载脂蛋白 E 缺乏小鼠盐皮质激素受体的活化诱导动脉粥样硬化斑块的研究

摘要

我们描述了一种通过连续释放醛固酮来诱导动脉粥样硬化饮食喂养的鼠主动脉根部动脉粥样硬化的协议。还介绍了斑块组成的表征方法。

摘要

动脉粥样硬化是由于慢性炎症反应, 影响血管内皮, 并促进了一些因素, 如高血压, 血脂异常和糖尿病。迄今为止, 有证据支持将醛固酮作为心血管疾病发展的危险因素。转基因小鼠模型已经生成, 以研究细胞和分子过程导致动脉粥样硬化。在这篇手稿中, 我们描述了一个协议, 利用持续输液醛固酮^/小鼠和产生动脉粥样硬化斑块在主动脉根后4周的治疗。因此, 我们说明了一种定量和定性的方法, 在主动脉根水平动脉粥样硬化病变。醛固酮输液的附加价值表现为在4周的治疗后产生富含脂质和炎症细胞的动脉粥样硬化病变。我们详细描述的染色程序, 以量化脂质和巨噬细胞的内容内的斑块。值得注意的是, 在本议定书中, 我们在 OCT 中进行心脏组织嵌入, 以保持心脏组织的抗原性, 并促进感兴趣抗原的可探测性。对斑块表型的分析是研究动脉粥样硬化发育的病理生理学的有效方法, 为抗动脉粥样硬化药物的开发寻找新的药理靶点。

引言

动脉粥样硬化是全球¹的死亡率和发病率的主要原因之一。它的特点是慢性炎症状态, 血管被脂质和白细胞渗透, 确定动脉粥样硬化斑块的形成。大多数急性心脏事件与血栓事件有关, 因为斑块破裂。容易破裂的斑块被定义为 "易受伤害", 其特征是促炎白细胞、坏死核和薄纤维帽²的浸润增加。在过去的几十年中, 临床和实验研究已经澄清了复杂的病理生理学的疾病。几种动物模型用于研究诱导动脉粥样硬化³的分子机制。目前, 老鼠是最常用的研究动脉粥样硬化的物种, 尽管与人类相比, 它的病理生理学存在一些特定物种的差异。特别是, 循环胆固醇主要由高密度脂蛋白 (具有 antiatherogenic 性质) 在小鼠模型, 而在人类循环胆固醇主要作为低密度脂蛋白 (LDL), 可能代表野生型小鼠不发育自发性动脉粥样硬化⁴的主要原因。此外, 野生型小鼠一般对从饮食中吸收胆固醇有抵抗力, 而人类吸收了约50% 的膳食胆固醇⁴。为了克服这些局限性, 已经生成了几种转基因老鼠模型。载脂蛋白 E–deficient 鼠 (ApoE^−/−) 和 LDL receptor–deficient 小鼠 (LDLr^−或−) 被广泛使用。在高脂肪高胆固醇饮食, apoe⁻小鼠发展斑块比 LDLr^−或−小鼠更加快速地开发, 并且为此, 使用 ApoE^−或−老鼠是更加广泛地比那 LDLr^−或−老鼠^5,6。虽然小鼠斑块不表现出不稳定的表型⁷, 但在动脉粥样硬化的任何阶段都能产生病变, 并可与人类观察到的一样。一般情况下, ApoE^-−小鼠自发地发展动脉粥样硬化, 这个过程是加速与西方饮食³。动脉粥样硬化的严重性可以评估在颈动脉, 肺, 股骨和头臂大动脉动脉的水平, 和主动脉根⁶。特别是, 主动脉根代表一个解剖部位容易发展的小鼠动脉粥样硬化病变。因此, 对该地区动脉粥样硬化斑块的形成进行评价是常见的做法。

几项研究表明, 醛固酮与动脉粥样硬化^8、9、10的发展有牵连。醛固酮在动脉粥样硬化饮食中的作用, 促进了主动脉根动脉粥样硬化病变的发生, 诱发发炎和富含脂质的斑块形成¹⁰。

