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摘要

将赖氨酸的 cyclopropene 衍生物加入抗体, 就能使四嗪类分子的特异性、快速和有效的联系产生抗体-药物共轭。

摘要

抗体-药物结合 (ADCs) 在临床实践中使用的是抗体分子的混合物, 与不同数量的毒素在各个位置。临床前研究表明, 这些传统 ADCs 的治疗指标可以通过特定部位的毒素联系来改善。然而, 目前生产同类 ADCs 的方法存在着蛋白质表达低、反应动力学慢等诸多局限性。在本协议中, 我们描述了如何建立一个表达系统, 将赖氨酸 (一种改进) 的 cyclopropene 衍生物纳入基因编码扩展的抗体中。这种极小的 bioorthogonal 手柄允许四嗪类衍生物通过逆需求翅果-桤木 cycloaddition 快速共轭。这里的表达系统可以使曲妥珠单抗轴承一种改进在每个重链中都能进行简便的生产和纯化。我们解释了如何将抗体与毒素单 auristatin E 联系起来, 并通过疏水性相互作用色谱和质谱对 immunoconjugate 进行表征。最后, 我们描述了检测 dihydropyridazine 联系产生的人血清的稳定性, 并测试 ADC 对高 HER2 受体乳腺癌细胞的选择性细胞毒性的测定。

引言

抗体-药物共轭 (ADCs) 结合 biotherapeutics 的选择性和小细胞毒性分子的效力。大多数 ADCs 的目的是减少传统化疗的副作用, 靶向药物, 影响 DNA 或微管聚合到癌细胞1。由食品和药物管理局 (FDA) 批准的第一代 ADCs 依赖于 lysines 和半胱氨酸的改性, 从而产生不同位置改性的分子混合物, 其药代动力学特性降低2。相比之下, 特定部位的药物与抗体的结合可以产生化合物, 改善治疗 indeces3,4。为了解决生产同类 ADCs 的挑战, 已报告了几种选择性化学和酶改性的1、5。然而, 目前的方法只能针对抗体的某些位置, 低蛋白表达, 提供连接器低稳定性, 或依赖于缓慢和低收益的反应。

通过遗传代码扩展将非标准氨基酸 (ncAA) 结合在一起, 使站点特定的 bioorthogonal 反应组的安装成为蛋白质, 有可能克服其他方法的局限性, 用于生成Adc。编码 ncAAs 响应目标 (停止) 密码子依赖于氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 对, 是正交的内源对纳入标准氨基酸6。一些 ncAAs 已被纳入抗体, 以产生 ADCs。然而, 大多数患者在治疗药物共轭中的应用受到各种责任。对 acetylphenylalanine (pAcF)7,8不是完全 bioorthogonal, 需要低 pH 值 (4.5) 和长反应时间 (> 60 h), 而叠氮化合物如 p azidophenylalanine (pAzF)7,9,10,p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11, 和一叠氮化物衍生物的赖氨酸 (AzK)12,13可以减少在细胞14, 和铜用于催化 Huisgen cycloadditions 可诱发氧化损伤15。

虽然基于环辛烯 (TCO)、cyclooctyne (上海合作组织) 和双环 [6.1. 0] 壬烯 (BCN) 的替代 ncAAs 最近被编码为生物成像的抗体, 表达系统的产量非常低 (0.5 毫克/升)16。此外, cyclooctenes 和 cyclooctynes 是大而疏水手柄, 可能增加 adc 的易感性的聚合-ADC 有效载荷传统上是疏水性的, 并显示了链接器的物理化学性质大大影响药代动力学和治疗指标17。相比之下, 13-disubstitued cyclopropenes 是小的反应组, 应导致最小的改变蛋白质结构和 physichochemical 属性18。Cyclopropenes 有选择地和快速地反应与 tetrazines 通过逆电子需求翅果-桤木 cycloaddition19。在本协议中, 我们利用赖氨酸 (一种改进,图 1b) 的导数, 其轴承是一个甲基 cyclopropene, 它受空间障碍的影响小于较大的非饱和循环, 且反应速率常数为1-30 米-1s 。-1在水介质18,20。

我们最近报告了如何将一种改进纳入抗体, 以产生 ADCs 通过反应这个最小的 bioorthogonal 处理与四嗪类分子21。在这里, 我们更详细地描述了 ADC 准备过程, 重点是最具挑战性的步骤。一种改进的成立是针对抗体重链 (HC)22中引入的琥珀密码子, 采用 pyrrolysyl-tRNA 合成酶 (PylRS)/tRNACUA(PylT) 对。在这里, 我们使用两种质粒进行瞬变转染 (图 1a), 一个编码重链的抗体和另一个编码的光链 (LC), 包括 PylRS/PylT 盒。另外, 可以通过更费力的程序21生成稳定的细胞线, 使抗体产生更高的产量。

