Kesme ve kesit için doku parafin gömülü için yüzen yöntemi

Özet

Burada, parafin kesit geliştirmek için bir protokol mevcut. Bu yöntem kesme ve geleneksel yöntemle gerekli aktarım işlemi önlemek için basit bir termostatik odası kullanarak yüzen birleştirir. Sonuç olarak, verimliliği ve bozulmamış parafin bölüm sayısı büyük ölçüde düzeldi.

Özet

Parafin gömülü dokusunun kesit Histoloji ve patoloji yaygın olarak kullanılır. Ancak, yorucu olabilir. Bu yöntem geliştirmek için çeşitli ticari şirketler karmaşık bölümüne transfer sistemleri sıvı su kullanarak tasarladılar. Bu teknoloji basitleştirmek için kesme ve basit bir termostatik odası içinde yüzen bir araya getiren ev yapımı donanımları kullanarak basit bir yöntem oluşturdu; Bu nedenle, bölümleri otomatik olarak su yüzeyine su banyosu girin. Hippocampus yetişkin fare beyni, Yetişkin fare böbrekler, embriyonik fare beyni ve yetişkin zebra balığı gözleri kesin karşılaştırma için geleneksel parafin kesit ve sunulan yöntem kullanarak. İstatistiksel analiz bizim geliştirilmiş Yöntem kurtarmak zaman ve yüksek kalite bölümleri üretilen gösterir. Buna ek olarak, kısa bir süre içinde bütün bir örnek parafin kesit junior operatörleri için kolaydır.

Giriş

Morfolojik biyolojik araştırmada önemli bir çalışmadır. Yeni teknoloji hedeflerine doğrudan doğruya--dan tüm doku veya organizmalar^1,2,3ince bölüme, numune kesme, boyama tarafından takip gözlemlemek araştırmacılar sağladı rağmen birincil kalır yöntemi fornot tek doku morfoloji aynı zamanda protein dokuda doğrudan hedefleme. Işık mikroskobu üç bölüm türlerini kullanır: Parafin, dondurulmuş ve semithin. Cryosectioning doku antigenicity korumak için ortak ve numune hazırlama basittir, tutulan doku morfoloji yoksul ve ince parça^4,5için uygun olsa da. Parafin kesit iyi korunmuş morfoloji sergilenmesi için en sık kullanılan yöntemdir. Numuneler tamamen susuz ve balmumu içinde gömülü olarak, parafin blok süresiz olarak saklanır. Buna ek olarak, parafin kesit biyolojik sonda erişimi daha fazla deneylerde geliştirmek ve hücre katmanı bindirme Z yönünde azaltmak ince kesitler üretir.

Ancak, geleneksel parafin kesit sıkıcı ve Operatör beceri gerektirir. Parafin kesitler fiksasyon, dehidratasyon, gömme, kesme ve yüzen tabi. Önemlisi, Bölüm şeritler bıçaklıklı su banyosu aktarma gerekli ama zor junior operatörleri için. Özellikle kuru hava, Bölüm şeritler statik elektrik nedeniyle kandıracak ve sıcak su yüzeyine açılmak zordur. Bölüm geliştirmek için kalite maruz doku yüzeyi arasında microtome bıçak geçer, onları buzlu suda çeker veya nem microtome yakınındaki bir nemlendirici ile yükselterek mum blok soğutma nemlendirme,^6,7 tavsiye edilir . Parafin kesit geliştirmek için yeni yöntemler hibrid parafin katıştırma, cryosectioning⁸ve ticari bölüm transfer sistemi Yardım⁹içerir. Her ne kadar bu yöntemler kısmen parafin geliştirmek hız ve kalite, kesit kesit çok daha ağır yapmak ve ticari bölüm aktarma sistemleri pahalıdır.

