切片中石蜡嵌入组织的切割和漂浮方法

摘要

在这里, 我们提出了一个改进石蜡切片的协议。这种方法结合切割和浮动使用一个简单的恒温室, 以避免转让过程中所需的传统方法。结果表明, 石蜡切片的效率和数量均有显著提高。

摘要

石蜡嵌入组织切片被广泛应用于组织学和病理学。然而, 这是乏味的。为了改进这种方法, 几家商业公司利用流体水设计了复杂的断面传输系统。为了简化这项技术, 我们创建了一个简单的方法, 使用自制的设备, 结合切割和浮动在一个简单的恒温室;因此, 各部分自动进入水浴在水面上。用常规石蜡切片和所提出的方法进行比较, 对成年小鼠脑、成年小鼠肾脏、胚胎小鼠大脑和成年斑马鱼眼的海马体进行切割。统计分析表明, 改进后的方法节省了时间, 产生了较高的质量剖面。此外, 在短时间内石蜡切片的整个标本是容易的初级操作者。

引言

形态学研究在生物研究中具有重要意义。虽然新技术允许研究人员直接从整个组织或有机体观察他们的目标^1,2,3, 切割标本成薄切片, 其次是染色, 仍然是主要的方法 fornot 组织形态学, 也可直接在组织中进行蛋白靶向。光镜使用三切片类型: 石蜡, 冷冻和半薄切片。虽然 cryosectioning 是常见的保护组织抗原性, 标本准备是简单的, 保留组织形态学较差, 不适合薄切片^4,5。石蜡切片是展示保存完好的形态学最常用的方法。由于试样完全脱水, 并嵌入蜡, 石蜡块可以无限期储存。此外, 石蜡切片产生薄切片, 以改善生物探针进入进一步的实验和减少细胞层叠加在 Z 方向。

然而, 传统的石蜡切片是繁琐的, 需要操作员的技能。石蜡切片经过固定, 脱水, 嵌入, 切割和漂浮。重要的是, 将节带从刀座转移到水浴是必要的, 但对于初级操作者来说是困难的。特别是在干燥的空气中, 节带会由于静电而扭曲, 在温暖的水面上很难展开。为提高切片质量, 在切片刀片通过后, 将所暴露的组织表面湿润, 将蜡块浸泡在冰水中, 或者在切片附近用加湿器提高湿度, 建议^6、7.改进石蜡切片的新方法包括混合石蜡嵌入, cryosectioning⁸和商业部分转移系统协助⁹。虽然这些方法部分提高了石蜡切片的速度和质量, 但它们使切片变得更加繁琐, 商业剖面转移系统是昂贵的。

在本协议中, 我们演示如何逐步创建简单, 廉价和灵活的设备, 这可以连接到旋转切片的刀片持有人。该设备由截面通道、水浴和带有温度检测开关的加热器组成。切割后, 大量的断面流进断面通道, 直接进入水浴, 从而自动展开。这提高了石蜡切片的效率, 使该技术更方便。使用这种方法, 更多的成年小鼠海马切片, 成年小鼠肾脏切片, 胚胎15.5 天老 (E15.5) 小鼠脑切片, 和成年斑马鱼眼切片被收获在较少的时间, 并保持更完整的形态。这种方法也可以用于其他组织样品, 需要加速石蜡切片, 同时避免损失的部分区分。

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研究方案

这里介绍的所有方法均经南昌大学动物保育委员会批准。

1. 装配设备并连接切片

1. 根据要求设计参数 (补充图 1)。
2. 将参数提交当地工厂生产丙烯酸板。
3. 按顺序装配所有部件: 使用氯仿将7个商业丙烯酸板组合成一个带有截面通道和水浴的水箱 (图 1)。
   注意: 氯仿在遇到光和氧时会产生有毒物质。把器具装配在通风罩里。
4. 将管状电热元件通过压克力板 #1 (图 2A、箭头) 安装在孔中。
5. 要安装温度控制器, 请使用电钻在 #2 丙烯酸板上创建一个小孔, 并安装温度检测器 (图 2A、箭头)。在水箱上安装数字恒温器 (图 2A)。
   注: 温度探测器应在水面以下1厘米以内。
6. 要提供电源接入, 请在打开设备前调整电压低于 24 V。
7. 从切片中移除剖面废物托盘。
8. 用中性硅胶密封胶将截面通道与切片刀片架连接 (图 2B)。
   注: 请勿涂抹在刀片顶部上方的中性硅胶密封胶, 使旧刀片易于更换。
9. 夜间干燥, 允许氯仿和中性硅酮密封胶时间固化。
10. 将刀片式服务器安装到刀片式服务器上。将水倒入水浴中 (图 2C)。水面应该只是触摸刀片的顶部 (图 2D,箭头头)。

