha de 18 calibre separadas como uma saída de fluxo.
  10. Adicione 467 µ l da solução de iron(II) para a solução de dextran-iron(III) com uma seringa de 1 mL, mexendo com uma barra de agitação magnética em 1600 rpm. Esta proporção de iron(II) de ferro (III) resulta em uma reação equilibrada que irá produzir magnetita, ou Fe3O4.
  11. Adicione que o refrigerados diluir hidróxido de amônio gota a gota para a solução de dextran de ferro (II) - ferro (III) - para iniciar o processo de nucleação21. Certifique-se que cada gota mistura-se bem antes de cair em outro. Termine a reação após a adição de 1 a 2 mL de hidróxido de amónio.
  12. Parar o fluxo de N2 e remover o septo de borracha. Remova o banho de gelo e substituir com um banho de água quente, continuando a agitar a solução. Certifique-se de que a temperatura da solução atinja 75 ° C e incube por 75 minutos.
  13. Retirar o frasco da placa de agitação/quente e duplamente, filtrar a solução através de 0,2 µm depois 0.1 µm filtros para remover as partículas grosseiras.
  14. Buffer de trocar as partículas em ddH2O, usando 100 peso molecular de kDa cortar concentradores (m.w.c.o.) para remover o excesso dextran da solução, que deve ser muito viscosa. Substitua os filtros se o fluxo através de permanece escuro mesmo após 2-3 rodadas, que indica que o filtro pode ter quebrado.
    1. A troca de buffer com filtros de rotação, centrifugar a 4 ° C no 4800 X g durante 15 minutos, descarte o escoamento e adicionar novo buffer para a solução IONP. Repita 3 - 5 vezes.
  15. Determine a concentração das nanopartículas utilizando um espectrofotômetro/leitor. Tomar medidas de absorvância a 400 nm e uso a absorvência molar de IONP neste comprimento de onda (ε = 2,07 x 106 cm-1 M-1) para determinar a concentração de partículas de IO.
  16. Resuspenda os IONPs a 10 mg/mL em ddH2O (geralmente volume total é ~ 3 mL) e certifique-se de usar tubos de polipropileno para esta etapa para compatibilidade química. Adicione 1,6 volumes de 5 M de NaOH e, em seguida, adicione 0,65 volumes de epicloridrina. Rigorosamente misture num agitador de placa à temperatura ambiente por 12 horas para crosslink dextrano.
  17. Use uma seringa de 20 mL com uma agulha de 18 gauge para transferir a solução IONP para a membrana de diálise de m.w.c.o. de 50 kDa. Coloque a membrana de diálise em 4L ddH2O e substituir o H2O algumas vezes (a cada 2-3 horas). Incube durante uma noite.
  18. Medir a concentração e trazer IONPs para 5 mg/mL (ver passo 1.15). Adicione hidróxido de amônio para alcançar 20% (v/v) e agitar à temperatura ambiente durante > 12 horas para aminate a superfície de IONPs. Troca de amortecedor usando 30 filtros de m.w.c.o. kDa (ver 1.14).
  19. Ajuste o volume até 2.5-3.5 mL antes da purificação final por rápido proteína cromatografia líquida (FPLC; ver Tabela de materiais para coluna de filtração de gel).
  20. Use Difusão dinâmica da luz (DLS) para determinar o raio hidrodinâmico de IONPs (intervalo esperado 10-100 nm, tamanho médio 40 a 50 nm). Para fazer isso, alíquotas de 1ml de 100 X amostra IONP diluída em uma cubeta, coloque na máquina e usar o software do fabricante para fazer a medição.
    Nota: A população total de IONPs será entre 10 e 100 nm, através de medições de DLS, mas a maioria da população é em torno do diâmetro médio, que varia de 40 a 50 nm. Se alguém quiser limitar o intervalo de tamanho, uma mais pode usar cromatografia de exclusão para isolar frações com diferentes diâmetros. IONPs devem ser armazenados a 4 ° C.