上述表达系统可以产生治疗 anti-HER2 免疫球蛋白 1 (IgG1) 曲妥珠单抗与一种改进在类似水平的野生型抗体。我们选择了重链上的 CH1 域的第一个位置来编码 ncAA (HC-118TAG)。这是 ADCs23中最常用的修改站点, 被称为 HC-118 (欧盟编号), 但也被称为 HC-121 (序列位置) 和 HC-114 (卡巴金编号)24。由于这个位置是保存在所有 IgG1s, 这些表达系统应服从大多数治疗抗体。

我们显示曲妥珠单抗 (一种改进)2可以很容易地纯化蛋白质 A 后, 快速蛋白液相色谱与疏水性相互作用柱 (FPLC-生境)。随后, 抗体在3小时内与微管聚合抑制剂单 auristatin E (MMAE) 中的共价键相连, 在 FDA 批准的 ADC Adcetris 中使用。在这里, 我们使用 MMAE (四嗪类-vcMMAE) 的苄基四嗪类衍生物, 其链接器包括戊间隔和缬氨酸瓜蛋白酶不稳定成分, 后跟一个p氨基苯甲醇自 immolative 单元;该链接器是由蛋白酶 B 在溶酶体的内部化后, 导致无影无踪释放毒素25。为了显示反应的广泛范围, 抗体也链接到荧光四甲基罗丹明 (TAMRA)。本文介绍了用液相色谱联用质谱 (LC) 对共轭的鉴别方法, 并用高效液相色谱法 (HPLC-HIC) 计算药物与抗体比值 (DAR).

作为抗体表现特征的一部分, 我们描述了如何检测人血清中 dihydropyridazine 的稳定性。这个参数更容易评估曲妥珠单抗-TAMRA, 因为它可以量化的简单 ELISA 和解释的结果是不复杂的蛋白酶不稳定成分的曲妥珠单抗 (MMAE)2。最后, 对曲妥珠单抗 (MMAE)2的选择性和效力进行了比较, 通过对不同细胞线的 ADC cytoxicity 进行了对比, 表达了 HER2 的水平。这种检测还提供了一个功能证明的 ADC 稳定性时, 孵化后, immunoconjugate 的人血清。

研究方案

1. 抗体的产生和表征

  1. 表达抗体
    1. 解冻一小瓶的 HEK 悬浮细胞在一个250毫升的瓶含有50毫升的表达培养基补充100单位/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素, 250 ng/毫升两性霉素 b. 保持细胞在37°c 与 8% CO2在加湿的孵化器装备了用 125 rpm 的振动筛。分裂细胞到 0.3-0.5 x 106细胞/毫升 (每2-3 天) 在转染之前至少2次。
    2. 当达到 2.5 x 106细胞/毫升的密度 (分裂后2-3 天), 准备一个新的解决方案100毫米一种改进。为此, 重64毫克的一种改进, 加入2.5 毫升0.1 氢氧化钠, 漩涡, 旋转下来, 以恢复所有难溶粒子和油脂实验。
    3. 添加2.5 毫升的一种改进 (100 毫米在0.1 米氢氧化钠) 到42.5 毫升的表达培养基补充抗生素。混合好, 添加250µL 0.1 米 HCl, 并使用0.22 µm 过滤器消毒。
    4. 稀释50µg 的 HC 和 LC pKym1 质粒21到2.5 毫升与降低血清培养基。在一个单独的管, 稀释135µL 的转染试剂到2.5 毫升与减少血清培养基。
    5. 在制备溶液五分钟后, 混合质粒和转染试剂溶液, 孵育20分钟, 使 DNA 与转染试剂之间形成复合物。
    6. 同时, 离心机1亿2500万细胞在靶密度为5分钟, 在 500 x g, 并用重悬与含有一种改进的表达介质, 并添加 DNA–transfection 试剂混合物。一种改进可以购买或合成的报告前18。
    7. 在孵化细胞20小时后, 添加250µL 的转染试剂促进剂包括在试剂盒中。
    8. 在添加一种改进后6-7 天内从上清中收获抗体 (在表达过程中不需要培养基的变化)。
      * 或者, 为了获得更高和更一致的产量, 一个稳定的细胞线可以产生如描述的 Oller-丹参等。201821。在这种情况下, 曲妥珠单抗 (一种改进)2是简单地表达在表达式培养基中添加一种改进5毫米。
  2. 纯化抗体
    1. 在 3000 x g 上离心细胞15分钟。
    2. 用0.45 或0.22 µm 过滤器过滤上清液。如果筛选器被阻塞, 请将其替换为新的, 然后继续进行筛选。如果这发生在仅少量毫升以后, 离心机在 7000 x g 的另外15分钟的上清液。
    3. 在空的聚丙烯色谱柱中加入蛋白质 A 树脂 (2 mL/100 毫升), 并平衡至少5卷珠洗涤缓冲器 (0.1 米磷酸磷酸钠, 150 毫米氯化钠) 的树脂。
    4. 将上清成两个50毫升圆锥管, 加入5x 珠洗涤缓冲液 (0.5 米磷酸磷酸钠, 150 毫米氯化钠), 其次是预平衡蛋白 A 树脂。在室温下将圆锥管放在滚筒上3小时, 以在上清液中拔出抗体。
      或者: 在柱子上加上清, 至少加倍推荐的树脂用量, 并允许流经。确保没有大量的抗体留在上清的 SDS 页。如果有, 洗脱通过树脂再次上清。
    5. 将一树脂与上清液转移到柱上, 使液体流过。
    6. 添加25毫升的洗涤缓冲器 (或至少10树脂卷), 并允许流经。
    7. 洗脱抗体与4毫升 0.1 M 柠檬酸钠, pH 3, 在1毫升 1 M 磷酸盐缓冲, 150 毫米氯化钠。
    8. 用10毫升的 pbs 稀释抗体, 通过离心过滤浓缩到 0.5-1 毫升, 用 pbs 交换缓冲三倍。
    9. 用 FPLC 的0.5 毫升/分流和0-100% 梯度30分钟的低盐缓冲液 (50 毫米磷酸磷酸钠 pH 值 7.0) 对样品进行纯化, 20% 异丙醇) 在高盐缓冲 (1.5 M (NH4)2如此4, 50 毫米磷酸钠 pH 值7。0, 5% 异丙醇)。收集所有分数和监测洗脱 280 nm。在2.4 中描述的条件下, 少量 (< 1 毫克) 可以用 HPLC 法纯化, 以最大限度地提高产量和纯度。
    10. 池中含有抗体的分数, 稀释到至少4毫升与 pbs, 集中他们的离心过滤和交换缓冲三倍的 pbs。
  3. 量化抗体
    1. 用微体积分光光度计测定 280 nm 的吸光度, 获得近似浓度。
    2. 如果需要精确测量, 使用 ELISA 试剂盒测量人体 IgGs。对于粗略估计, 请使用带有考马斯的着色的 SDS 页, 如下所示:
      1. 通过稀释六倍于1毫克/毫升的 ELISA 量化的曲妥珠单抗标准来制备标准。
      2. 煮沸的标准和样品在大约0.25 毫克/毫升减少装载缓冲。
      3. 使用 MES-sds 缓冲和考马斯染料染色, 在4-12% 双三页的 sds 页面上运行它们。最后用 ImageJ 测量与光或重链对应的波段的颜色密度, 并在标准曲线中对样品进行插补。
  4. 将抗体贮存在摄氏4摄氏度。