总之, 我们描述了一个协议, 包括醛固酮输液, 动脉粥样硬化饮食喂养, 植入心脏组织, 量化和定性的动脉粥样硬化病变的鼠。这一过程促进了有效的形成发炎, 富含脂质的动脉粥样硬化斑块, 并代表了一个宝贵的模型, 研究动脉粥样硬化。

研究方案

这项研究被意大利国立卫生保健和使用委员会批准, 授权号码 493/2016-公关。所有程序都是按照欧洲共同体关于使用实验动物的指导方针进行的 (欧洲指令, 2010/63/UE)。

注: 渗透 minipump 的皮下植入 (含乙醇盐溶液) 或醛固酮 (240 µg ·千克^-1 · d^-1) 在8-10 周大的雄性小鼠中缺乏对ApoE基因的治疗。一般情况下, 8-10 周大的雄性脂蛋白^−/−小鼠的体重约为25-26 克。

1. 溶解醛固酮

1. 将5毫克醛固酮粉溶于1毫升的绝对乙醇中。
2. 添加56.7 µL 醛固酮 (溶于乙醇) 到68.3 µL 盐水溶液中, 以获得浓度为2.27 的µg/µL. 用此解决方案的 125 minipumps 完全填充整个渗透µL (每个 minipump 的最大容量为125µL)。
3. 使用 minipump 流率为0.11 µL/小时;所以解答的2.64 µL 被发布每 24 h. 给每只老鼠大约6µg ·^-1的醛固酮28天。

2. 渗透泵充填和注入

注: 泵在两个独立的部件中提供: 泵的主体和流量调节器。

1. 用手术手套填充并处理 minipumps。
   注意: 皮肤油可能会干扰 minipumps 的性能。以下步骤应在无菌层流罩中进行。
2. 将灌装管 (与 minipumps 一起供应) 连接到1毫升注射器上, 并绘制醛固酮溶液或车辆。
   注意: 重要的是要避免让空气中的注射器, 同时从管道中抽出的解决方案, 以防止空气气泡的形成泵。
3. 将填充管插入 minipump 顶部的孔, 直到它不能再进一步 (图 1A-1B)。用醛固酮或车辆慢慢填充泵。注意泵内的暗阴影, 指示液位。看这个水平上升随着灌装泵。
   1. 当一粒液体从泵体内升出时, 停止填充泵。
4. 小心地卸下灌装管并将流量调节器插入 minipump 的主体 (图 1C)。确保调节器与泵体紧密地固定在一起。将填充的渗透泵留在含有无菌盐水溶液的烧杯中, 在37摄氏度内植入鼠标 (启动程序)。
5. 在消毒区进行手术, 70% 乙醇促进无菌。
6. 应用1-3 滴在切口部位0.25% 布比卡因和麻醉的动物与3% 异氟醚。打开供应气体, 将流量计设置为500-1000 毫升/分钟. 将动物放在感应腔内并封上顶部。打开蒸发器到5% 异氟醚和监测鼠标直到卧。
   1. 切换系统以流向 nosecone。从房间和 nosecone 的位置移除动物。2-3 分钟后, 老鼠开始苏醒。用流量计重启气体流量, 100-200 毫升/分, 蒸发器在3% 异氟醚。
   2. 通过测试踏板的提取和眼睑反射, 确保在执行程序前有足够的麻醉深度。监测过程中的呼吸和反应, 并根据需要调整蒸发器。
   3. 通过应用眼科药膏保护角膜不燥。
7. 用剃刀从手术部位取出毛发来准备动物 (图 1D)。通常的皮下植入泵的地方是在后面。
8. 用70% 异丙醇饱和无纺布垫材料制备手术部位。
9. 使用清洁和专用的空间 (消毒70% 乙醇) 和覆盖无菌悬垂。将仪器的尖端放在玻璃珠灭菌器中。用消毒器械开始手术, 并处理器械灌装。
10. 使用手术剪刀做一个 0.8-1 厘米切口 (大约2厘米接近尾部), 如图 1 e-1 f所示。不使用无菌手套或器械提示, 不接触外科专用空间以外的任何东西来维持不孕。
11. 注意不要只切皮肤, 而不要切开底层的组织。用一只手握住镊子打开切口。用另一只手握住套管, 以扩大皮肤, 以便为泵从背部向上到肩胛骨 (在鼠标的右侧或左侧) 创建一个口袋。
12. 将泵插入切口。轻轻地将泵完全推入口袋 (图 1H)。应该有足够的皮肤, 以关闭伤口没有张力或伸展皮肤所需的。一旦泵入 , 缝合切口与手术线 ( polyglactin 910 与缝合大小 6 - 0 )
    注意: 调节器的头必须朝向鼠标的前面 (图 1G)。
13. 应用外用10% 聚维酮/碘软膏与清洁拭子 (图 1I), 并保持在一个温暖的阶段动物。不要让老鼠在无人看管, 直到他们恢复胸骨卧床。评估水化状态, 并在必要的情况下执行0.5 毫升0.9% 盐水溶液。把动物送回它的日常住房。
14. 遵循文件的机构指南 (例如, 填写手术和手术后的信息, 更新笼卡与程序和日期), 并提供止痛药 (丁丙诺啡, 0.05 毫克/千克), 以减少术后疼痛和抗生素 (恩诺沙星85毫克/千克), 以避免术后感染。
    1. 继续每日监测并检查是否有疼痛迹象。注意伤口完全闭合, minipump 被保存到皮下袋中。伤口可能会打开, 老鼠可能会失去 minipump。

