Induction de Plaques d’athérome grâce à l’Activation des récepteurs minéralocorticoïdes chez les souris déficientes en apolipoprotéine E

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole visant à induire l’athérosclérose à la racine aortique de l’ApoE^{- / -} souris nourries avec un régime athérogène, grâce à un rejet constant de l’aldostérone. Méthodes pour caractériser la composition de la plaque sont également décrites.

Résumé

L’athérosclérose est due à une réaction inflammatoire chronique affectant l’endothélium vasculaire et est favorisée par plusieurs facteurs tels que l’hypertension, la dyslipidémie et diabète. A ce jour, il y a preuve à l’appui d’un rôle pour l’aldostérone en circulation comme un facteur de risque pour le développement des maladies cardiovasculaires. Modèles de souris transgéniques ont été générés pour étudier les processus cellulaires et moléculaires, conduisant à l’athérosclérose. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole qui profite d’une perfusion continue de l’aldostérone dans ApoE^{- / -} souris et génère des plaques d’athérome dans la racine aortique après 4 semaines de traitement. Nous avons, par conséquent, illustrent une méthode pour la quantification et la caractérisation des lésions athéroscléreuses au niveau de la racine aortique. La valeur ajoutée de la perfusion d’aldostérone est représentée par la génération des lésions athéroscléreuses riches en lipides et en cellules inflammatoires après 4 semaines de traitement. Nous décrivons en détail les méthodes de coloration afin de quantifier la teneur en lipides et macrophages au sein de la plaque. Notamment, dans ce protocole, nous réalisons le coeur tissu-incorporation en octobre afin de préserver l’antigénicité du tissu cardiaque et faciliter la détection des antigènes d’intérêt. Analyse du phénotype plaque représente une approche valide d’étudier la physiopathologie du développement de l’athérosclérose et d’identifier de nouvelles cibles pharmacologiques pour le développement de médicaments anti-athérogènes.

Introduction

L’athérosclérose est l’une des principales causes de mortalité et morbidité dans le monde¹. Elle est caractérisée par un état inflammatoire chronique où les vaisseaux sanguins sont infiltrés par les lipides et les leucocytes qui déterminent la formation des plaques d’athérosclérose. La majorité des événements cardiaques aigus est associée à des événements thrombotiques en raison de la rupture de la plaque. Sujettes à la rupture des plaques sont définis « vulnérables » et sont caractérisées par l’infiltration accrue des leucocytes pro-inflammatoires, un noyau nécrotique et un couvercle fibreux fin². Au cours des dernières décennies, les études cliniques et expérimentales ont clarifié la physiopathologie complexe de la maladie. Plusieurs modèles animaux sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction de l’athérosclérose,³. La souris est actuellement les espèces les plus fréquemment utilisées pour étudier l’athérosclérose malgré quelques différences propres à chaque espèce existant dans sa physiopathologie en comparaison avec les humains. En particulier, cholestérol en circulation se compose principalement de lipoprotéines de haute densité (avec des propriétés antiathérogènes) dans des modèles murins, tandis que chez les humains en circulation cholestérol est principalement transporté comme les lipoprotéines de basse densité (LDL), probablement ce qui représente la principale raison pourquoi les souris de type sauvage ne développent pas d’athérosclérose spontanée⁴. En outre, souris de type sauvage sont généralement résistantes à l’absorption de cholestérol provenant de l’alimentation, alors que les humains absorbent environ 50 % de cholestérol alimentaire⁴. Pour surmonter ces limites, plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées ont été générés. L’apolipoprotéine E-deficient souris (ApoE^−/−) et LDL récepteur – carence souris (LDLr^−/−) sont largement utilisés. Un régime riche en graisses riche en cholestérol, ApoE^−/− souris développent plaque plus rapidement par rapport aux souris^−−/LDLr, et pour cette raison, l’utilisation de^{souris ApoE−/} est plus répandu que celui de LDLr^−/−souris^5,6. Les souris ApoE^{− −/}développent des lésions à un stade quelconque de l’athérosclérose et sont comparables à celles observées chez les humains, bien que les plaques de souris ne montrent pas un phénotype instable⁷. En général, ApoE^−/− souris développent spontanément l’athérosclérose et ce processus est accéléré par une alimentation occidentale³. La sévérité de l’athérosclérose peut être évaluée au niveau de la carotide, pneumologie, fémorale et artère brachiocéphalique et la racine aortique⁶. En particulier, la racine aortique représente un site anatomique enclin à développer des lésions athéroscléreuses chez la souris. Pour cette raison, il est pratique courante d’évaluer la formation de plaques d’athérome dans cette région.

