切削とフローティング区分のための組織のパラフィン包埋法

要約

ここでは、パラフィン切片を改善するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、切断と従来の方法に必要な転送処理を避けるために簡単な恒温室を使用して浮動小数点を兼ね備えています。その結果、そのままパラフィン切片数と効率が大幅に向上。

要約

組織学や病理学のパラフィン包埋組織の断面が使用されています。ただし、それは面倒です。この方法を改善するためにいくつかの民間企業は、液体の水を使用して複雑な部分転送システムを考案しています。この技術を簡素化し、我々 はカットとシンプルな恒温室; 内フローティングを組み合わせた自家製の機器を使用して単純なメソッドを作成したがって、セクションは自動的に水表面における水の風呂を入力します。アダルト ゼブラフィッシュ目マウス萌芽期の脳、成体マウス腎臓成体マウス脳海馬は、比較のため従来のパラフィン切片と提案手法の両方を使用して切られました。統計分析は、我々 の改良法時間を保存したし、高い品質のセクションを示しています。さらに、短時間で全体の標本のパラフィン切片ジュニア演算子の簡単です。

概要

形態学的研究は、生物学の研究が重要です。新技術は、全体の組織または生物^1,2,3、薄い部分に試料を切断から直接彼らの目標は続いて染色を観察する研究者を許可しているが、プライマリのまま法者は唯一組織形態も組織に直接ターゲット蛋白質。光学顕微鏡を使用して、3 つのセクション タイプ: パラフィン、冷凍、およびグリコールメタクリル。セクショニングは共通組織抗原性を保護するため、試料の準備は簡単です、保有組織形態が悪いと薄い断面^4,5には不向き。パラフィン切片は、保存状態の良い形態を展示するため最もよく使用される方法です。標本は完全に脱水し、ワックスに埋め込まれた、パラフィン ブロックに無期限に格納できます。また、パラフィン切片さらに実験の生物学的プローブ アクセスを改善し、Z 方向に細胞層オーバーレイを削減する薄いセクションを生成します。

しかし、従来のパラフィン切片がかかり、オペレーターのスキルを要求します。パラフィン切片を固定、脱水、埋め込み、切り取り、およびフローティング受けます。重要なは、風呂の水にナイフ ホルダーからセクション リボンを転送するは、ジュニアのオペレーターのためには必要なは難しいです。乾いた空気で特にセクション リボン静電気によるねじれが、暖かい水面に展開しにくい。セクションを改善するために品質、氷の水でそれらを浸すことまたはミクロトーム近く加湿器で湿度を上げるワックス ブロックを冷却のミクロトーム刃パス間公開される組織表面を潤し、^6、7をお勧めします.ハイブリッド パラフィン包埋、セクショニング⁸、および商業部門転送システム支援⁹パラフィン切片を改善するための新しいメソッドが含まれます。これらのメソッドは、部分的にパラフィンを向上させる彼らははるかに厄介な断面を作る、商務部搬送システムは高価なセクショニング速度と品質。

このプロトコルでは、簡単、安価で柔軟な装置ステップバイ ステップ、回転式ミクロトームのナイフ ホルダーに接続することができますを作成する方法を示します。この装置は、温度検出スイッチ付きのヒーター、水風呂セクション チャネルで構成されます。切断した後、セクションの数十はセクション チャネルに流れるし、風呂の水、直接このように自動的に展開を入力します。これはパラフィン切片の効率が向上し、この技術をより便利になります。このメソッドよりアダルト マウス海馬セクション、成体マウス腎臓セクション、胚 15.5 日齢 (E15.5) マウスの脳のセクション、およびセクションを短い時間で収穫し、形態学的によりそのまま残った大人ゼブラフィッシュ眼を使用します。このメソッドは、加速されたパラフィン セクション区別の喪失を回避しながら断面を必要とする他の組織サンプルの使用もできます。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアと使用南昌大学委員会によって承認されています。

1. 機器をアセンブルし、ミクロトームを接続

1. 要件 (補助図 1) あたりパラメーターを設計します。
2. アクリル板を製造するローカル工場にパラメーターを送信します。
3. シーケンスのすべての部品を組み立てる: クロロホルムを使用してタンクに 7 商業アクリル板を組み合わせてセクション チャネルと水お風呂 (図 1)。
   注意: 光と酸素を満たしているとき、クロロホルムは有毒物質を生成します。ヒューム フードの装置を組み立てます。
4. アクリル板 #1 (図 2 a,矢印) に穴を介して管状電気加熱要素をインストールします。
5. 温度コント ローラーをインストールするのには、電気ドリルを使用して #2 アクリル板に小さな穴を作成し、温度検出器 (図 2 a,矢印) をインストールします。タンク (図 2 a) にデジタル サーモスタットをインストールします。
   注: 温度検出器は水面下 1 cm 以内にする必要があります。
6. 電源アクセスを提供するために、機器の電源を入れる前に 24 V 以下の電圧を調整します。
7. ミクロトームから切片屑トレーを取り外します。
8. 中立的なシリコーン ・ シーラント (図 2 b) ミクロトーム ナイフ ホルダーを含むセクション チャネルにリンクします。
   注: 刃の上の上の中立シリコーン ・ シーラント中傷されず古い刃は簡単に交換できるようにします。
9. クロロホルムと固化する中立的なシリコン シール剤の時間を許可するために一晩乾燥させます。
10. ブレード ホルダーに刃をインストールします。(図 2) 風呂の水に水を注ぐ。水表面だけブレード (図 2 D,アロー ・ ヘッド) の上部に触れる必要があります。