3. 心脏解剖

1. 在牺牲的时候, anestethize 老鼠用80-100 毫克/公斤的 Zoletil 管理肌肉。Zoletil 诱发深度麻醉。注意: 通过测试踏板和眼睑反射, 检查老鼠在执行程序之前是否处于足够的麻醉深度;小鼠将在深麻醉下灌注。用剪刀和镊子打开胸腔, 将肋骨侧向胸骨切开, 胸骨被缩回头部。
2. 灌注鼠通过左心室重力灌注系统与10-15 毫升冰冷 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水溶液 (PBS), 然后与40-50 毫升10% 的中性缓冲福尔马林修复血管。当小鼠表现出剧烈的肌肉收缩并变得僵硬时, 就表示固定。
   注: 固定过程在10-20 分钟内进行。可以使用固定器官和组织进行免疫荧光或免疫组化分析。重要的是, 这种固定组织不能用于基因表达和西方印迹分析。
3. 用钳夹住心脏, 用剪刀或手术刀刀片将心脏与主动脉分开, 垂直于主动脉的轴线, 尽可能靠近心脏而不造成损伤 (图 2A)。使用手术刀刀片沿直线进行横向切割, 连接右侧和左心房的下点 (图 2B)。
4. 用最佳切割化合物 (OCT) 填充切片心脏的上部 (通过心脏的腔) (图 2D-2E)。把组织内的 cryosection 塑料模具与主动脉的轴垂直放置在矩形模具的底部和覆盖与 OCT (图 2F)。不应该有气泡被困住。如果出现任何气泡, 请尝试将其替换为边缘。
5. 将金属板放在干冰上, 然后小心地将模具放在 (图 2G) 上。当 OCT 变成白色时, 用银箔包裹模具, 然后存储在–80°c。

4. 主动脉根部截割部分

1. 将恒温器机设置为–20°c。切割前, 放置嵌入的组织, 并留在那里约15分钟, 以适应这种温度。将试样架温度设置为-17 摄氏度 (图 3A)。
2. 将冰冻的心块放在恒温器机内, 平衡恒温器的温度 (图 3B), 从模具中取出冰冻的心块 (图 3C)。将多余的 OCT 从冻结块中剪下来, 以便更好地将块尺寸调整到标本架上 (图 3D)。
3. 将冷冻心块安装在以心室向外 (图 3E-3I) 为导向的标本架上, 并将标本持有者插入定向头部的标本 (图 3J)。调整标本架的方向, 允许切割块, 使主动脉根垂直于刀片 (图 3K)。
4. 剪切块并丢弃切片, 直到到达主动脉根 (图 3L-3N)。收集串行部分并将它们放在玻璃幻灯片上 (图 3O)。在显微镜下观察主动脉根部解剖剖面, 直到所有3主动脉瓣出现 (图 3P-3Q)。
5. 收集部分在10µm/节为油红色 O 和 Picro 天狼星红色染色, 并在6µm/切片 MAC3 染色 (图 3R)。收集大约6-8 张幻灯片 (为每个心脏), 直到三个阀门之一消失或不再完好无损。