Plusieurs études ont montré que l’aldostérone est impliquée dans le développement de l’athérosclérose^8,9,10. Perfusion d’aldostérone dans ApoE^−/− souris nourries avec un régime athérogène accélère le développement des lésions athéroscléreuses racine aortique induisant la formation de plaque enflammée et riches en lipides¹⁰.

En résumé, les auteurs décrivent un protocole dont la perfusion d’aldostérone, diète athérogène alimentation, incorporant des tissus cardiaques, quantification et caractérisation des lésions athéroscléreuses dans ApoE^{- / -} souris. Cette procédure favorise une formation efficace des plaques d’athérome enflammées, riche en lipides et représente un modèle précieux pour l’étude de l’athérogenèse.

Protocole

L’étude a été approuvée par l’Italian National Institutes of Health Care et comités d’utilisation, autorisation numéro 493/2016-PR. Toutes les procédures ont été menées par les lignes directrices de la Communauté européenne pour l’utilisation des animaux d’expérimentation (Directive européenne 2010/63/UE).

Remarque : L’implantation sous-cutanée de Minipompe osmotique contenant du véhicule (éthanol en solution saline) ou l’aldostérone (240 µg · kg^-1 · d^-1) en 8-10 semaines-vieux mâles souris déficientes pour le gène ApoE . En général, 8-10 semaines-vieux^−/− ApoE des souris mâles pèsent environ 25-26 g.

1. dissoudre aldostérone

1. Dissoudre 5 mg de poudre de l’aldostérone dans 1 mL d’éthanol absolu.
2. Ajouter 56,7 µL d’aldostérone (dissous dans l’éthanol) à 68,3 µL d’une solution saline afin d’obtenir une concentration de 2,27 µg / µL. Remplissez l’ensemble minipompes osmotiques complètement avec 125 µL de cette solution (capacité maximale de chaque Minipompe est 125 µL).
3. Utiliser un débit Minipompe de 0,11 µL/h ; par conséquent 2,64 µL de la solution est libéré chaque 24 h. donner chacun la souris autour de 6 µg · d^-1 de l’aldostérone pendant 28 jours.

2. implantation et remplissage de la pompe osmotique

Remarque : Les pompes sont fournies en deux parties distinctes : le corps de la pompe et le régulateur de débit.

