Резка и плавающий метод для парафин врезанных тканей для разрезания

Резюме

Здесь мы представляем протокол для улучшения парафин секционирование. Этот метод сочетает в себе резки и плавающие, используя простую термостатический камеру чтобы избежать процесса передачи требуется обычным методом. В результате эффективность и количество нетронутыми парафиновых срезах были значительно улучшены.

Аннотация

Секционирование парафин врезанных тканей широко используется в гистологии и патологии. Однако это утомительно. Чтобы улучшить этот метод, несколько коммерческих компаний разработали сложные Секции систем перевода с помощью жидкости воды. Для упрощения этой технологии, мы создали простой метод, с помощью домашнего оборудования, которое сочетает в себе резки и плавающей внутри простой термостатический камеры; Таким образом разделы автоматически ввести ванну водой на поверхности воды. Гиппокамп от взрослых мыши мозги, Взрослый мыши почки, мозги эмбриона мыши и взрослых рыбок данио глаза были сокращены с помощью обычных парафин секционирование и представленный метод для сравнения. Статистический анализ показывает, что наш усовершенствованный метод сэкономить время и выше качество секций. Кроме того парафин секционирование всего образца в короткое время легко для младших операторов.

Введение

Морфологическое исследование имеет важное значение в биологических исследованиях. Хотя новая технология позволила исследователи соблюдать их целей непосредственно из цельной ткани или организмов^1,2,3, резка образца в шлифов, следуют окрашивание, остается основным метод fornot только ткани морфологии, но и белка, ориентации непосредственно в ткани. Световой микроскопии использует три типа раздела: парафин, замороженные и полутонкая. Хотя cryosectioning является общим для защиты ткани антигенностью, и подготовка образца простой, морфология сохранить ткани бедных и непригодна для тонкого резания^4,5. Секционирование парафин является наиболее часто используемый метод для экспонирования хорошо сохранившиеся морфологии. Как образцы полностью обезвоженной и встроенных в воск, парафиновые блоки могут храниться бессрочно. Кроме того парафин секущей производит шлифов, которые улучшают доступ к биологическим зонд в дальнейших экспериментов и уменьшить наложения слоя клеток в направлении Z.

Однако обычные парафин секционирование является утомительным и требует навыков оператора. Парафиновых срезах проходят фиксацию, обезвоживание, встраивание, резка и плавающей. Важно отметить, что передача разделе ленты из держателя ножа в водяной бане является необходимым, но трудно для младших операторов. Особенно в сухом воздухе раздел ленты будет твист из-за статического электричества и трудно разворачиваться на поверхности теплой воды. Для улучшения раздела качество, смачивая поверхность подвергается ткани между микротом лезвия проходит, охлаждения блоки воск, погружая их в ледяной воде, или повышение влажности с увлажнитель вблизи микротома рекомендуются^6,7 . Новые методы для улучшения парафин секционирование включают внедрение гибридных парафин, cryosectioning⁸и помощи системы передачи коммерческий отдел⁹. Хотя эти методы частично улучшить парафин секционирование скорость и качество, они делают секционирование гораздо более громоздкими, и коммерческий отдел передачи системы являются дорогостоящими.

В этом протоколе мы показали, как создать простой, дешевой и гибкой оборудование шаг за шагом, который может быть подключен к держателю лезвия микротом роторный. Это оборудование состоит из секции канала, на водяной бане и подогреватель с переключателем обнаружения температуры. После резки, десятки разделов впадают в разделе канал и введите ванну водой непосредственно, таким образом разворачивается автоматически. Это повышает эффективность парафина секционирование и делает эту технологию более удобным. Используя этот метод, более взрослой мыши гиппокампа секции, секции почек взрослых мыши, эмбриональных 15.5 дневных (E15.5) мыши мозга секции и взрослых рыбок данио глаз разделы были собраны в меньше времени и более сохранился морфологически. Этот метод может также использоваться для других образцов тканей, которые требуют ускоренного парафин секционирование избегая потери раздела различия.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование комитета университета Наньчан.

1. Монтаж оборудования и подключение микротома

1. Дизайн параметр согласно требованиям (Дополнительные рис. 1).
2. Представляет параметр для местной фабрике для производства акриловой доски.
3. Собрать все части в последовательности: используйте хлороформ объединить 7 коммерческих Акриловые плиты в бак с раздел канала и водой ванну (рис. 1).
   Предупреждение: Хлороформ производит токсичных веществ, когда он встречает света и кислорода. Соберите аппарат в зонта.
4. Установка трубчатых электронагревательных элементов через отверстие в акриловые Совет #1 (рисунок 2A, стрелки).
5. Чтобы установить контроллер температуры, создать небольшое отверстие на #2 акриловые доске с помощью электродрели и установить датчик температуры (рисунок 2A, стрелка). Установка цифровой термостат на танк (рис. 2A).
   Примечание: Датчик температуры должна быть в пределах 1 см ниже поверхности воды.
6. Чтобы обеспечить доступ к власти, отрегулируйте напряжения ниже 24 V до поворота на оборудовании.
7. Удалите из микротома сборник обрезков.
8. Свяжите канал разделы с держателя лезвий микротома с нейтральный силиконовый герметик (рис. 2B).
   Примечание: Не мазок любой нейтральный силиконовый герметик выше верхней части лезвия так, чтобы старые лезвие легко заменяется.
9. Сухая на ночь, чтобы позволить хлороформе и нейтральный силиконовый герметик время закрепить.
10. Установите лезвие в держатель лезвий. Налейте воду в водяной бане (рис. 2 c). Поверхность воды необходимо просто коснуться верхней части лезвия (голова стрелка2D фигура, ).