5. 免疫组化

注意: 下列协议中报告的所有染色步骤均在玻璃 Coplin 染色罐中进行。

1. 中性脂肪油红色 O 染色
   1. 修复70毫升37% 甲醛的部分5分钟, 在自来水中洗好, 并涂抹多余的水。
   2. 稀释48毫升油红色 o (0.5% 在异丙醇) 在32毫升蒸馏水获得油红色 o 0.3%。
   3. 在70毫升的油红色 O 0.3% 的染色段10分钟, 自来水中的洗涤段为10分钟。
   4. 在梅尔的苏木精中70毫升染色1分钟。用自来水冲洗部分1分钟。
   5. 浸入70毫升0.5% 碳酸锂的部分。在自来水中洗1分钟。
   6. 安装带有水上安装介质的部分, 并使用安装在光显微镜上的数码相机捕捉图像。
2. Picro 天狼星红染色胶原蛋白
   1. 剪切10µm 冻结部分并装入幻灯片底部。
   2. 固定在70毫升丙酮5分钟, 空气干燥, 并在蒸馏水简要冲洗。
   3. 将节放在70毫升0.2% 钼酸中, 在蒸馏水中简要冲洗5分钟。
   4. 地方部分在70毫升 0.1% Picro 天狼星解决方案90分钟冲洗一次与70毫升 0.01 N HCl. 丢弃解决方案。
   5. 在70毫升 0.01 N HCl 中放置2分钟, 在蒸馏水中简要冲洗。空气干燥。
   6. 简要地安置在70毫升70% 乙醇。
   7. 当完全干燥时, 放置在70毫升的萜烯起源和登上节的清除剂使用聚 (甲基丙烯酸丁酯-甲基丙烯酸酯) 为基础的安装介质和捕捉图像使用一个数码相机安装在光显微镜。
      注意: Picro 天狼星红色染色的优点之一是可以用偏振光显微镜鉴别 i 型 (粗纤维、黄橙双折射) 和 III 型 (薄纤维、绿色双折射) 胶原纤维网络¹¹.
3. 巨噬细胞染色的 Mac3 染色
   1. 剪切6µm 冻结部分并装入幻灯片底部。
   2. 固定部分70毫升的冷丙酮5分钟浸泡在70毫升的 PBS 为2分钟。
   3. 使用吸管, 覆盖部分与1% 的月桂酸钠溶液和孵化5分钟室温 (RT) 抗原检索。浸泡70毫升 PBS 5 分钟。
   4. 使用吸管, 覆盖切片与0.3% 过氧化氢20分钟洗涤70毫升 PBS 3 次, 5 分钟。
   5. 使用亲和生物素配合物 (ABC)-酶试剂盒为以下步骤。
   6. 使用吸管, 在常温下阻断正常家兔血清中20分钟的切片。不要冲洗掉。
   7. 用 MAC3 (1:300) 染色90分钟, 在室温下清洗70毫升 PBS 3 次, 5 分钟。
   8. 用二生物素化抗鼠 IgG (1:200) 染色45分钟. 用70毫升 PBS 冲洗3次, 5 分钟。
   9. 用兔子 IgG ABC 在 RT 上覆盖30分钟. 用30毫升 PBS 冲洗3次, 5 分钟。
   10. 用 3-氨基-9-咔唑 (AEC) 覆盖切片10分钟, 用70毫升蒸馏水冲洗10次。
   11. 在梅尔的苏木精中70毫升染色1分钟。用自来水冲洗部分1分钟。
   12. 浸入70毫升0.5% 碳酸锂的部分。在自来水中洗1分钟。
   13. 安装带有水上安装介质的部分, 并使用安装在光显微镜上的数码相机捕捉图像。