1. Remplir et gérez les minipompes à l’aide de gants chirurgicaux.
   Remarque : Les huiles pour la peau peuvent interférer avec la performance des minipompes. Les étapes suivantes doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire stérile.
2. Fixer le tube de remplissage (fourni avec le minipompes) à une seringue de 1 mL et établit par la solution de l’aldostérone ou le véhicule.
   Remarque : Il est important de ne pas laisser d’air à l’intérieur de la seringue lors de l’aspiration des solutions du tube pour éviter la formation de bulles d’air dans la pompe.
3. Insérer le tube de remplissage dans le trou en haut de la Minipompe jusqu'à ce qu’il peut pas aller plus loin (Figure 1 a-1 b). Lentement, remplir la pompe avec l’aldostérone ou le véhicule. Remarquez l’ombre à l’intérieur de la pompe qui indique le niveau du liquide. Regardez cette hausse niveau ainsi que la pompe de remplissage.
   1. Arrêter la pompe de remplissage lorsqu’une perle de liquide déborde le corps de la pompe.
4. Avec précaution, retirez le tube de remplissage et insérez le régulateur de débit dans le corps de la minipompe (Figure 1). Assurez-vous que le régulateur est assis solidement contre le corps de la pompe. Laisser les pompes osmotiques remplis dans un bécher contenant une solution saline stérile à 37 ° C pendant 24 h avant l’implantation chez la souris (procédure d’amorçage).
5. Procéder à une chirurgie dans une zone désinfectée avec de l’éthanol 70 % qui favorise l’asepsie.
6. Appliquez 1 à 3 gouttes au site d’incision de bupivacaïne des 0,25 % et anesthésier l’animal à l’isoflurane 3 %. Allumez le gaz d’alimentation et affectez-lui le débitmètre 500-1000 mL/min. Place l’animal dans la chambre de l’induction et sceller la partie supérieure. Allumez le vaporisateur à 5 % isoflurane et contrôler la souris jusqu'à ce que couché.
   1. Changer le système pour s’écouler vers la pointe. Retirer l’animal de la chambre et la position de l’ogive. En 2 ou 3 minutes, la souris commence à s’éveiller. Redémarrez le débit de gaz avec le débitmètre à 100-200 mL/min et le vaporisateur à 3 % isoflurane.
   2. Assurer une profondeur adéquate de l’anesthésie avant de procéder en testant les pédale retrait et réflexes palpébrales. Surveiller la respiration et la réponse à la stimulation au cours de la procédure et réglez vaporisateur si nécessaire.
   3. Protéger la cornée ne se dessèchent pas en appliquant une pommade ophtalmique.
7. Préparer l’animal par l’épilation sur le site chirurgical à l’aide d’un rasoir (Figure 1). Le site habituel pour l’implantation sous-cutanée des pompes est sur le dos.
8. Préparer le site chirurgical avec matériel non-tissé pad saturé d’alcool isopropylique à 70 %.
9. Utiliser un espace propre et dédié (désinfecté avec l’éthanol à 70 %) et recouvert d’un drap stérile. Placez l’extrémité des instruments dans un stérilisateur de perle de verre. Commencer la chirurgie avec des instruments stérilisés et manipuler les instruments aseptiquement.
10. Utiliser des ciseaux chirurgicaux pour faire un 0,8-1 incision cm (environ 2 cm près de la queue), comme le montre Figures 1E-1F. Maintenir la stérilité de ne pas toucher quoi que ce soit en dehors de l’espace dédié chirurgicale avec des gants stériles ou des conseils des instruments.
11. Prenez soin de couper seulement la peau mais pas les tissus sous-jacents. Utilisez une main pour tenir la pince pour ouvrir l’incision. Utilisez l’autre main pour tenir le trocart pour répandre la peau afin de créer une poche pour la pompe de l’arrière vers le haut de l’omoplate (sur le côté droit ou gauche de la souris).
12. Insérez la pompe dans l’incision. Poussez doucement la pompe complètement dans la poche (Figure 1 H). Il devrait y avoir assez de peau libre pour refermer la plaie avec aucune tension ou étirement de la peau nécessaire. Une fois que la pompe a été insérée, suture de l’incision avec fil de chirurgie (polyglactine 910 avec suture taille 6-0)
    Remarque : La tête de l’organisme de réglementation doit être orientée vers l’avant de la souris (Figure 1).
13. Appliquez l’onguent topique de povidone/iode 10 % avec un coton tige propre (Figure 1I) et gardez l’animal sur une phase de réchauffement de la planète. Ne laissez pas de souris en mode sans assistance jusqu'à ce qu’ils récupèrent décubitus sternal. Évaluer l’état d’hydratation et d’administrer 0,5 mL de solution saline à 0,9 % par voie sous-cutanée, si nécessaire. Retourner l’animal à son logement systématique.
14. Suivez les lignes directrices pour la documentation (par exemple, remplir un formulaire de chirurgical opératoire et post-opératoire information, mise à jour carte de cage avec la procédure et la date) et fournir des analgésiques (buprénorphine, 0,05 mg/kg) pour réduire les douleurs postopératoires et antibiotiques (enrofloxacine 85 mg/kg) pour éviter l’infection post-chirurgicale.
    1. Poursuivre la surveillance de tous les jours et examiner les signes de la douleur. Faire attention que la plaie est complètement fermée et Minipompe est maintenu dans la poche sous-cutanée. La plaie peut s’ouvrir et la souris peut perdre la Minipompe.