Bu protokol için bir döner microtome blade sahibine bağlı basit, ucuz ve esnek ekipman adım adım oluşturmak nasıl gösterir. Bu cihaz bir bölüm kanal, bir su banyosu ve bir ısıtıcı bir sıcaklık algılama anahtarı ile oluşur. Kesme sonra bölümleri düzinelerce bölüm kanal akışı ve böylece otomatik olarak elinde tutmasına doğrudan, su banyosu girin. Bu parafin kesit verimliliğini artırır ve bu teknoloji daha uygun hale getirir. Bu yöntem, daha yetişkin fare hipokampal bölümleri, Yetişkin fare böbrek bölümler, embriyonik 15.5 bayat (E15.5) fare beyin bölümleri ve bölümler daha kısa sürede hasat ve morfolojik daha sağlam kaldı yetişkin zebra balığı göz kullanarak. Bu yöntem, Bölüm ayrım kaybı kaçınırken hızlandırılmış parafin kesit gerektiren diğer doku örnekleri için de kullanılabilir.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakım ve kullanım Komitesi Nanchang Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. montaj malzemeleri ve Microtome bağlanmak

1. Parametre (ek Şekil 1) gereksinimleri başına tasarım.
2. Akrilik panoları üretimi için yerel bir fabrika için parametre gönderin.
3. Tüm parçaları sırayla birleştirin: kloroform 7 ticari akrilik panoları bir tanka bir bölüm kanal ve su ile banyo (Şekil 1) birleştirmek için kullanın.
   Dikkat: ışık ve oksijen karşılaştığında kloroform toksik maddeler üretir. Cihaz bir duman başlıklı bir araya getirin.
4. Borulu elektrikli ısıtma elemanı delikten akrilik Kurulu #1 (Şekil 2A, ok ucu) yükleyin.
5. Sıcaklık denetleyicisi yüklemek için küçük bir delik bir elektrikli matkap kullanarak #2 akrilik tahtada oluşturmak ve sıcaklık dedektörü (Şekil 2A, ok) yükleyin. Bir dijital termostat tank (Şekil 2A) yükleyin.
   Not: Sıcaklık dedektörü su yüzeyinin altında 1 cm olmalıdır.
6. Güç erişim sağlamak için gerilim altında 24 V ekipman açmadan önce ayarlayın.
7. Microtome bölümü atık tepsisini çıkarın.
8. Bölümleri kanal tarafsız silikon dolgu macunu (Şekil 2B) ile microtome bıçak sahibi ile bağlantı.
   Not: eski bıçak kolayca değiştirilir, böylece herhangi bir nötr silikon dolgu macunu bıçağın üstündeki yukarıda smear değil.
9. Kloroform ve tarafsız silikon dolgu macunu zaman kuvvetlendirmek için izin vermek için bir gecede kuru.
10. Bıçak bıçak sahibine yükleyin. Su su banyosu (Şekil 2C) dökün. Su yüzeyinin sadece bıçak (Şekil 2B, ok başı) üstündeki dokunmatik gerekir.

2. parafin kesit

Not: Enkaz kez üst veya alt kenarlarını mum blok ve su yüzeyi üzerinde birikir. Bu enkaz düzenli olarak temizlenmiş olmalıdır.