2. o peptídeo Design, conjugação de IONP e In Vitro de validação

  1. Sintetiza um substrato de peptídeo (por exemplo, por uma instalação de núcleo ou comercialmente) para uma protease alvo com um repórter fluorescente do N-terminal como o isotiocianato de fluoresceína (FITC) e um resíduo de cisteína terminal C para permitir acoplamento thiol-mediada.
    Nota: No caso deste estudo para MMP9, o peptídeo usado foi FITC-PLGVRGK-C, com kgato/km ~ 2,0 x 105 M-1s-1.
  2. Alíquota 0,5 mg de IONP (a 1 mg/mL) e troca de amortecedor em tampão de ligação (borato de sódio de 50 mM com 1 mM de EDTA, pH = 8,5) usando um giro de m.w.c.o. kDa 10 filtro (ver passo 1.14).
  3. Dissolver grufo sódioe (SIA) em dimetilformamida (DMF) para atingir uma concentração de ~ 30 mg/mL e adicionar SIA a IONP na proporção de 500 SIA:IONP mole.
    Nota: SIA é uma heterobifunctional Cruz vinculador que medeia o acoplamento de aminas na IONPs aos grupos sulfidrila no substrato do peptide.
  4. Incube durante 1-2 horas à temperatura ambiente no escuro. Se sair a noite, incubar a 4 ° C.
  5. Exchange usando um filtro de rotação de m.w.c.o. 10 kDa em tampão de ligação para remover SIA não tenha reagido de buffer (consulte a etapa 1.14).
  6. Trazer a solução do produto final a 1 mg/mL (0,5 mL de solução). Misture o peptídeo de interesse em uma relação molar de 90:1 (peptídeo: IONP) com 20 kDa thiol-encerrado polietileno glicol (PEG) em uma relação molar de 1:20 (PEG: IONP). Misture esta solução de peptídeo-PEG com IONP.
  7. Incube durante uma noite à temperatura ambiente num agitador de placa na velocidade mais alta, cobrindo os tubos em folha para evitar fotobranqueamento de moléculas fluorescentes.
  8. Adicione L-cisteína em uma relação molar de 500: 1 (C:IONP) para neutralizar qualquer moléculas SIA não tenha reagidas. Incube durante 1 hora a 25 ° C, um agitador na velocidade mais alta à temperatura ambiente.
  9. Purificar através de FPLC (ver 1.1.19). Use um espectrofotômetro para medir a absorvância da solução da amostra e calcular a proporção de peptídeo: IONP de acordo com o seguinte. Após a purificação, armazene o produto em 1 mg/mL a 4 ° C em PBS.
    1. Use um espectrofotômetro para medir a absorvância da solução da amostra em 400 nm (umaamostra, 400) e o comprimento de onda de absorbância máxima para o fluoróforo usado, que é de 488 nm para FITC (umaamostra, 488). Medir a absorvância de uma solução IONP de estoque amina no mesmos dois comprimentos de onda (400 nm e 488 nm), que respectivamente são representados como umNP, 400 e umNP, 488.
    2. Use as equações 1 e 2 para calcular o normalizado A400 e um valores de488 .
      figure-protocol-9239Equação 1
      figure-protocol-9317Equação 2
    3. Uma400 e um488 representam os valores normalizados da amostra. Use esses valores para calcular a proporção de peptídeo: IONP com a equação 3.
      figure-protocol-9570Equação 3
    4. Onde figure-protocol-9661 e figure-protocol-9729 são os molares absorptivities do IONP e o fluoróforo, respectivamente. Para estas partículas figure-protocol-9888 = 2,06 x 106 M-1cm-1 e para FITC figure-protocol-10020 = 72.000 M-1cm-1, então o valor de figure-protocol-10143 deve ser 28,75. Rácios de peptídeo típico: IONP devem estar no intervalo de 20:1 a 50: 1.
  10. Valide a funcionalidade das sondas através da realização de um ensaio de clivagem em vitro .
    1. Com PBS (1% BSA), fazer uma solução de nanopartículas de 18 µ l com concentração de 200 nM de peptídeo. Misture com 2 µ l de protease de interesse (MMP9; 0,1 - 1 mg/mL).
    2. Incubar em um leitor de placas a 37 ° C durante 1 hora, a medição de fluorescência (usando o apropriado da excitação e comprimentos de onda de emissão, que são 485 nm e 528 nm para FITC, respectivamente) cada 1-2 minutos para monitorar a clivagem.

3. administração de Nanosensors e urina de detecção do câncer de

Nota: Para obter mais detalhes sobre o modelo de exemplo, consulte nosso anterior relatório13.