3. dissection du cœur

1. À l’heure du sacrifice, anesthésier souris avec 80-100 mg/kg de Zoletil administré par voie intramusculaire. Zoletil induit une anesthésie profonde. Remarque : Vérifiez que les souris sont à une profondeur suffisante de l’anesthésie avant de procéder par essais de la pédale et les réflexes palpébrales ; souris vont être perfusés pendant que profondément anesthésiés. Ouvrir la cavité thoracique, à l’aide de ciseaux et pinces, en coupant les côtes latéralement au sternum, avec le sternum réenroulée vers la tête.
2. Perfuse souris via le ventricule gauche par système de perfusion par gravité avec 10 à 15 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco glacee (PBS), puis à 40-50 mL de 10 % de formol tamponné neutre pour fixer le système vasculaire. La fixation est indiquée lorsque les souris présentent des contractions musculaires vigoureux et deviennent rigides.
   Remarque : Le processus de fixation se déroule en 10-20 min. Il est possible d’utiliser les organes fixes et tissus pour effectuer l’immunofluorescence ou des analyses de l’immunohistochimie. Ce qui est important, ces tissus fixés ne peuvent servir pour l’expression des gènes et western blot analyses.
3. Séparer le coeur de l’aorte en tenant le coeur avec la pince et coupe avec des ciseaux ou une lame de bistouri Swann-Morton, perpendiculairement à l’axe de l’aorte, aussi près que possible de cœur sans causer de dommages (Figure 2 a). Utilisez une lame de bistouri pour couper transversalement le long de la ligne droite qui joint les points inférieurs de l’oreillette droite et gauche (Figure 2 b).
4. Remplir la partie supérieure du cœur sectionné (à travers la cavité du cœur) avec composé de coupe optimale (OCT) (Figure 2D-2E). Mettre le tissu dans un moule en plastique cryosection avec l’axe de l’aorte placé perpendiculairement à la base du moule rectangulaire et couvrir avec l’OCT (Figure 2F). Il ne devrait y avoir aucune bulle d’air piégé. Si aucune bulle n’est présent, essayez de déplacer vers le bord.
5. Placez une plaque métallique sur la glace sèche et puis Rangez soigneusement le moule sur (Figure 2). Lorsque l’outil OPO devient blanche, envelopper le moule avec du papier argenté et ensuite stocker à-80 ° C.

4. Coupe des sections de la racine aortique

1. Régler la machine cryostat à – 20 ° C. Avant de couper, placez le tissu embarqué et y laisser pendant environ 15 minutes pour s’adapter à cette température. Régler la température de titulaire du spécimen à-17 ° C (Figure 3 a).
2. Déposer le bloc cœur gelé à l’intérieur de la machine cryostat à équilibrer la température du bloc à celle du cryostat (Figure 3 b), sortir le bloc cœur gelé du moule (Figure 3). Couper l’excès OCT du bloc congelé de mieux adapter les dimensions du bloc le porte-échantillon (Figure 3D).
3. Montez le bloc cœur gelé sur le porte-échantillon orienté avec le ventricule vers l’extérieur (Figure 3E-3I) et insérez le porte-échantillon dans le spécimen en orientant la tête (Figure 3J). Ajustez l’orientation de la porte-échantillon pour permettre la découpe du bloc afin de rendre la racine aortique perpendiculaire à la lame (Figure 3 K).
4. Couper le bloc et jeter les tranches jusqu'à atteindre la racine aortique (Figure 3 L-3N). Recueillir des coupes sériées et placez-les sur les lames de verre (Figure 3O). Surveiller le profil anatomique de la racine aortique sous le microscope, jusqu'à ce que toutes les valves aortiques 3 apparaissent (Figure 3 P-3 q).
5. Recueillir des articles à 10 µm/section Oil Red O et la coloration rouge Sirius Picro et à 6 µm/section pour MAC3 coloration (Figure 3R). Frais virés autour de 6-8 diapositives (pour chaque coeur) jusqu'à ce qu’une des trois soupapes disparaît ou n’est plus intacts.

5. immunohistochimie

Remarque : Toutes les étapes de coloration dans les protocoles suivants sont exécutés en verre Coplin cuves de coloration.

