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기사 소개

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  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
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  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

여기, 선물이 파라핀 단면 개선 하는 프로토콜. 이 메서드는 절단 하 고 종래의 방법에 필요한 전송 프로세스를 피하기 위해 간단한 온도 챔버를 사용 하 여 부동을 결합 합니다. 그 결과, 효율과 그대로 파라핀 섹션 수가 크게 개선 했다.

초록

파라핀 끼워 넣어진 조직의 단면 조직학 및 병 리에 널리 사용 됩니다. 그러나, 그것은 지루한입니다. 이 방법을 개선 하기 위해, 여러 상업 회사 유체 물을 사용 하 여 복잡 한 섹션 전송 시스템을 고안 했다. 단순화 하기 위해이 기술을, 우리가 만든 결합 절단 및 간단한 항 온 챔버; 내 부동 수 제 장비를 사용 하 여 간단한 방법 따라서, 섹션 자동으로 물 표면에 물 목욕을 입력합니다. 성인 쥐 두뇌, 성인 마우스 신장, 배아 마우스 두뇌, 및 성인 zebrafish 눈에서 해 마는 비교에 대 한 전통적인 파라핀 단면 및 제시 방법 모두를 사용 하 여 절단 했다. 통계 분석이 보여줍니다 우리의 개선된 방법 시간을 저장 하 고 높은 품질 섹션을 생산. 또한, 짧은 시간에 전체 견본의 파라핀 단면 주니어 연산자에 대 한 쉽습니다.

서문

형태학 연구 생물학 연구에서 중요 하다입니다. 새로운 기술 얼룩 뒤에 그들의 목표는 전체 조직 또는 생물1,2,3, 얇은 섹션으로는 시료를 절단에서 직접 관찰 하는 연구를 허용 했다, 남아 있다 기본 메서드 fornot 유일한 조직 형태 뿐만 아니라 조직에서 직접 대상으로 하는 단백질. 가벼운 현미경 검사 법 사용 하 여 세 가지 섹션 유형: 파라핀, 냉동, 그리고 semithin. 비록 cryosectioning 조직 antigenicity을 보호 하는 것이 일반적 이며 견본 준비는 간단 하다, 가난 하 고 얇은 단면4,5에 대 한 부적 절 한 유지 조직 형태가 이다. 파라핀 단면 전시 잘 보존 된 형태에 대 한 가장 자주 사용 되는 방법입니다. 표본은 완전히 탈수 하 고 왁 스에 포함 된, 파라핀 블록 무기한으로 저장할 수 있습니다. 또한, 파라핀 단면 얇은 섹션 추가 실험에서 생물학 프로브 액세스를 개선 하 고 셀 레이어 오버레이 Z 방향으로 감소 생산 합니다.

그러나, 전통적인 파라핀 단면 지루한 이며 연산자 기술 요구. 파라핀 섹션에는 고정, 탈수, 포함, 절단, 그리고 떠 받 다. 중요 한 것은, 물 목욕을 칼 홀더에서 섹션 리본 전송은 필요 하지만 어려운 주니어 연산자에 대 한입니다. 건조 한 공기에 (서) 특히 섹션 리본 정전기 때문 트위스트 것과 따뜻한 물 표면에 전개 하기 어렵습니다. 섹션을 개선 하기 위해 품질, 얼음 물에 immersing 또는 톰 근처 가습기로 습도 올리는 왁 스 블록을 냉각 톰 블레이드 가공 패스 사이의 노출 된 조직 표면에 보습6,7 권장 . 파라핀 단면을 개선 하기 위한 새로운 방법 등 하이브리드 파라핀 포함, cryosectioning8, 상업 섹션 전송 시스템 지원9. 비록 이러한 방법을 부분적으로 파라핀을 개선 속도 품질, 단면 그들은 단면 훨씬 더 복잡 하 고, 만들고 상업 섹션 전송 시스템은 비싼.