2. パラフィン切片

注: 破片は、多くの場合ワックスのブロックと水の表面の上下端に蓄積します。この残骸は、定期的にクリアする必要があります。

1. 従来のパラフィン切片¹⁰を実行します。
   1. 回転式ミクロトームのパラフィン包埋標本をクランプし、ブレード ホルダーにブレードを配置します。
   2. ハンド ホイールを切り、標本をセクションします。
   3. パラフィン切片のリボンを 38.5 ° C の温水浴に転送します。
   4. 顕微鏡にセクションを展開した後の水面からスライドをピックアップします。
   5. 42 ° C のオーブンでスライドを一晩乾かします。
2. 改良されたパラフィン切片 (図 3)
   1. 機器の電源を。
   2. 温度検出スイッチでヒーターを開き、40.0 ° C 1 時間事前に水を暖めるために 38.0 ° C 間ターゲットの温度を設定します。
   3. パラフィン包埋にしたパラフィン ブロックを変更します。ミクロトームのカセット クランプにパラフィン ブロックを配置し、それをロックします。
      注意: パラフィン ブロックの優れたと劣るボーダーは、円弧を形成し、狭いセクション チャネルを通過することができないからセクション リボンを防ぐために水平方向に変更ください。
   4. 切断より厚いセクションでサンプルの迅速なアプローチします。
   5. 適切なセクションの厚さ (成体マウスの脳、成体マウス腎臓、胎児マウスの脳に 10 μ m、ゼブラフィッシュの目 4 μ m) を調整します。ハンド ホイールを切り、セクションは、セクション チャネルと風呂に自動的に入力されます。
   6. ゆっくりと均一な切断ストローク (図 3 a) で標本をセクションします。
      注: ハンド ホイールが数分間停止した後の最初のセクションが変更されます。セクションは連続した傷がある場合、替刃を置き換える必要があります。
   7. ライン (図 3 b、3 C) で浮かぶ風呂室にセクションをガイドします。
      注: 場合は head セクションは、チャンバー壁に準拠して、浮いた状態を保つにブラシ ガイドを使用します。
   8. 顕微鏡スライド上にセクションを遵守します。セクションの後完全に風呂の水、ピンセットで別のいくつかのセクションで展開します。顕微鏡のスライド (図 3 D) に風呂の水からそれらをピックアップします。
      注: セクションする必要がありますピックアップする水のバスの後方からセクション チャネルと水お風呂の前のそれらがまだできないので完全に展開。
   9. 一晩 42 ° C のオーブンでそれらを配置することによって、スライドを乾燥します。スライドは、無期限に室温で格納されることができます。
3. ヘマトキシリン ・ エオジン (HE) 染色法の改良⁸の評価のために使用します。

結果

改善方法は、そのままパラフィン セクションの数を高めた。成体マウス海馬組織、成体マウス腎臓、マウス萌芽期の脳、ゼブラフィッシュの目のこの新しいメソッドをテストしました。タンクに水を追加し、40.0 ° c. に 38.0 ° C 水の温度に維持されました。準備した後、順次組織サンプル、切断され、従来区分と比較しています。新しいメソッドは、断面欠損を回避?...

ディスカッション

パラフィン セクション形態を改善し、従来のパラフィン切片中の無駄な時間の問題を解決するには、改良されたパラフィン切片作製法切削と展開を組み合わせたを作成しました。この改良法は、セクション チャネル、水浴と温度検出スイッチとヒーターで構成されるシンプルな機器に依存します。セクション リボン セクション チャネルを介して水の風呂に入るし、自動的に切削しながら?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Boekel Scientific	133000-2
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	64-17-5
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	1330-20-7
Paraplast	Leica	39601006
Heated Paraffin Embedding Module	Leica
Commercial acrylic board
Trichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	67-66-3
Tubular electric heating element(12 V 200 W)
Temperature controller(12 V 120 W)	Mingsuo	XH-W3002
Rotary microtome	Leica
Neutral silicone sealant			Link the water channel with the microtome knife holder
Voltage transformer	Dearll	S-250-12
Disposable blade	Accu-Edge	4689
Hematoxylin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Eosin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Microslide	Sail Brand	7105
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	10004160
Coverslip	Citoglas	10212424C
Microscope	Carl Zeiss
Hydrochloric acid	Xilong Chemical	7647-01-0
Water bath for paraffin sections	Leica
HistoCore Arcadia C - Cold Plate	Leica
paraffin repellent spray	Thermo Scientific	9990420