2. 共轭抗体并表征 ADC

  1. 四嗪类分子与抗体的共轭
    1. 稀释10摩尔当量的四嗪类-vcMMAE (4 µL, 3.4 毫米在二甲基亚砜)) 与20µL 乙腈和76µL 的 PBS 在一个小锥形管 (例如,PCR 管)。
    2. 添加1摩尔当量的曲妥珠单抗 (一种改进)2 (100 µL, 2 毫克/毫升在 PBS), 彻底混合, 并允许反应 3 h 在室温 (25 °c), 以形成曲妥珠单抗 (MMAE)2。
      注意: 其他分子, 如 tetrazine-5-TAMRA 可以链接到抗体, 而不是四嗪类-vcMMAE 使用此协议。
  2. 净化 ADC
    1. 根据制造商的说明, 预平衡一个大小排除自旋列与 PBS。
    2. 将反应的整个体积加在旋转柱上, 离心机在 1500 x g 处1分钟。
  3. 量化 ADC 并通过 SDS 页分析共轭
    1. 按1.3.2 中的说明量化 ADC。通过使用非修改的标准曲线抗体测量 SDS 页上光链的颜色密度。
    2. 重链应该有轻微的转移显示分子量增加后, 共轭。
      注: 如果抗体是用荧光 (如曲妥珠单抗 (TAMRA)2) 修改的, 则只有与重链对应的波段才会在染色前显示凝胶荧光。
  4. hplc 法分析共轭
    1. 平衡100% 缓冲器 A (1.5 米 (NH4)2,4, 50 毫米磷酸钠 pH 7.0, 5% 异丙醇) 的 HPLC-HIC 柱为5分钟。
    2. 混合15µL (67 pmol) 的1毫克/毫升溶液的曲妥珠单抗 (一种改进) 2 与15µL 2x 缓冲器 a 在瓶中。然后在 HPLC 中编程10µL 注射液。
    3. 洗脱在一个等度1毫升/分钟流与100% 缓冲 a 为1分钟后, 15 分钟的梯度从100到0% 的缓冲区 A 在 B (50 毫米磷酸钠 pH 7.0, 20% 异丙醇)。监测洗脱 280 nm。
    4. 通过积分对应于每个物种的峰值并使用以下公式中的结果区域计算 DAR:
      DAR = (1x 曲妥珠单抗 (MMAE) + 2x 曲妥珠单抗 (MMAE)2)
      /(曲妥珠单抗 (MMAE)0 + 曲妥珠单抗 (MMAE)1 + 曲妥珠单抗 (MMAE)2)
      曲妥珠单抗 (一种改进)2的预期保留时间为 7.5-8.0 分钟, 曲妥珠单抗 (一种改进、MMAE) 为 9.1-9.6 分钟, 曲妥珠单抗 (MMAE)2为 10.5-11.0 分钟。
  5. 用 LC-MS 分析共轭
    1. Deglycosylate 30 µL 1 毫克/毫升 ADC 和未修改的抗体在非还原条件下使用 250 PNGase F 单位至少6小时在37°c。
    2. 在水中使用2% 到80% 乙腈的20分钟梯度, 将抗体洗脱 C4 1-5 µm 1.0 x 100 毫米柱中的质谱仪中。用150v 的锥电压在正离子模式下获得350-4000 的 m-/z 范围的数据。
    3. 使用适当的软件 Deconvolute 原始数据。计算修改后和未修改的抗体质量的差异。

