O corte e o método flutuante para tecido parafina para seccionamento

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para melhorar o corte de parafina. Este método combina flutuante usando uma simples câmara termostática para evitar o processo de transferência exigido pelo método convencional e de corte. Como resultado, a eficiência e o número de cortes de parafina intactas foram grandemente melhoradas.

Resumo

Corte do tecido parafina é amplamente utilizado em histologia e patologia. No entanto, é tedioso. Para melhorar este método, várias empresas comerciais criaram sistemas de transferência de seção complexo usando água fluida. Para simplificar essa tecnologia, criamos um método simples usando equipamento caseiro que combina o corte e flutuando dentro de uma câmara termostática simples; Portanto, as seções entram automaticamente o banho de água na superfície da água. O hipocampo do cérebro do rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato embrionárias e olhos adultos do zebrafish foram cortadas usando parafina convencional de corte e o método apresentado para comparação. Análise estatística mostra que nosso método melhorado poupado tempo e produziu seções de qualidade superiores. Além disso, parafina seccionamento de um espécime em um curto período de tempo é fácil para os operadores Júnior.

Introdução

Estudo morfológico é importante na pesquisa biológica. Apesar de nova tecnologia permitiu que os pesquisadores a observar seus alvos diretamente do tecido inteiro ou organismos^1,2,3, cortar a amostra em seções finas, seguiram de coloração, continua a ser o principal morfologia de tecido único método porque mas também proteína alvo diretamente no tecido. Microscopia de luz usa três tipos de seção: parafina, congelada e semithin. Embora cryosectioning é comum para proteger antigenicidade de tecido, e a preparação das amostras é simples, a morfologia do tecido retido é pobre e inadequado para fino corte^4,5. Corte de parafina é o método mais frequentemente usado para exibindo morfologia bem preservada. Como os espécimes são desidratados completamente e incorporados em cera, os blocos de parafina podem ser armazenados indefinidamente. Além disso, parafina seccionamento produz seções finas que melhorar o acesso da sonda biológica em novas experiências e reduzem a sobreposição de camadas de célula na direção Z.

No entanto, seccionamento de parafina convencional é tedioso e exige habilidade do operador. Cortes de parafina passam por fixação, desidratação, incorporação, cortando e flutuante. Importante, transferir fitas seção do suporte da faca para o banho de água é necessária mas difícil para os operadores Júnior. Especialmente no ar seco, as fitas da seção torce-se devido à eletricidade estática em são difíceis de se desdobrar na superfície de água morna. Para melhorar a seção qualidade, umedecendo a superfície do tecido exposto entre passes de lâmina micrótomo, refrigerando os blocos de cera por imergindo-os em água gelada, ou levantando a umidade com um umidificador perto do micrótomo é recomendada^6,7 . Novos métodos para melhorar a parafina seccionamento incluem híbrido parafina incorporação cryosectioning⁸e setor comercial transferência sistema assistência⁹. Embora esses métodos parcialmente melhorar parafina seccionamento velocidade e qualidade, eles fazem o corte muito mais pesado, e sistemas de transferência de seção comercial são caros.

Neste protocolo, demonstramos como criar equipamentos simples, barato e flexível passo a passo, que podem ser conectado à porta de um micrótomo rotativo. Este equipamento é composto de um canal de seção, um banho de água e um aquecedor com um interruptor de deteção de temperatura. Após o corte, dezenas de seções fluem para o canal de seção e insira o banho de água diretamente, assim se desenrola automaticamente. Isto melhora a eficiência de corte de parafina e faz com que esta tecnologia mais conveniente. Usando este método, mais adultas seções hippocampal do rato, seções de rim de rato adulto, embrionárias 15,5 dias de idade (E15.5) do mouse cérebro seções e olho adulto zebrafish seções foram colhidas em menos tempo e manteve-se intacta mais morfologicamente. Esse método também pode ser usado para outras amostras de tecidos que requerem parafina acelerada de corte, evitando a perda de distinção da seção.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso de Universidade de Nanchang e cuidado Animal.

1. montar o equipamento e conectar o micrótomo

1. Desenha o parâmetro pelos requisitos (Supplementary Figura 1).
2. Submeta o parâmetro para uma fábrica local para fabricar as placas de acrílico.
3. Montar todas as peças na sequência: usar clorofórmio para combinar 7 placas de acrílico comerciais em um tanque com um banho de água e canal de seção (Figura 1).
   Cuidado: Clorofórmio produz substâncias tóxicas quando encontra luz e oxigênio. Monte o aparelho em uma coifa.
4. Instale o elemento de aquecimento elétrico tubular através do orifício na placa de acrílico #1 (Figura 2A, ponta de seta).
5. Para instalar o controlador de temperatura, criar um pequeno furo na placa de acrílico #2 usando uma furadeira elétrica e instale o detector de temperatura (Figura 2A, seta). Instale um termostato digital do tanque (Figura 2A).
   Nota: O detector de temperatura deve ser dentro de 1 cm abaixo da superfície da água.
6. Para fornecer acesso de potência, ajuste a tensão abaixo de 24 V antes de ligar o equipamento.
7. Remova a bandeja de resíduos de corte do micrótomo.
8. Vincule o canal de seções com o suporte da lâmina do micrótomo com selante de silicone neutro (Figura 2B).
   Nota: Não difamar qualquer selante de silicone neutro acima da parte superior da lâmina para que a lâmina velha é facilmente substituída.
9. Secar durante a noite para permitir que o clorofórmio e o tempo de selante de silicone neutro para solidificar.
10. Instale a lâmina para o suporte da lâmina. Despeje a água do banho-maria (Figura 2). A superfície da água só deve tocar a parte superior da lâmina (Figura 2D, cabeça de seta).