  1. Crie uma gaiola metabólica para coleta de urina fixando uma luva cilíndrica ao topo de uma placa bem 96. Durante a coleta de urina, coloca um rato dentro da manga e cubra com uma tampa da placa de Petri para evitar a fuga do animal.
  2. Prepare uma solução de injeção (volume máximo de 200 µ l), contendo nanosensors em uma concentração de 3000 mg/kg (~ 50 µmol), peptídeo em soro fisiológico estéril.
  3. Em ratos fêmeas, 8 - semanas de idade, nus, rolamento xenoenxertos de tumores colorretais LS174T em um fardo de ~ 100-300 mm3, que deve ocorrer em aproximadamente dia 10, administrar solução de nanosensor através da injeção de veia de cauda. Imediatamente após a injeção, coloque os ratos em gaiolas metabólicas e observe o tempo de injeção para cada rato.
  4. 60-90 minutos após a injeção, remova luva cilíndrica da placa de 96 poços. Controle do mouse e aplique uma ligeira pressão sobre a bexiga para induzir ratos para anular qualquer urina restante na chapa. Colete toda urina (200-500 µ l).
  5. Analise amostras de urina por imunoprecipitação para purificar FITC da urina e aumentar a sensibilidade. Uso de grânulos magnéticos juntamente com anticorpos anti-FITC.
    1. Primeiro, lave 25mg dos grânulos magnéticos 3 vezes com tampão de revestimento e trazer o volume final a 225 µ l.
      Nota: É importante fazer o buffer de revestimento (borato de sódio 0,1 M, pH 9.5), tampão de bloqueio (PBS, BSA de 0,5%, 0,05% Tween-20, pH 7,4) e tampão de lavagem (PBS, BSA de 0,1%, 0,05% Tween-20, pH 7,4) fresco de que cada vez e cerca de 20 mL de cada um são necessário.
    2. Adicione 200 µ l de anti-FITC (5 mg/mL) e 200 µ l de sulfato de amônio (3 M). Incube durante 16 a 24 horas a 37 ° C em rotacao.
    3. Adicionar a solução para um separador magnético, remover o sobrenadante, substituir com 625 figure-protocol-12983 Λ bloqueio de buffer e incubar a 37 ° C durante a noite. Em seguida, lavar 3 vezes com tampão de lavagem e armazenar em 1,25 mL de tampão de lavagem.
    4. Incubar a 2 µ l de urina com 5 µ l de grânulos magnéticos (20 mg/mL) e trazer para um volume total de 50 µ l com PBS (0,01% Tween 20). Incube durante 60 min.
    5. Lave duas vezes com 50 µ l PBS (0,01% Tween 20) usando um separador magnético para coletar esferas magnéticas depois de cada lavagem.
    6. Eluir duas vezes com 32,5 µ l de ácido acético glacial a 5%. Neutralize a eluição em pool (70 µ l) com 35 µ l de 2 M Tris para atingir um pH final de ~ 7.
    7. Li em um leitor de placas (ver Tabela de materiais) em comprimentos de onda adequados de excitação e emissão de quantificar fluorescência de urina. Calcule a concentração de repórter fluorescente contra uma escada de concentrações conhecidas de fluoróforo livre.

Resultados

A maioria da população das IONPs é em torno do diâmetro médio, que varia de 40 a 50 nm. Após pegylation, nesta faixa de tamanho tem uma meia-vida de circulação de aproximadamente 6 horas13 na vivo (ver Figura 2a). Se alguém quiser selecionar para uma série de determinado tamanho, um pode usar cromatografia de exclusão para isolar frações IONP com diâmetros diferentes. As nanopartículas pela TEM aparecerá como ...

Discussão

Este método descreve o desenvolvimento de actividades nanosensors consistindo de substratos de protease, conjugados com um núcleo de nanopartículas. O evento de clivagem proteolítica é apelidado do "interruptor farmacocinético", porque produtos clivados peptídeo são menores do que o limite de tamanho renal de filtragem de 5 nm23 e filtro na urina para produzir um sinal não-invasivo. Portanto, é importante usar nanopartículas ou transportadoras com um raio hidrodinâmico maior que 5 nm, ...

Divulgações

Dr. Kwong é co-fundador e serve como consultor para o Glympse Bio, que está desenvolvendo produtos relacionados com a pesquisa descrita neste trabalho. Este estudo pode afetar sua situação financeira pessoal. Os termos desse acordo foram revistos e aprovados pela Georgia Tech em conformidade com suas políticas de conflito de interesses

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por um diretor do NIH New Innovator Award (prêmio n. º DP2HD091793). Q.D.M. é suportado pelo NSF Research Bolsas de graduação (Grant no. DGE-1650044). B.A.H é suportado pelo nacional institutos de saúde GT BioMAT formação concessão sob número do prêmio 5T32EB006343, bem como do Presidente da Geórgia Tech Fellowship. G.A.K. detém um prêmio de carreira na Interface científica do fundo de boas-vindas de Burroughs. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm syringe filtersVWR4652
18G needleVWR89134-024
15 mL conicalsVWR89039-670
250 mL Erlenmeyer flaskVWR89000-362
Stir barVWR58949-006
Hot Plate/Magnetic StirrerVWR97042-634
Glacial acetic acidVWR97064-482
Albumin from Bovine Serum (BSA)Thermo FisherA13100
Iron (III) chloride hexahydrateSigma236489
Iron (II) chloride tetrahydrateSigma44939
EpichlorohydrinSigma45340-500ML-F
DMFSigmaD4551
Ammonium HydroxideSigma320145-500ML
Sodium Hydroxide pelletsSigma221465-500G
EDTASigmaE9884
Sodium BorateSigmaB9876
L-CysteineSigma168149-100G
Tris-HClSigmaT5941
Tris baseSigmaT6066
PBS tabletsSigmaP4417
DextranPharmacosmos5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k filters, 24 pkMilliporeUFC901024
Amicon 15 mL 30k filters, 24 pkMilliporeUFC903024
Amicon 15 mL 100k filters, 24 pkMilliporeUFC910024
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalNanoZS
Slide-A-Lyzer Dialysis CassetteLifeTech66130
Dynabeads MyOne TosylactivatedLifeTech65501
SIALife Tech22349
PEG 20kLaysan BioMPEG-SH-20K-1g
Fluorescein Antibody [2A3]GeneTexGTX10257
Hiload 16/600 superdex 200GE Healthcare45-002-490
Plate ReaderFisherBTCYT5M
BD Insulin SyringesFisherNC0872854

Referências

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