3. 曲妥珠单抗 (TAMRA)2血清中 Dihydropyridazine 链的稳定性测定

  1. 在无菌条件下使用0.22 微米过滤器过滤血清。你可以添加100单位/毫升青霉素, 100 微克/毫升链霉素。
  2. 用清水填充96井板的外井。在中央井, 混合90µL 的过滤血清与10µL 1 毫克/毫升曲妥珠单抗 (TAMRA)2在 PBS 的最终浓度为0.1 毫克/毫升。将盘子放在37摄氏度和 4-5% CO2的恒温箱中。
  3. 每24小时在整个5天, 吸管每一个良好的混合, 采取了5µL 整除, 闪冻与液态氮, 并存储在-80 摄氏度。
  4. 一旦收集了所有样品, 解冻整除数并分析使用间接 ELISA 作为以前报告的12与一些修改:
    1. 用0.25 µg/毫升 HER2 在4摄氏度上一夜之间涂上96井板。所有其他步骤都在室温下进行。
    2. 第二天, 用 pbs 0.05% 补体 (pbs t) 洗涤5次, 用1% 牛血清白蛋白进行1小时清洗。
    3. 在 PBS 1:10000 稀释时, 将样品冲洗和孵化2小时。
    4. 用 0.5% BSA 为1小时, 在1:2000 稀释的 PBS 中冲洗和孵化抗 TAMRA 抗体。
    5. 以 0.5% BSA 为1小时, 在 PBS T 上冲洗和孵化抗鼠 HRP 共轭1:1000。
    6. 添加 TMB 并允许反应5-10 分钟。
    7. 停止反应与50µL H2那么4 1 M 和测量吸光度在450毫微米。减去背景测量 570 nm。
    8. 将4参数的逻辑回归曲线拟合为标准稀释, 并对样品进行插值测量。
      注意: 曲妥珠单抗 (MMAE)2的稳定性可以通过改变3.3 中描述的检测标准来评估 ADC 的浓度而使用相同的协议。

4. 评估 ADC 的细胞毒性

注: 本协议是根据以前报告的化验23,26和一些修改。

  1. 解冻 SK-BR-3 和 MCF-7 细胞, 并允许他们定居在含有完整培养基的 p25 烧瓶中, 即 DMEM 补充10% 热灭活胎牛血清, 100 单位/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素。
  2. 分裂细胞在80-90% 汇合 (每3-4 天) 至少2次在化验之前。
  3. 在化验前两天, 用清水填满96井板的外井。然后以0.05% 胰蛋白酶在0.5 毫米 EDTA, 离心机3分钟在 250 x g, 并用重悬在新的媒介和种子3000个细胞在100µL 每 (空) 井在96井板材举起细胞。
  4. 在播种细胞后两天, 在完全培养基中, 用0.1% 亚砜制备10系列稀释的样品。请考虑以下示例和控件: 曲妥珠单抗 (MMAE)2, 曲妥珠单抗 (一种改进)2, 曲妥珠单抗野生型, 四嗪类 vcMMAE 和 MMAE。
  5. 在每个井中加100µL, 在37摄氏度和 4-5% CO2处孵化5天。
  6. 在5天, 测量细胞的生存能力。为此, 使用商业工具包溶解细胞并测量 ATP 释放。绘制0.1% 亚砜处理的控制细胞信号的百分比。
    注: ADCs 可在血清中孵化5天, 并检测其细胞毒性, 以证明功能稳定性。
    注意: MMAE 剧毒。因此, 在处理 MMAE 衍生物时使用手套和护目镜。如果您在实验中使用未修改的 MMAE 作为控件, 当您在亚砜中准备库存解决方案时, 请在通风罩内处理固态产品。

结果

所报告的瞬态表达系统 (图 1a) 产生 22 2 毫克的曲妥珠单抗 (一种改进)2每公升培养基, 代表2/3 的野生型抗体生产在相同条件下 (图 1c)。稳定的细胞线可以提高这一产量高达 31, 2 毫克/升21。