2. parafina seccionamento

Nota: Os restos muitas vezes se acumulam nas bordas superiores ou inferiores do bloco de cera e a superfície da água. Estes restos devem ser limpos regularmente.

1. Execute a parafina convencional seccionamento¹⁰.
   1. Aperta o espécime de parafina em um micrótomo rotativo e coloque a lâmina em um suporte de lâmina.
   2. Gire o volante e a seção da amostra.
   3. Transferi a faixa de opções de parafina seccionada para o banho de água morna de 38,5 ° C.
   4. Peguem que as seções sobre o microscópio deslize da superfície da água após o desdobramento.
   5. Seca as lâminas em estufa a 42 ° C durante a noite.
2. Corte de parafina melhorada (Figura 3)
   1. Liga o equipamento.
   2. Abra o aquecedor com interruptor de deteção da temperatura e defina a temperatura alvo entre 38,0 ° C e 40,0 ° C, durante 1 h com antecedência aquecer a água.
   3. Modificar o bloco de parafina, adquirido pela incorporação de parafina; Então coloque o bloco de parafina na braçadeira de fita do micrótomo e travá-lo.
      Nota: As bordas superiores e inferiores do bloco de parafina devem ser alteradas horizontalmente para evitar que a fita de seção de formando um arco e tornando-se incapaz de fluxo através do canal de seções estreitas.
   4. Abordar rapidamente a amostra por mais espessas seções de corte.
   5. Ajuste a uma espessura de seção adequada (10 µm por cérebro de rato adulto, rato adulto rins e cérebro de rato embrião, 4 µm para olhos do zebrafish). Gire o volante e as seções entra automaticamente o canal de seções e banho.
   6. Seção da amostra em um curso de corte de lenta e uniforme (Figura 3A).
      Nota: Thethickness da primeira seção serão alterados depois que o volante foi interrompido por alguns minutos. As lâminas descartáveis devem ser substituídas quando as seções tem arranhões consecutivos.
   7. Orientar as seções na câmara de banho para flutuar em uma linha (Figura 3B, 3C).
      Nota: Se seção head adere à parede da câmara, utilize um guia de escova para mantê-lo flutuando.
   8. Aderir a seções em corrediças do microscópio. Após as seções totalmente desdobrar-se em banho-Maria, separadas várias seções com uma pinça. Então pegá-las com o banho de água para as lâminas de microscópio (Figura 3D).
      Nota: Seções devem ser recolhidas a parte posterior do banho de água, como aqueles no anterior do banho de água e o canal de seções não ainda será totalmente desdobradas.
   9. Seca as lâminas, colocando-os em um forno de 42 ° C durante a noite. Os slides podem ser armazenados à temperatura ambiente por tempo indeterminado.
3. Use a coloração de hematoxilina-eosina (HE) por uma questão de avaliação do melhor método⁸.

Resultados

O método melhorado aumentou o número de cortes de parafina intacta. Nós testamos este novo método no tecido hippocampal do rato adulto, rato adulto rins, cérebro de rato embrionárias e olhos do zebrafish. Água foi adicionada ao tanque, e a temperatura da água foi mantida entre 38,0 ° C e 40,0 ° C. Depois de uma série preparar as amostras de tecido, foram seccionados e comparados com corte convencional. O novo método de evitar a perda de seção e aumentou a proporção de seç...

Discussão

Para melhorar a morfologia de seção de parafina e resolver o problema do desperdício de tempo durante o corte de parafina convencional, criamos uma parafina melhorada método que combina o corte e o desdobramento de seccionamento. Este método de melhoria se baseia em equipamento simples que compreende um canal de seção, um banho de água e um aquecedor com um interruptor de deteção de temperatura. A faixa de opções da seção entra o banho de água através do canal de seção e desenrola-se automaticamente dur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Boekel Scientific	133000-2
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	64-17-5
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	1330-20-7
Paraplast	Leica	39601006
Heated Paraffin Embedding Module	Leica
Commercial acrylic board
Trichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	67-66-3
Tubular electric heating element(12 V 200 W)
Temperature controller(12 V 120 W)	Mingsuo	XH-W3002
Rotary microtome	Leica
Neutral silicone sealant			Link the water channel with the microtome knife holder
Voltage transformer	Dearll	S-250-12
Disposable blade	Accu-Edge	4689
Hematoxylin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Eosin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Microslide	Sail Brand	7105
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	10004160
Coverslip	Citoglas	10212424C
Microscope	Carl Zeiss
Hydrochloric acid	Xilong Chemical	7647-01-0
Water bath for paraffin sections	Leica
HistoCore Arcadia C - Cold Plate	Leica
paraffin repellent spray	Thermo Scientific	9990420