1. Geleneksel parafin¹⁰kesit gerçekleştirin.
   1. Parafin gömülü numune üzerinde döner microtome kelepçe ve bıçak bıçak tutucu içinde yerleştirin.
   2. Çark açmak ve örnek bölüm.
   3. Parafin kesitli şerit 38,5 ° C sıcak su banyosu için transfer.
   4. Bölümler mikroskop üzerine su yüzeyinden unfolding sonra slayt alın.
   5. Slayt 42 ° c fırında gecede kuru.
2. Geliştirilmiş parafin (Şekil 3) kesit
   1. Ekipman açın.
   2. Kalorifer sıcaklık algılama anahtarı ile açın ve hedef sıcaklık 40.0 ° c önceden sıcak su 1 h için 38,0 ° C arasında ayarlayın.
   3. Parafin katıştırma tarafından alınan parafin blok değiştirmek; sonra parafin blok microtome'nın kaset kelepçe üzerinde yerleştirin ve kilitle.
      Not: Parafin blok üst ve AST sınırları bir ark şekillendirme ve dar bölümleri kanalı ile akış yapamaz hale bölüm şerit önlemek için yatay olarak değiştirilmesi gerekir.
   4. Hızlı bir şekilde örnek kesme kalın bölümler tarafından yaklaşım.
   5. Uygun bölümü kalınlığı (10 µm yetişkin fare beyni, Yetişkin fare böbrekler ve embriyo fare beyni, zebra balığı gözler için 4 µm) için ayarlayın. Çark açmak ve bölümleri kanal ve banyo bölümleri otomatik olarak girer.
   6. Numune yavaş ve düzgün kesme Darbedeki (Şekil 3A) bölüm.
      Not: çark birkaç dakika durdu sonra değiştirilmiş ilk bölümünün Thethickness. Bölümleri üst üste çizik olduğunda tek kullanımlık bıçaklar değiştirilmelidir.
   7. Bölümleri bir satırda (Şekil 3B, 3 C) yüzmek için banyo odası deliklere.
      Not: baş kısmındaki odası duvara yapışır, yüzen tutmak için bir fırça kılavuzu kullanın.
   8. Bölümler mikroskop slayta uygun. Bölümlerden sonra tamamen su banyosunda ayrı birkaç bölüm cımbız ile açılmak. O zaman Seç onları--dan mikroskop slayta (şekil 3D) su banyosu.
      Not: Bu bölüm kanal ve su banyosu ön henüz tam olarak gelişeceğini olmayacak gibi bölümler su banyosu, arka çekilmesi gereken.
   9. Slaytları gecede 42 ° C fırında yerleştirerek kuru. Slaytları sonra oda sıcaklığında süresiz olarak depolanabilir.
3. Hematoksilen-eozin (HE) geliştirilmiş Yöntem⁸değerlendirilmesi uğruna boyama kullanın.

Sonuçlar

Geliştirilmiş Yöntem sağlam parafin bölümleri sayısı arttı. Yetişkin fare hipokampal doku, Yetişkin fare böbrekler, embriyonik fare beyni ve zebra balığı gözleri bu yeni yöntem test ettik. Su tankı için eklendi ve su sıcaklığı 38,0 ° C ile 40.0 ° c arasında devam edildi Bir seri olarak doku örnekleri hazırladıktan sonra onlar kesitli ve geleneksel kesit için karşılaştırıldığında. Yeni Yöntem bölümü kaybı kaçınılması ve yetişkin fare hipokamp...

Tartışmalar

Parafin bölüm morfoloji artırmak ve geleneksel parafin kesit sırasında harcanan zaman sorunu çözmek için biz bir geliştirilmiş parafin kesme ve unfolding birleştirir yöntemi kesit oluşturdu. Bu geliştirilmiş Yöntem bir bölüm kanal, bir su banyosu ve sıcaklık algılama anahtarı ile bir ısıtıcı oluşmaktadır basit ekipman kullanır. Bölüm şerit bölüm kanal üzerinden su banyosu girer ve otomatik olarak kesme sırasında yaşanıyor. Bu nedenle, bu yöntem kalite ve verimlilik, Yetişkin fare ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Boekel Scientific	133000-2
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	64-17-5
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	1330-20-7
Paraplast	Leica	39601006
Heated Paraffin Embedding Module	Leica
Commercial acrylic board
Trichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	67-66-3
Tubular electric heating element(12V 200W)
Temperature controller(12v 120w)	Mingsuo	XH-W3002
Rotary microtome	Leica
Neutral silicone sealant			Link the water channel with the microtome knife holder
Voltage transformer	Dearll	S-250-12
Disposable blade	Accu-Edge	4689
Hematoxylin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Eosin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Microslide	Sail Brand	7105
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	10004160
Coverslip	Citoglas	10212424C
Microscope	Carl Zeiss
Hydrochloric acid	Xilong Chemical	7647-01-0
Water bath for paraffin sections	Leica
HistoCore Arcadia C - Cold Plate	Leica
paraffin repellent spray	Thermo Scientific	9990420