1. Tache d’huile rouge O pour graisses neutres
   1. Difficulté des sections dans 70 mL de 37 % de formaldéhyde pendant 5 min. laver à l’eau du robinet et éponger hors de l’eau en excès.
   2. Diluer 48 mL de l’huile rouge O (0,5 % dans l’alcool isopropylique) 32 mL d’eau distillée pour obtenir l’huile rouge O 0,3 %.
   3. Tache de sections dans 70 mL d’huile rouge O 0,3 % pour les sections de lavage 10 minutes dans l’eau pendant 10 min du robinet.
   4. Détachant pendant 1 min dans 70 mL d’hématoxyline de Mayer. Laver les sections dans l’eau du robinet pendant 1 min.
   5. Immerger les sections dans 70 mL de carbonate de lithium de 0,5 %. Laver à l’eau du robinet pendant 1 min.
   6. Monter les sections avec un montage aqueux moyen et capture des images à l’aide d’un appareil photo numérique, monté sur un microscope optique.
2. Picro Sirius rouge tache pour le collagène
   1. Coupes de 10 µm congelés et monter dans le bas de la diapositive.
   2. Difficulté des sections dans 70 mL d’acétone pendant 5 min, sécher à l’air et rincer brièvement dans l’eau distillée.
   3. Placer les sections dans 70 mL d’acide phosphomolybdique 0,2 % pendant 5 min. Rincer brièvement à l’eau distillée.
   4. Placer les sections dans 70 mL de solution à 0,1 % Picro Sirius pour 90 min. Rincez une fois avec 70 mL de solution de HCl. jeter N 0,01.
   5. Lieu dans 70 mL de 0,01 N HCl pendant 2 min. Rincer brièvement dans de l’eau distillée. Sécher à l’air.
   6. Place brièvement dans 70 mL d’éthanol à 70 %.
   7. Une fois complètement sec, placer dans 70 mL d’agent d’origine de terpène de compensation et monter des sections à l’aide de poly (butyle méthacrylate -co-méthacrylate de méthyle) montage moyen et capture des images à l’aide d’un appareil photo numérique, monté sur un microscope optique de base.
      Remarque : Un des avantages de la coloration rouge Sirius Picro est qu’il est possible de distinguer le Type I (fibres épaisses, biréfringence de jaune-Orange) et réseaux de fibres de collagène de Type III (fibres fines, biréfringence verte) par microscopie à lumière polarisée¹¹ .
3. MAC3 tache pour la coloration des macrophages
   1. Coupes de 6 µm congelés et monter dans le bas de la diapositive.
   2. Difficulté des sections dans 70 mL d’acétone froid pendant 5 min. immerger dans 70 mL de PBS pendant 2 min.
   3. À l’aide d’une pipette, profilés de recouvrement avec 1 % de sodium dodecyl sulfate solution (SDS) et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT) pour la recherche d’antigène. Plongez dans 70 mL de PBS pendant 5 min.
   4. À l’aide d’une pipette, couvrir les tranches avec 0,3 % de peroxyde d’hydrogène pendant 20 min. Lavez dans 70 mL de PBS 3 fois pendant 5 min.
   5. Utiliser des Complexes avidine-biotine (ABC)-Kit HRP pour les étapes suivantes.
   6. À l’aide d’une pipette, bloquer les sections dans le sérum de lapin Normal à température ambiante pendant 20 min. Ne pas rincer au large.
   7. Tache avec MAC3 (1 : 300) pendant 90 min. à RT. Wash dans 70 mL de PBS 3 fois pendant 5 min.
   8. Tache avec secondaire-biotinylé anti-rat IgG (1 : 200) pendant 45 min à RT. rinçage avec 70 mL de PBS 3 fois pendant 5 min.
   9. Couvrir les sections avec ABC IgG de lapin pendant 30 min à RT. rinçage avec 30 mL de PBS 3 fois pendant 5 min.
   10. Couvrir les sections avec 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) pendant 10 min. rincer avec 70 mL d’eau distillée pour 10 fois.
   11. Détachant pendant 1 min dans 70 mL d’hématoxyline de Mayer. Laver les sections dans l’eau du robinet pendant 1 min.
   12. Immerger les sections dans 70 mL de 0,5 % de Carbonate de Lithium. Laver à l’eau du robinet pendant 1 min.
   13. Monter les sections avec un montage aqueux moyen et capture des images à l’aide d’un appareil photo numérique, monté sur un microscope optique.

