La découpe et la méthode flottante pour tissus inclus en paraffine pour le sectionnement

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à améliorer le sectionnement de la paraffine. Cette méthode combine coupe et flottant à l’aide d’une simple chambre thermostatique pour éviter le processus de transfert requis par la méthode conventionnelle. En conséquence, l’efficacité et le nombre de sections de paraffine intacts ont été grandement améliorées.

Résumé

Découpe des tissus inclus en paraffine est largement utilisé en histologie et pathologie. Toutefois, il est fastidieux. Pour améliorer cette méthode, plusieurs sociétés commerciales ont mis au point des systèmes de transfert de section complexe à l’aide de l’eau liquide. Pour simplifier cette technologie, nous avons créé une méthode simple à l’aide de matériel fait maison qui combine coupe et flottant dans une enceinte thermostatique simple ; par conséquent, les sections automatiquement dans le bain d’eau à la surface de l’eau. L’hippocampe du cerveau de souris adultes, reins de souris adulte, cerveaux embryonnaires de souris et yeux de poisson-zèbre adulte ont été coupés à l’aide de paraffine conventionnelle de sectionnement et de la méthode présentée aux fins de comparaison. L’analyse statistique montre que notre méthode améliorée enregistrés fois et produit des Articles de qualité supérieures. En outre, il est facile pour les opérateurs juniors de paraffine sectionnement d’un spécimen entier en peu de temps.

Introduction

Étude morphologique est importante dans la recherche biologique. Bien que la nouvelle technologie a permis aux chercheurs d’observer leurs cibles directement du tissu entier ou organismes^1,2,3, coupant le spécimen en lames minces, suivie d’une coloration, reste le principal la morphologie tissulaire seule méthode fornot mais aussi protéine ciblant directement dans le tissu. Microscopie optique utilise trois types de section : paraffine, congelé et semi-fines. Bien que cryosectioning est commun pour protéger l’antigénicité des tissus, et la préparation des échantillons est simple, la morphologie des tissus conservés est pauvre et impropres à être mince séparation^4,5. Sectionnement de paraffine est la méthode le plus souvent utilisée pour qui présentent une morphologie bien conservée. Comme les spécimens sont déshydratées complètement et incorporés dans la cire, les blocs de paraffine peuvent être conservés indéfiniment. En outre, paraffine sectionnement produit des coupes minces qu’améliorer l’accès de la sonde biologique dans d’autres expériences et réduisent la superposition de couche de cellule dans la direction Z.

Cependant, paraffine conventionnelle de sectionnement est fastidieux et exige des compétences de l’opérateur. Sections de paraffine subissent une fixation, déshydratation, enrobage, découpage et flottant. Ce qui est important, rubans section proviennent du porte-couteau à l’eau du bain est nécessaire mais difficile pour les opérateurs juniors. Surtout dans l’air sec, les rubans de section seront tordre à cause de l’électricité statique et sont difficiles à se dérouler sur la surface de l’eau tiède. Afin d’améliorer la section qualité, humidifier la surface du tissu exposé entre les passages de lame microtome, refroidissement des blocs de cire en l’immergeant dans l’eau glacée, ou le relèvement de l’humidité avec un humidificateur près du microtome est recommandée^6,7 . Des méthodes plus récentes pour améliorer le sectionnement de la paraffine incluent hybride enrobage de paraffine, cryosectioning⁸et section commerciale transfert système assistance⁹. Bien que ces méthodes améliorent partiellement paraffine sectionnant la rapidité et la qualité, ils font la section beaucoup plus encombrante, et systèmes de transfert de la section commerciale sont chers.

Dans ce protocole, nous montrent comment créer des équipements simples, bon marché et flexible étape par étape, qui peuvent être reliée au détenteur d’un microtome à lame. Cet équipement se compose d’un canal de section, un bain d’eau et un appareil de chauffage avec un interrupteur de détection de température. Après la découpe, des dizaines de sections se jettent dans le canal de section et entrer dans le bain d’eau directement, donc qui se déroulent automatiquement. Cela améliore l’efficacité de sectionnement de la paraffine et rend cette technologie plus commode. En utilisant cette méthode, plus adulte souris hippocampe sections, sections de rein de souris adultes, embryonnaires 15,5 sections jour-vieux (E15.5) souris cerveau et œil de poisson-zèbre adulte sections ont été récoltées en moins de temps et est restées intact plus morphologiquement. Cette méthode peut également être utilisée pour d’autres échantillons de tissus qui requièrent le sectionnement de paraffine accéléré tout en évitant la perte de distinction de la section.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité emploi de l’Université de Nanchang et animalier.

1. Assemblez l’équipement et le Microtome

1. Concevoir le paramètre aux exigences (supplémentaire Figure 1).
2. Envoyer le paramètre à une usine locale pour fabriquer les panneaux acryliques.
3. Assembler toutes les pièces dans l’ordre : chloroforme permet de combiner les 7 planches acryliques commerciales dans un réservoir avec un bain section de canal et de l’eau (Figure 1).
   ATTENTION : Chloroforme produit des substances toxiques lorsqu’il rencontre la lumière et l’oxygène. Assembler l’appareil sous une hotte.
4. Installez l’élément chauffant tubulaire dans le trou en acrylique Conseil #1 (Figure 2 a, , flèche).
5. Pour installer le régulateur de température, créez un petit trou sur le plateau acrylique #2 à l’aide d’une perceuse électrique et installer le détecteur de température (Figure 2 a, , flèche). Installez un thermostat numérique sur le réservoir (Figure 2 a).
   Remarque : Le détecteur de température devrait être moins de 1 cm sous la surface de l’eau.
6. Pour pouvoir accéder, ajuster la tension au-dessous de 24 V avant d’allumer l’appareil.
7. Retirez le bac à déchets section le microtome.
8. Lien vers le canal de sections avec le porte-lame microtome avec un scellant au silicone neutre (Figure 2 b).
   Remarque : Ne pas salir tout mastic silicone neutre au-dessus de la lame afin que la lame usagée est facilement remplaçable.
9. Sécher toute la nuit pour permettre au chloroforme et le temps du mastic silicone neutre pour solidifier.
10. Installer la lame dans le porte-lame. Versez l’eau dans le bain d’eau (Figure 2). La surface de l’eau doit juste toucher la partie supérieure de la lame (tête de flècheFigure 2D, ).