曲妥珠单抗 (一种改进)2可与四嗪类 vcMMAE 共轭, 在25摄氏度 (图 2) 的3小时内产生准均质曲妥珠单抗 (MMAE)2 。这种毒素的高疏水性需要增加10% 乙腈, 当5或更多的摩尔当量的毒素每一种改进使用。另外, cycloaddition 也在20小时内完成, 使用2当量的四嗪类 vcMMAE, 不带乙腈 (图 2c)。曲妥珠单抗 (一种改进)2反应与四嗪类 TAMRA 在2小时内25°c 和 3-6 h 是必要的, 当温度降到4摄氏度 (图 3c)。

用 HPLC 法测定的曲妥珠单抗 (MMAE)2的预期 DAR 为 1.9 (图 2b)。在色谱中最初观察到的峰值为8.0 分钟, 代表游离抗体 (DAR 0), 当反应完成时应该完全消失。与 DAR 1 elutes 的种类在 9.1-9.6 分钟, 并且应该有一个区域 < 10% 在 3 h 以后;与 DAR 2 的目标产品的保留时间为 10.5-11.0, 预期区域 > 90%。SDS 页凝胶中的移动和荧光证实了 TAMRA (图 3b) 的成立, immunoconjugates 的身份被 LC MS (图 2d-e和图 3d) 验证。

曲妥珠单抗 (TAMRA)2在人血清中的孵化和随后的酶联免疫分析证实, 有效载荷仍然附着在抗体上 (图 4b)。对于细胞毒性检测, 曲妥珠单抗 (MMAE)2显示 SK-BR-3 (HER2 高) 乳腺癌细胞的高效能, 一半最大有效浓度 (EC50) 55 下午10点 (图 4d)。曲妥珠单抗 (MMAE)2在人类血清中5天的孵化后保持细胞毒性 (图 4c)。反之, 当 ADC 在 MCF-7 (HER2 低) 上进行测定时, EC50是200倍低 (图 4d)。野生型抗体, 曲妥珠单抗 (一种改进)2和四嗪类 vcMMAE 显示极低的毒性 (图4d 和 4e), 而 MMAE 显示高无选择性细胞毒性在两个细胞系 (图 4e)。

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图 1: 瞬态表达式系统。A.用于 HEK293 细胞瞬态转染的质粒的相关区域。CMV: 巨细胞病毒启动子, WPRE: 土拨鼠肝炎毒转录后水平调控元素, PylT: pyrrolysyl tRNA, U6: 具体促进者, PylRS: pyrrolysil tRNA 合成酶, > 和 <: 转录方向。 ((2-methylcycloprop 2 en 1 基) 甲氧基) 羰基-l-赖氨酸 (一种改进)。C.野生型 (曲妥珠单抗) 和曲妥珠单抗 (一种改进)2的表达率, 在蛋白 a 纯化后在西方印迹中测定。误差条表示生物 triplicates 的标准偏差。此图经 Oller-丹参等的许可修改。201821。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 2: 曲妥珠单抗 (一种改进)2与四嗪类 vcMMAE 的共轭。cycloaddition 一种改进残留与 MMAE 四嗪类衍生物之间的逆电子需求翅果-桤木。反应组以红色突出显示, p-氨基苯甲醇在绿色和缬氨酸瓜二肽在蓝色被描述。B. HPLC-图谱显示抗体共轭的进展。C.使用不同试剂浓度对最大 DAR 1.9 的转换程度。D-E.Deconvoluted 在共轭前后的全长度抗体的质谱。曲妥珠单抗 (一种改进)2是使用稳定细胞线获得的。此图经 Oller-丹参等的许可修改。201821。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 3: 曲妥珠单抗 (一种改进)2与四嗪类 TAMRA 的共轭。cycloaddition 一种改进残留与 TAMRA 四嗪类衍生物之间的逆电子需求翅果-桤木。B. SDS 页凝胶显示移动转移和凝胶荧光起源于 TAMRA 的共轭。C.在两种不同温度下的共轭动力学。D. Deconvoluted 质量谱曲妥珠单抗 (TAMRA)2.曲妥珠单抗 (一种改进)2是使用稳定细胞线获得的。此图经 Oller-丹参等的许可修改。201821。请单击此处查看此图的较大版本.

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图 4: 血清的稳定性和曲妥珠单抗共轭物的细胞毒性。A.卡通突出显示 ADC 中所需的功能。B.曲妥珠单抗 (TAMRA)2在人血清中的稳定性, 以 ELISA 测定。C.细胞活性测定与曲妥珠单抗 (MMAE)2后5天的人血清 (+ 血清, 黑色)。以 PBS 代替血清 (-血清、红) 的对照样品纳入同一化验。用新鲜稀释的抗体样品进行细胞活性测定。用新鲜稀释的 MMAE 衍生物进行细胞活性测定。误差条表示3独立实验平均值的标准误差。此图经 Oller-丹参等的许可修改。201821。请单击此处查看此图的较大版本.