6. analyse des lésions athéroscléreuses dans les Sections de la racine aortique

Remarque : Sections de la racine aortique tachées avec de l’huile rouge O ou MAC3 ou un anticorps d’intérêt peuvent être analysées à l’aide des logiciels appropriés (indiqué dans la Table des matières). Pixels totaux coloration positive pour la composante d’intérêt est normalisée à la surface totale de la plaque. Des images ont été recueillies et analysées par un enquêteur du traitement aveugle.

1. Calibration
   1. Ouvrez le logiciel, puis sélectionnez l’image (au format jpg) à analyser.
   2. Sélectionnez page d’accueil | Créer | Calibration rapide.
   3. Mettre en place la calibration de l’image en traçant une ligne le long de la barre d’échelle de l’image.
   4. Sauvegarder l’installation d’étalonnage.
2. Analyse d’images
   1. Sélectionnez la configuration enregistrée d’étalonnage dans le menu Options | Option de Calibration spatiale.
   2. Sélectionnez étalonnage | S’appliquent.
   3. Sélectionnez l’outil Polygone dans le menu Sélectionner et dessiner le périmètre le long de toutes les lésions athéroscléreuses.
   4. Sélectionnez/Grosseur | Types. Dans le Menu, ajoutez et Zone de pour cent .
   5. Dans le menu Format/Count , sélectionnez Manuel et une nouvelle fenêtre seront ouvrira.
   6. Depuis cette fenêtre cliquez sur l’outil sélectionner couleur sur l’image et sélectionnez le mode de l’HSI .
   7. Pointez le curseur de la souris sur les pixels positifs du marqueur d’intérêt à créer une gamme de couleurs.
   8. Cliquez sur le nombre et la valeur Sum, observé dans la Table de mesure, indique le pourcentage de la superficie du marqueur (également exprimée en µm²) en ce qui concerne la superficie totale des lésions athéroscléreuses.

Résultats

8-10 semaines souris^{- / -} Apo, minipompes ont été implantés pour infuser du véhicule ou de l’aldostérone (Figure 1E-1I) et nourris avec un régime athérogène (42 % de matières grasses de régime calories ajustés) pendant 4 semaines. À la fin du traitement, les souris ont été euthanasiés et perfusés avec du PBS et 10 % de formol comme décrit ci-dessus. La racine aortique a été séparée de la partie apicale du cœ...

Discussion

L’athérosclérose est une affection inflammatoire chronique associée à grandes et moyennes des navires faisant intervenir des interactions entre plusieurs types de cellules, telles que les macrophages, lymphocytes T, les cellules endothéliales et les cellules de muscle lisse¹. Malgré les limites des modèles murins d’athérogènes, un grand nombre de preuves sur le processus athérosclérotique est disponible. Ces modèles ont l’avantage de générer rapidement des cohortes expérimenta...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat)	Envigo	TD.88137	atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube	Alzet	model 1004	for continous realase
Aldosterone	SIGMA	A9477	hormone
Ethanol	SIGMA	34852-M	solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol	Kendal Webcol	6818	Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0)	Demas	500004	surgery
10% Povidone/iodine ointment	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	Antiseptic
Formalin 10%	SIGMA	HT5012	to fix vascolature
Cryomold	Bio-Optica	07-MP1515	for embedding
O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	for embedding
Cryostat	Leica	CM1900	instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Aurogene	AU-L0615-500	buffer solution
Adhesion Slides Polysine	VWR	631-0107	microscope glasses
Cover Glasses	Bio-Optica	72015	cover glasses
Formaldehyde 37%	SIGMA	252549	solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol)	SIGMA	O1391	staining solution
Mayer’s Hematoxylin	SIGMA	MHS32	staining solution
Lithium Carbonate	SIGMA	62470	washing buffer
Acqueous Mounting Medium	Thermo Scientific	TA-125-AM	mounting solution
Acetone	SIGMA	179124	solvent
Phosphomolybdic acid solution	SIGMA	HT153	for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red)	SIGMA	365548	staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin)	Bio-Optica	06-1782D	product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	SIGMA	3989	mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fluka	71725	powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %)	SIGMA	H1009	solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG ,	Vector Laboratories	PK-6100	staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole	Vector Laboratories	SK-4200	staining solution
Mac3 antibody	BD Biosciences	553322	antibody
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	software to analyze images