2. 石蜡切片

注: 碎屑经常堆积在蜡块和水面的上缘或下边缘。这些碎片应定期清除。

1. 执行常规石蜡切片¹⁰。
   1. 将石蜡嵌入试样夹在旋转切片上, 将刀片置于刀片夹持器中。
   2. 转动手轮和切片试样。
   3. 将石蜡切片的丝带转移到38.5 摄氏度温水浴。
   4. 展开后, 从水面上的显微镜上把切片捡起来。
   5. 将烤箱中的幻灯片干燥42摄氏度。
2. 改进石蜡切片 (图 3)
   1. 打开设备。
   2. 打开加热器与温度检测开关, 并设置目标温度之间的38.0 °c 到40.0 °c, 提前1小时, 以温暖的水。
   3. 修改石蜡嵌段获得的石蜡块;然后把石蜡块放在切片的卡带钳上, 然后锁上。
      注: 应水平调整石蜡块的上、下边界, 防止截面带状形成弧形, 无法流经狭窄断面通道。
   4. 通过剪切较厚的部分快速接近样品。
   5. 调整到合适的断面厚度 (10 µm 成年小鼠大脑, 成年小鼠肾脏, 胚胎小鼠大脑, 4 µm 为斑马鱼的眼睛)。转动手轮, 各部分将自动进入截面通道和浴缸。
   6. 切片的标本在一个缓慢和均匀的切割冲程 (图 3A)。
      注: 第一节的 Thethickness 将在手轮停止几分钟后改变。当切片有连续划痕时, 应更换一次性刀片。
   7. 将各部分引导至浴腔内以直线浮动 (图 3B、3C)。
      注: 如果头部部分附着在腔壁上, 请使用画笔导轨使其浮动。
   8. 将部分粘贴到显微镜幻灯片上。在水浴中充分展开部分后, 用镊子分隔几个部分。然后将它们从水浴中接上显微镜幻灯片 (图 3D)。
      注: 应从水浴后部拾起部分, 因为部分通道和水浴的前部仍未完全展开。
   9. 把这些幻灯片放在一个42摄氏度的烤箱里过夜。然后可以无限期地将幻灯片存储在室温下。
3. 应用苏木精-伊红 (he) 染色, 以评价改进方法⁸。

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结果

改进后的方法增加了完整石蜡切片的数量。我们对成年小鼠海马组织、成年小鼠肾脏、胚胎小鼠大脑和斑马鱼的眼睛进行了新的检测。水被增加到坦克, 并且水温保持在38.0 °c 之间到40.0 °c。在连续制备组织样品后, 切片并与常规切片进行比较。该方法避免了切片丢失, 增加了成年小鼠海马、成年小鼠肾脏、E15.5 鼠脑和成年斑马鱼眼中完整切片的比例 (图 4A

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讨论

为改善石蜡切片形貌, 解决常规石蜡切片过程中的浪费时间问题, 我们建立了一种改进的石蜡切片方法, 结合切割和展开。这种改进的方法依赖于简单的设备, 包括剖面通道, 水浴和加热器与温度检测开关。节带通过剖面通道进入水浴, 并在切割时自动展开。因此, 该方法提高了石蜡切片的质量和效率, 这是通过石蜡切片的成年小鼠海马, 成年小鼠肾脏, E15.5 小鼠的大脑, 和成年斑马鱼眼睛验证。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Boekel Scientific	133000-2
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	64-17-5
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	1330-20-7
Paraplast	Leica	39601006
Heated Paraffin Embedding Module	Leica
Commercial acrylic board
Trichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	67-66-3
Tubular electric heating element(12 V 200 W)
Temperature controller(12 V 120 W)	Mingsuo	XH-W3002
Rotary microtome	Leica
Neutral silicone sealant			Link the water channel with the microtome knife holder
Voltage transformer	Dearll	S-250-12
Disposable blade	Accu-Edge	4689
Hematoxylin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Eosin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Microslide	Sail Brand	7105
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	10004160
Coverslip	Citoglas	10212424C
Microscope	Carl Zeiss
Hydrochloric acid	Xilong Chemical	7647-01-0
Water bath for paraffin sections	Leica
HistoCore Arcadia C - Cold Plate	Leica
paraffin repellent spray	Thermo Scientific	9990420