讨论

该协议中描述的曲妥珠单抗 (一种改进)2的瞬态表达过程简单, 允许高模块化。获得的收益率在一个学术设置27和稳定的细胞系可以产生, 以进一步提高产量21。在表达过程中, 一种改进低于5毫米的浓度可能会导致更低的 ncAA 合并, 更高的数量可能会影响细胞生长和降低抗体产量。一种改进作为游离氨基酸具有低水溶性, 因此应首先溶解在100毫米在0.1 米氢氧化钠, 然后添加到培养基中。在培养基中稀释一种改进, 在将其添加到细胞之前, 用 HCl 和过滤器对培养基进行杀菌是至关重要的。随后, 使用本协议中指定的转染试剂, 并遵循制造商推荐的孵化时间, 对高产表达具有重要意义。有关人体抗体瞬态表达的进一步细节, 读者可以参考其他已发布的协议31,32。

当抗体被纯化后, 需要高过量的蛋白质 a 树脂, 以确保完全抗体从上清下拉。为防止曲妥珠单抗在洗脱过程中沉淀, 可推荐采用高缓冲容量的溶液, 立即稀释 PBS, 交换缓冲液, 避免过量浓度。始终保持抗体 < 5 毫克/毫升。

曲妥珠单抗 (一种改进)2与四嗪类 vcMMAE 的共轭比大多数与 bioorthogonal 处理 ADCs 的反应要快。此外, 这种 cycladdition 发生在非常温和的条件下: 室温或较低的生理 pH 值。在添加 PBS 和抗体之前, 用乙腈稀释反应物的亚砜溶液是很重要的;否则, 四嗪类衍生物将沉淀。乙腈仅由于 MMAE 和 TAMRA 的高疏水性而需要, 但疏水性分子可能不需要加入共溶剂。另外, 四嗪类-vcMMAE 可以共轭不乙腈, 只有2摩尔当量的四嗪类 vcMMAE 在20小时内。与目前基于 ncAA 的技术相比, 这种少量的毒素可能会导致 ADC 的制造成本大幅下降。曲妥珠单抗 (一种改进)2是完全活性的至少4月, 当保存在4摄氏度。

高效液相色谱-生境可精确测定 DAR, 因为 MMAE 是高度疏水性的, 并提供了与 0, 1 和2毒素相对应的抗体共轭峰的优良分辨率。反应四嗪类-vcMMAE elutes 约13.7 分钟, 并检测到 280 nm。这种技术要求具有高纯度的起始材料。此外, 它是不可取的, 以淬火与其他四嗪类反应分子, 如 BCN-OH, 因为它们可以改变的保留时间和形状的峰值。在梯度开始时, 试样的盐浓度与流动相匹配, 以获得良好的分离, 特别是在注入10-20 µL 的情况下。

对于 LC-MS 分析, deglycosylation 的抗体样本需要获得一个单一的峰值后, 反褶积的原始光谱。总抗体和 ADC 质量的准确性可能取决于仪器的 callibration。因此, 为了计算质量的修改, 减去获得的质量为未修改的抗体从一个获得的 ADC。现代高分辨率质谱仪应提供低于1:10000 的相对误差。虽然 LC MS 也可以用来计算不同物种之间的比值, 但这个值通常是高估的, 因为修改可能会影响产生的物种的电离能力, 而且可能无法检测到少量杂质。

由于药物的过早释放导致毒性更高, 疗效较低, ADCs 中链接器的稳定性至关重要;自由毒素损害健康组织和裸抗体竞争与武装一个为目标结合点在患病的细胞。预计在稳定性试验的可变性范围内, 5% 以下的释放。

最后, 通过比较 SK-BR-3 细胞 (HER2 高) 和 MCF-7 细胞的细胞毒性 (HER2 低), 可以评估 ADC 靶向 HER2 如曲妥珠单抗 (MMAE)2的选择性, 因为后者表达的比前28的 HER2 受体少15倍..与 MCF-7 相比, immunoconjugate 有望在 SK-BR-3 中产生至少2级低的细胞活力。EC50在 SK-BR-3 应该是在两位数 nanomolar 范围内, 反映了这个 ADC29,30的高效能。未经修改的抗体, 无论是曲妥珠单抗 (MMAE)2或曲妥珠单抗, 应显示没有毒性的这一化验。四嗪类-vcMMAE 的效果比 ADC 低3级, 因为链接器去除了 peptidomimetic 毒素的活性。相反, 由于 MMAE 能够渗透细胞膜30, 它应该有一个类似的毒性 ADC, 但不显示 HER2 高和 HER2 低细胞线之间的歧视。此外, 如果这一检测是在5天的 ADC 的孵化后进行的血清, 它可以用来提供一个功能证明的连接器的稳定性: 毒素的释放将导致 SK-BR-3 ADC 效率的下降, 如果 MMAE 释放与 p链接器的艺术或如果链接器以无影无踪的方式被切割, 则选择性降低。