2. sectionnement de paraffine

Remarque : Les débris s’accumulent souvent sur les bords supérieurs ou inférieurs de l’édifice de la cire et la surface de l’eau. Ces débris doivent être nettoyées régulièrement.

1. Effectuer la paraffine conventionnelle la section¹⁰.
   1. Le spécimen de paraffine sur un microtome rotatif et l’insérer la lame dans un porte-pale.
   2. Tourner le volant et le modèle de l’article.
   3. Transférer le ruban de paraffine sectionné dans le bain d’eau chaude de 38,5 ° C.
   4. Ramasser que les sections sur le microscope glissent à la surface de l’eau après dépliage.
   5. Sécher les lames dans une étuve à 42 ° C pendant la nuit.
2. Paraffine améliorée de sectionnement (Figure 3)
   1. Allumez l’appareil.
   2. Ouvrir l’appareil de chauffage avec interrupteur de détection de température et régler la température ciblée entre 38,0 ° C à 40,0 ° C pendant 1 h à l’avance réchauffer l’eau.
   3. Modifier le bloc de paraffine acquis par enrobage de paraffine ; Ensuite, placez le bloc de paraffine sur cassette de serrage du microtome et verrouillez-la.
      Remarque : Les bordures supérieures et inférieures du bloc de paraffine doivent être modifiés horizontalement afin d’éviter le ruban section formant un arc de cercle et de leur incapacité à s’écouler par le canal de sections étroites.
   4. Se rapprocher rapidement l’échantillon par la coupe des sections plus épaisses.
   5. S’adapter à une épaisseur de coupe approprié (10 µm pour les cerveaux de souris adultes, les reins de souris adultes et cerveau de souris embryon, 4 µm pour les yeux de poisson zèbre). Tourner le volant et les sections entrera automatiquement le canal de sections et de bain.
   6. L’article le spécimen dans une course lente et uniforme (Figure 3 a).
      Remarque : Thethickness de la première section sera modifiée après que le volant a été arrêté pendant quelques minutes. Les lames jetables doivent être remplacés lorsque les sections ont des rayures consécutives.
   7. Guidez les sections dans la chambre de bain à flotter en ligne (Figure 3 b, 3C).
      Remarque : Si la section head adhère à la paroi de la chambre, utiliser un guide de la brosse pour le garder flottant.
   8. Respecter les sections sur lames de microscope. Après les sections se déroulent entièrement dans le bain d’eau, séparé de plusieurs sections avec des pincettes. Ensuite, ramasser de l’eau du bain sur les lames de microscope (Figure 3D).
      NOTE : Sections doivent être ramassées de la partie postérieure de la baignoire d’eau, comme ceux de la manche de sections et la partie antérieure de l’eau du bain ne sera pas encore entièrement dépliés.
   9. Sécher les lames en les plaçant dans un four à 42 ° C pendant la nuit. Les lames peuvent ensuite être stockés à température ambiante indéfiniment.
3. Utiliser la coloration hématoxyline-éosine (HE) dans un souci de l’évaluation de la méthode améliorée de⁸.

Résultats

La méthode améliorée a augmenté le nombre de sections de paraffine intact. Nous avons testé cette nouvelle méthode sur souris adulte tissu hippocampique, reins de souris adultes, cerveaux embryonnaires de souris et yeux de poisson-zèbre. L’eau a été ajoutée au réservoir, et la température de l’eau a été maintenue entre 38,0 ° C à 40,0 ° C. Après une série de préparation les échantillons de tissus, ils étaient sectionnés et par rapport aux coupes classiques. La n...

Discussion

Pour améliorer la paraffine section morphologie et résoudre le problème de perte de temps au cours de la paraffine conventionnelle de sectionnement, nous avons créé une paraffine meilleure méthode qui combine la coupe et du dépliage de sectionnement. Cette méthode améliorée s’appuie sur des équipements simples qui comprend un canal de section, un bain d’eau et un appareil de chauffage avec un interrupteur de détection de température. Le ruban de la section entre le bain d’eau à travers le canal de la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Boekel Scientific	133000-2
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	64-17-5
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	1330-20-7
Paraplast	Leica	39601006
Heated Paraffin Embedding Module	Leica
Commercial acrylic board
Trichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	67-66-3
Tubular electric heating element(12V 200W)
Temperature controller(12v 120w)	Mingsuo	XH-W3002
Rotary microtome	Leica
Neutral silicone sealant			Link the water channel with the microtome knife holder
Voltage transformer	Dearll	S-250-12
Disposable blade	Accu-Edge	4689
Hematoxylin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Eosin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Microslide	Sail Brand	7105
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	10004160
Coverslip	Citoglas	10212424C
Microscope	Carl Zeiss
Hydrochloric acid	Xilong Chemical	7647-01-0
Water bath for paraffin sections	Leica
HistoCore Arcadia C - Cold Plate	Leica
paraffin repellent spray	Thermo Scientific	9990420