6. 主动脉根段动脉粥样硬化病变的影像学分析

注: 用适当的软件 (在材料表中标明), 用油红色 O 或 MAC3 或抗体来分析主动脉根部分。总的像素染色阳性成分的利益是规范化的总斑块面积。图像由治疗盲调查员收集和分析。

1. 校准
   1. 打开软件, 然后选择要分析的图像 (以 jpg 格式)。
   2. 选择首页|创建|快速校准。
   3. 通过沿图像的缩放条绘制一条直线来设置图像的校准。
   4. 保存校准设置。
2. 图像分析
   1. 从"选项" 菜单中选择保存的安装校准 |空间校准选项。
   2. 选择校准|申请。
   3. 选择 "选择" 菜单上的 "多边形" 工具, 并沿所有动脉粥样硬化病变绘制周长。
   4. 选择计数/大小|类型。从菜单中, 添加区域和百分比区域。
   5. 从 "计数/大小" 菜单中, 选择 "手动", 将打开一个新窗口。
   6. 在此窗口中单击图像工具上的选取颜色, 然后选择HSI模式。
   7. 将鼠标光标指向感兴趣标记的正像素, 以创建颜色范围。
   8. 单击计数, 并在测量表中观察到的值总和, 表示在动脉粥样硬化病变的总面积 (也表示在µm²) 中的标记区域的百分比。

结果

在8-10 周内 , minipumps 被植入用汽车或醛固酮 (图 1E-1I) 注入, 并喂养了动脉粥样硬化饮食 (调整卡路里饮食42% 从脂肪) 4 周。在治疗结束时, 小鼠被安乐死, 并以 PBS 和10% 福尔马林灌注, 如上文所述。主动脉根从心脏的顶端部分分离, 并嵌入 OCT (图 2)。用恒温器机对主动脉根部的横断面进行不同的染色, 如

讨论

动脉粥样硬化是一种与大中型血管有关的慢性炎症性疾病, 涉及多种细胞类型之间的相互作用, 如巨细胞、T 淋巴细胞、内皮细胞和平滑肌细胞¹。尽管小鼠动脉粥样硬化模型有局限性, 但在动脉粥样硬化过程中有大量的证据可供选择。这些模型具有快速生成特定年龄和性别的实验组的优势。小鼠也表现出一个定义的和同源的遗传背景。

动脉粥样硬化斑块的发?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat)	Envigo	TD.88137	atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube	Alzet	model 1004	for continous realase
Aldosterone	SIGMA	A9477	hormone
Ethanol	SIGMA	34852-M	solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol	Kendal Webcol	6818	Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0)	Demas	500004	surgery
10% Povidone/iodine ointment	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	Antiseptic
Formalin 10%	SIGMA	HT5012	to fix vascolature
Cryomold	Bio-Optica	07-MP1515	for embedding
O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	for embedding
Cryostat	Leica	CM1900	instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Aurogene	AU-L0615-500	buffer solution
Adhesion Slides Polysine	VWR	631-0107	microscope glasses
Cover Glasses	Bio-Optica	72015	cover glasses
Formaldehyde 37%	SIGMA	252549	solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol)	SIGMA	O1391	staining solution
Mayer’s Hematoxylin	SIGMA	MHS32	staining solution
Lithium Carbonate	SIGMA	62470	washing buffer
Acqueous Mounting Medium	Thermo Scientific	TA-125-AM	mounting solution
Acetone	SIGMA	179124	solvent
Phosphomolybdic acid solution	SIGMA	HT153	for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red)	SIGMA	365548	staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin)	Bio-Optica	06-1782D	product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	SIGMA	3989	mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fluka	71725	powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %)	SIGMA	H1009	solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG ,	Vector Laboratories	PK-6100	staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole	Vector Laboratories	SK-4200	staining solution
Mac3 antibody	BD Biosciences	553322	antibody
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	software to analyze images