本文所描述的 ADC 技术允许高效地将赖氨酸 cyclopropene 衍生物纳入 IgG1s。经过一种简便的纯化后, 抗体可以迅速与含有四嗪类的分子结合, 产生均匀的产物。由于 cyclopropene 最小手柄的体积小、反应性高, 该方法应能使 sterically 受阻载荷的共轭。结果 immunoconjugates 在血清中稳定, 具有较强的选择性。总的来说, 一种改进支持快速, 站点特定和稳定的 bioorthogonal 联系, 用于抗体和其他蛋白质共轭物用于治疗或诊断。

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到英国医学研究委员会的支持。狐臭。持有 EMBO 奖学金 (ATLF 158-2016), 并感谢 h. 佩勒姆和 J.W. 下巴的支持, 以及 g 许姆、波斯特摩根和 o. Perisic 的帮助和建议。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Expi293FThermoFisher ScientificA14527HEK suspension cells
Expi293 Expression MediumThermoFisher ScientificA1435101Expression medium
Antibiotic-antimycoticThermoFisher Scientific15240062Penicillin-streptomycin-amphotericin B
125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent CapCorning431143Shake flasks
Brunswick S41i incubatorEppendorfS41I230011CO2 incubator with a shaker
Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solutionVWR191373M
Cyclopropene lysineSichemSC-8017In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014
Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiatedMerck MilliporeSCGP00525
Opti-MEM, Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific31985070Reduced serum medium
ExpiFectamine 293 Transfection KitThermoFisher ScientificA14525Transfection reagent
5810 R centrifugeEppendorf5811000460
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilizedMerck MilliporeSLGP033RS
Protein A resinSino Biological10600-P07E-RN-25
Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50Bio-Rad7311550Polypropylene chromatography column
Econo-Column FunnelBio-Rad7310003
Sodium citrateFluka71635
ÄKTA explorer FPLCGE Healthcare
HiTrap HIC Selection KitGE Healthcare28-4110-07Includes HiTrap 1 mL Butyl HP
Ammonium sulfateVWR2133.296
IsopropanolHonywell34863-2.5L
Dymethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418-50ML
Tetrazine-vcMMAEChemPartner-Costum synthesized
Tetrazine-5-TAMRAJena BioscienceCLK-017-05
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 wellThermoFisherScientificNP0321BOX
Xcell SureLock Mini-CellThermoFisherScientificEI0001
UltiMate 3000 HPLCThermoFisherScientific
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µmThermoFisherScientific088553
PNGase FNew England BioLabsP0704S
NanoAcquityWaters
C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column Waters
96-well microplates for cell cultureThermoFisherScientific156545
Human serumSigma-AldrichH4522-20mL
CO2 incubatorPanasonic
HER2 ECDSino Biological10004-HCCH
Anti-TAMRAAbcaman171120
Anti-mouse HRPSanta Cruzsc-2005
TMBBioLengend421101
Sulfuric acidSigma-Aldrich84727-500ML
PHERAstar FSBMG LabtechPlate reader
DMEMSigma-AldrichD5671-500ML
SK-BR-3ATCCHTB-30
MCF-7ATCCHTB-22
CellTiterGlo 2.0 AssayPromegaG9242Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence.
Monomethyl Auristatin ECayman Chemical16267
NanoDrop 2000ThermoFisherScientificMicrovolume spectrophotometer
Human IgG ELISA Quantificaiton SetBethylE80-104
MaxEnt1 in MassLynxWatersSoftware application for mass spectrum deconvolution
IntantBlueExpedeonISB1LCoomassie-based stain
Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay)Epitope Diagnostics, Inc.KTR 782
Tube 50 mL, 114x28mm, PPSarstedt62.547.254Conical tube
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWLMerckUFC905024Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWLMerckUFC805024Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification)
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mLThermoFisherScientific89882Size exclusion spin columns
Tube PCR 0.2ml Flat CapThistle Scientific LtdAX-PCR-02-C-CSPCR tubes
Nunc MaxiSorpª flat-bottomThermoFisherScientific44-2404-21Plates for ELISA