이 프로토콜을 로타리 톰의 블레이드 홀더에 연결 될 수 있는, 저렴 한 간단 하 고 유연한 장비 단계를 만드는 방법을 보여 줍니다. 이 장비는 구성 섹션 채널, 물 목욕, 온도 감지 스위치 히터. 절단 후, 섹션의 수십 섹션 채널을 흘러 하 고 따라서 자동으로 펼쳐지고 직접 물 목욕을 입력 합니다. 이 파라핀 단면 효율을 향상 하 고이 기술을 더 편리 하 게. 이 방법, 더 성인 마우스 hippocampal 섹션, 성인 마우스 신장 섹션, 배아 15.5 일 된 (E15.5) 마우스 뇌 섹션, 및 섹션 짧은 시간에 수확 하 고 형태학 상으로 더 온전 하 게 남아 있었다 성인 zebrafish 눈을 사용 하 여. 이 메서드는 또한 가속된 파라핀 섹션 구별의 손실을 피하 면 서 단면 필요로 하는 다른 조직 샘플에 대 한 사용할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 동물 관리 및 사용 위원회의 남 창 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 장비를 조립 하 고는 톰을 연결

  1. 디자인 요구 사항 (보충 그림 1) 당 매개 변수.
  2. 아크릴 보드 제조에 현지 공장에 매개 변수를 제출 합니다.
  3. 순서 대로 모든 부품을 조립: 클로 프롬을 사용 하 여 결합 7 상업 아크릴 보드 탱크로 섹션 채널 및 물 목욕 (그림 1).
    주의: 클로 프롬 때 그것은 빛과 산소 독성 물질을 생성 합니다. 증기 두건에서 장치를 조립 한다.
  4. 아크릴 보드 #1 (그림 2A, 화살촉)에 구멍을 통해 전기 요소를 설치 합니다.
  5. 온도 컨트롤러를 설치 하는 전기 드릴을 사용 하 여 #2 아크릴 보드에 작은 구멍을 만들고 온도 검출기 (그림 2A, 화살표)를 설치 합니다. 탱크 (그림 2A)에 디지털 온도 조절기를 설치 합니다.
    참고: 온도 검출기는 수 면 아래 1 cm 이내 이어야 한다.
  6. 전원에 대 한 액세스를 제공 하려면 장비를 켜기 전에 24 V는 전압을 조정 합니다.
  7. 톰에서 섹션 쓰레기 트레이 제거 합니다.
  8. 중립 실리콘 실 란 트 (그림 2B)와 톰 블레이드 홀더를 가진 섹션 채널을 연결 합니다.
    참고: 오래 된 잎은 쉽게 교체할 수 있도록 블레이드 상단 위에 중립 실리콘 실 란 트를 얼룩 하지 마십시오.
  9. 클로 프롬 및 중립 실리콘 실 란 트 시간을 강화 하기 위해 하룻밤 건조.
  10. 블레이드 블레이드 홀더를 설치 합니다. 물 목욕 (그림 2C)에 물을 붓으십시오. 수 면 그냥 블레이드 (그림 2D, 화살표 머리)의 상단을 터치 한다.

2. 파라핀 단면

참고: 파편은 종종 왁 스 블록 및 수 면의 위쪽 또는 아래쪽 가장자리에 누적 될. 이 파편 정기적으로 삭제 해야 합니다.