2. парафин секционирование

Примечание: Мусора часто накапливаются на верхнего или нижнего края блока воска и поверхности воды. Этот мусор должен регулярно очищаться.

1. Выполните секционирование¹⁰обычных парафина.
   1. Зажим парафин врезанных образца на микротом роторный и поместите лезвие в держатель лезвий.
   2. Поверните маховик и раздел образца.
   3. Передача парафин секционного ленты в ванну теплой водой 38,5 ° С.
   4. Подберите секции на Микроскоп скользить от поверхности воды после разворачивается.
   5. Сухие слайды в духовке при 42 ° C на ночь.
2. Улучшенная парафин секционирование (рис. 3)
   1. Включите оборудование.
   2. Откройте нагреватель с обнаружения переключатель температуры и задайте целевой температуры между 38,0 ° C до 40.0 ° C для 1 h заранее для теплой воды.
   3. Изменение блока парафин, приобретенного путем встраивания парафин; затем поместите блок парафина на микротом кассетный зажим и зафиксируйте его.
      Примечание: Верхние и нижние границы парафин блока должна быть изменена горизонтально для предотвращения разделе ленты от формирования дуги и становится не в состоянии потока через узких каналов.
   4. Быстро подход образец путем резки толще секций.
   5. Приспособиться к толщине подходящего раздела (10 мкм для взрослых мыши мозги, почки взрослого мыши и мозги эмбриона мыши, 4 мкм для глаз данио рерио). Поверните маховик и разделы автоматически войдет в разделах канала и ванны.
   6. Раздел образца в медленный и единообразных резки инсульта (рис. 3A).
      Примечание: Thethickness первой секции будут изменены после маховичок был остановлен на несколько минут. Одноразовые лезвия должны быть заменены, если секции имеют подряд царапин.
   7. Руководство разделы в зале ванна плавать в линии (рис. 3B, 3 C).
      Примечание: Если раздел head придерживается к стенке камеры, используйте кисть руководство держать его плавающим.
   8. Придерживаться секции на скольжениях микроскопа. После разделов полностью разворачиваться на водяной бане, несколько секций с помощью пинцета. Затем забираете их из водяной бани на скольжениях микроскопа (рис. 3D).
      Примечание: Секции должна быть подобрана из задней водяной бане, как те в разделах канала и передней водяной ванны не еще будет полностью развернута.
   9. Сухие слайды, помещая их в 42 ° C печь на ночь. Слайды можно затем храниться при комнатной температуре на неопределенный срок.
3. Используйте гематоксилином-эозином (он) пятная ради оценки усовершенствованный метод⁸.

Результаты

Улучшенный метод увеличилось количество нетронутыми парафиновых срезах. Мы протестировали этот новый метод на взрослых мыши гиппокампа ткани, взрослых мыши почки, мозги эмбриона мыши и данио рерио глаза. Вода была добавлена в бак, и температура воды поддерживался меж...

Обсуждение

Для улучшения парафин раздела морфология и решить проблему потери времени при резании обычных парафин, мы создали более парафин, секционирование метод, который сочетает в себе резки и разворачивается. Этот улучшенный метод основывается на простой оборудования, которое включает разде?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Boekel Scientific	133000-2
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	64-17-5
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	1330-20-7
Paraplast	Leica	39601006
Heated Paraffin Embedding Module	Leica
Commercial acrylic board
Trichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	67-66-3
Tubular electric heating element(12 V 200 W)
Temperature controller(12 V 120 W)	Mingsuo	XH-W3002
Rotary microtome	Leica
Neutral silicone sealant			Link the water channel with the microtome knife holder
Voltage transformer	Dearll	S-250-12
Disposable blade	Accu-Edge	4689
Hematoxylin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Eosin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Microslide	Sail Brand	7105
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	10004160
Coverslip	Citoglas	10212424C
Microscope	Carl Zeiss
Hydrochloric acid	Xilong Chemical	7647-01-0
Water bath for paraffin sections	Leica
HistoCore Arcadia C - Cold Plate	Leica
paraffin repellent spray	Thermo Scientific	9990420