参考文献

  1. Beck, A., Goetsch, L., Dumontet, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of antibody-drug conjugates. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (5), 315-337 (2017).
  2. Wakankar, A. A., et al. Physicochemical Stability of the Antibody−Drug Conjugate Trastuzumab-DM1: Changes due to Modification and Conjugation Processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
  3. Stan, A. C., Radu, D. L., Casares, S., Bona, C. A., Brumeanu, T. -. D. Antineoplastic Efficacy of Doxorubicin Enzymatically Assembled on Galactose Residues of a Monoclonal Antibody Specific for the Carcinoembryonic Antigen. Cancer Research. 59 (1), 115-121 (1999).
  4. Hamblett, K. J., et al. Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate. Clinical Cancer Research. 10 (20), 7063-7070 (2004).
  5. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-Drug Conjugates: An Emerging Concept in Cancer Therapy. Angewandte Chemie International Edition. 53 (15), 3796-3827 (2014).
  6. Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code. Nature. 550 (7674), 53-60 (2017).
  7. Axup, J. Y., et al. Synthesis of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Unnatural Amino Acids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (40), 16101-16106 (2012).
  8. Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody Conjugates with Unnatural Amino Acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
  9. Tian, F., et al. A General Approach to Site-Specific Antibody Drug Conjugates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 1766-1771 (2014).
  10. Kern, J. C., et al. Discovery of Pyrophosphate Diesters as Tunable, Soluble, and Bioorthogonal Linkers for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates. Journal of the American Chemical Society. 138 (4), 1430-1445 (2016).
  11. Zimmerman, E. S., et al. Production of Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Optimized Non-Natural Amino Acids in a Cell-Free Expression System. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
  12. VanBrunt, M. P., et al. Genetically Encoded Azide Containing Amino Acid in Mammalian Cells Enables Site-Specific Antibody-Drug Conjugates Using Click Cycloaddition Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 26 (11), 2249-2260 (2015).
  13. Xiao, H., et al. Genetic Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids into Proteins in Mammalian Cells. Angewandte Chemie International Edition. 52 (52), 14080-14083 (2013).
  14. Milles, S., et al. Click Strategies for Single-Molecule Protein Fluorescence. Journal of the American Chemical Society. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  15. Lallana, E., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide-Alkyne Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 50 (38), 8794-8804 (2011).
  16. Koehler, C., et al. Genetic Code Expansion for Multiprotein Complex Engineering. Nature Methods. 13 (12), 997-1000 (2016).
  17. Lyon, R. P., et al. Reducing Hydrophobicity of Homogeneous Antibody-Drug Conjugates Improves Pharmacokinetics and Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 33 (7), 733-735 (2015).
  18. Elliott, T. S., et al. Proteome Labeling and Protein Identification in Specific Tissues and at Specific Developmental Stages in an Animal. Nature Biotechnology. 32, 465-472 (2014).
  19. Ravasco, J. M. J. M., Monteiro, C. M., Trindade, A. F. Cyclopropenes: A New Tool for the Study of Biological Systems. Organic Chemistry Frontiers. 4 (6), 1167-1198 (2017).
  20. Yang, J., Šečkutė, J., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions. Angewandte Chemie International Edition. 124 (30), 7594-7597 (2012).
  21. Oller-Salvia, B., Kym, G., Chin, J. W. Rapid and Efficient Generation of Stable Antibody-Drug Conjugates via an Encoded Cyclopropene and an Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction. Angewandte Chemie International Edition. 57, 2831-2834 (2018).
  22. Schmied, W. H., Elsässer, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient Multisite Unnatural Amino Acid Incorporation in Mammalian Cells via Optimized Pyrrolysyl tRNA Synthetase/tRNA Expression and Engineered eRF1. Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  23. Junutula, J. R., et al. Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an Antibody Improves the Therapeutic Index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
  24. Junutula, J. R., et al. Rapid Identification of Reactive Cysteine Residues for Site-Specific Labeling of Antibody-Fabs. Journal of Immunological Methods. 332 (1), 41-52 (2008).
  25. Doronina, S. O., et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. 21 (7), 778-784 (2003).
  26. Shiraishi, Y., et al. Identification of Highly Reactive Cysteine Residues at Less Exposed Positions in the Fab Constant Region for Site-Specific Conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (6), 1032-1040 (2015).
  27. Sabourin, M., et al. Increasing Antibody Yield and Modulating Final Product Quality using the Freedom(TM). CHO-S(TM) Production Platform. BMC Proceedings. 5 (8), 102 (2011).
  28. Xiao, Y., Gao, X., Maragh, S., Telford, W. G., Tona, A. Cell Lines as Candidate Reference Materials for Quality Control of ERBB2 Amplification and Expression Assays in Breast Cancer. Clinical Chemistry. 55 (7), 1307-1315 (2009).
  29. Shinmi, D., et al. One-Step Conjugation Method for Site-Specific Antibody-Drug Conjugates through Reactive Cysteine-Engineered Antibodies. Bioconjugate Chemistry. 27 (5), 1324-1331 (2016).
  30. Badescu, G., et al. Bridging Disulfides for Stable and Defined Antibody Drug Conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (6), 1124-1136 (2014).
  31. Vazquez-Lombardi, R., et al. Transient expression of human antibodies in mammalian cells. Nature Protocols. 13 (1), 99-117 (2018).
  32. Baldi, L., Hacker, D. L., Meerschman, C., Wurm, F. M., Hartley, J. L. . Protein Expression in Mammalian Cells: Methods and Protocols. , 13-26 (2012).

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