  1. 전통적인 파라핀10단면을 수행 합니다.
    1. 로타리 톰에 파라핀 포함 견본을 클램프과 블레이드 홀더에 블레이드를 놓습니다.
    2. 수동 핸들을 표본 섹션.
    3. 38.5 ° C 따뜻한 물 목욕을 sectioned 파라핀 리본을 전송 합니다.
    4. 현미경에 섹션 전개 후 물 표면에서 슬라이드를 선택 합니다.
    5. 하룻밤 건조 오븐에서 42 ° C에 슬라이드.
  2. 향상 된 파라핀 단면 (그림 3)
    1. 장치를 켭니다.
    2. 온도 감지 스위치 히터를 열고 40.0 ° C에 미리 따뜻한 물에 1 시간을 38.0 ° C 사이의 대상된 온도 설정 합니다.
    3. 파라핀 포함; 인수 파라핀 블록 수정 그리고 톰의 카세트 클램프에는 파라핀 블록을 놓고 그것을 자물쇠.
      참고: 파라핀 블록의 뛰어난 및 하 부 테두리 섹션 리본 호를 형성 하 고 좁은 섹션 채널을 통해 흐름 수 없습니다 되기에서 방지 하기 위해 가로 수정할 수 합니다.
    4. 신속 하 게 절단 두꺼운 섹션으로 샘플을 접근 한다.
    5. 적합 한 섹션 두께 (성인 쥐 두뇌, 성인 마우스 신장, 및 태아 마우스 두뇌 10 µ m, zebrafish 눈 4 µ m)를 조정 합니다. 수동 핸들으로 바뀌고 섹션 섹션 채널 및 목욕에 자동으로 입력 합니다.
    6. 느리고 균일 한 절삭 스트로크 (그림 3A)에 견본 섹션.
      참고: 첫 번째 섹션의 Thethickness는 몇 분 동안 중지 되는 수동 핸들 변경 될 것입니다. 일회용 블레이드 섹션 연속 긁힌 자국이 있을 때 대체 되어야 한다.
    7. (그림 3B, 3c) 라인에서 떠 목욕 실로 섹션 안내.
      참고: 경우 head 섹션 챔버 벽에 고착, 부동을 브러시 가이드를 사용 합니다.
    8. 현미경 슬라이드에 섹션을 준수 합니다. 섹션 후 완전히 물 목욕, 핀셋으로 별도 여러 섹션에에서 전개. 다음 그들에서 픽업 현미경 슬라이드 (그림 3D)에 물 목욕.
      참고: 섹션 해야 선택 됩니다 물 목욕의 후부에서 섹션 채널 및 물 목욕의 앞쪽에 아직 되지 것입니다 완전히 펼친 대로.
    9. 밤새 42 ° C 오븐에서 그들을 배치 하 여 슬라이드를 건조. 슬라이드 다음 저장할 수 있습니다 실 온에서 무기한.
  3. 개선된 방법8의 평가 위해 얼룩이 지는 Hematoxylin 오신 (그)를 사용 합니다.

결과

개선된 방법 그대로 파라핀 섹션의 수를 증가 했다. 성인 마우스 hippocampal 조직, 성인 마우스 신장, 배아 마우스 두뇌, 그리고 zebrafish 눈에이 새로운 방법을 테스트 했습니다. 물 탱크에 추가 되었다 그리고 40.0 ° c 38.0 ° C 사이 수 온 유지 되었다 순차적으로 준비 후 조직 샘플, 그들은 구분 하 고 기존의 단면에 비해 했다. 새로운 메서드는 섹션 손실을 피할 하 고 성인 마우...

토론

파라핀 섹션 형태를 개선 하 고 기존의 파라핀 단면 동안 시간을 낭비의 문제를 해결, 우리는 향상 된 파라핀 단면 절단 및 전개 방법을 만들었습니다. 이 향상 된 방법은 간단한 장비 섹션 채널, 물 목욕, 온도 감지 스위치 히터에 의존 합니다. 섹션 리본 섹션 채널을 통해 물 목욕을 입력 하 고 자동으로 절단 하는 동안 펼쳐져. 따라서,이 방법은 파라핀 품질과 효율성, 파라핀 성인 마우스 해 마, ?...

공개

저자는이 장치에 대 한 특허를가지고 하 고 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

감사의 말

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 31400936, 31460260)에 의해 지원 되었다, 자연 과학 재단의 장시 성 중국 (20171BAB215020). 우리는 또한이 작업을 지원 하기 위한 난창 대학과 런던 퀸 메리 대학 간의 공동 프로그램을 감사 합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
IncubatorBoekel Scientific133000-2
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid64-17-5
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid1330-20-7
ParaplastLeica39601006
Heated Paraffin Embedding ModuleLeica
Commercial acrylic board
TrichloromethaneSinopharm Chemical Reagent Co.,Lid67-66-3
Tubular electric heating element(12V 200W)
Temperature controller(12v 120w)MingsuoXH-W3002
Rotary microtome Leica
Neutral silicone sealantLink the water channel with the microtome knife holder
Voltage transformerDearllS-250-12
Disposable bladeAccu-Edge4689
HematoxylinBaso Diagnostics Inc.BA-4025
Eosin Baso Diagnostics Inc.BA-4025
MicroslideSail Brand7105
Neutral balsamSinopharm Chemical Reagent Co.,Lid10004160
Coverslip Citoglas10212424C
MicroscopeCarl Zeiss
Hydrochloric acidXilong Chemical7647-01-0
Water bath for paraffin sectionsLeica
HistoCore Arcadia C - Cold PlateLeica
paraffin repellent spray Thermo Scientific9990420

참고문헌

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