Induzione delle placche aterosclerotiche attraverso l'attivazione dei recettori mineralcorticoidi nei topi E-carenti dell'apolipoproteina

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per indurre aterosclerosi nella radice aortica di ApoE^{- / -} topi alimentati con una dieta atherogenic, attraverso un continuo rilascio di aldosterone. Inoltre vengono descritti metodi per caratterizzare la composizione della placca.

Abstract

Aterosclerosi è a causa di una risposta infiammatoria cronica che colpisce endotelio vascolare ed è promosso da diversi fattori quali ipertensione, dislipidemia e diabete. Ad oggi, ci è prova per sostenere un ruolo per la circolazione dell'aldosterone come fattore di rischio per lo sviluppo della malattia cardiovascolare. Modelli murini transgenici sono stati generati per lo studio dei processi cellulari e molecolari che conducono all'aterosclerosi. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo che si avvale dell'infusione continua dell'aldosterone nei topi di ApoE^{- / -} e genera le placche aterosclerotiche in radice aortica dopo 4 settimane di trattamento. Abbiamo, quindi, illustrare un metodo per la quantificazione e caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche a livello della radice aortica. Il valore aggiunto dell'infusione dell'aldosterone è rappresentato dalla generazione delle lesioni aterosclerotiche ricche di lipidi e cellule infiammatorie dopo 4 settimane di trattamento. Descriviamo in dettaglio le procedure di colorazione per quantificare il contenuto lipidico e dei macrofagi all'interno della piastra. In particolare, nel presente protocollo, eseguiamo cuore inclusione di tessuti in OCT al fine di preservare l'antigenicità del tessuto cardiaco e facilitare l'individuabilità degli antigeni di interesse. Analisi del fenotipo placca rappresenta un valido approccio per studiare la fisiopatologia dello sviluppo di aterosclerosi e di identificare nuovi bersagli farmacologici per lo sviluppo di farmaci anti--atherogenic.

Introduzione

L'aterosclerosi è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo¹. È caratterizzata da uno stato infiammatorio cronico, dove i vasi sanguigni sono infiltrati da lipidi e leucociti che determinano la formazione di placche aterosclerotiche. La maggior parte degli eventi cardiaci acuti è associata con gli eventi trombotici a causa della rottura della placca. Placche alla rottura incline sono definite "vulnerabili" e sono caratterizzate da una maggiore infiltrazione dei leucociti pro-infiammatorie, un core necrotico e un cappuccio fibroso sottile². Negli ultimi decenni, gli studi clinici e sperimentali hanno chiarito la complessa patofisiologia della malattia. Parecchi modelli animali sono utilizzati per indagare i meccanismi molecolari coinvolti nell'induzione dell'aterosclerosi³. Attualmente, il mouse è la specie maggiormente utilizzata per studiare l'aterosclerosi nonostante alcune differenze specie-specifiche esistenti in relativa patofisiologia rispetto agli esseri umani. In particolare, colesterolo di circolazione è principalmente composta da lipoproteine ad alta densità (con proprietà antiatherogenic) in modelli murini, mentre negli esseri umani circolazione colesterolo è trasportato principalmente come lipoproteine a bassa densità (LDL), probabilmente che rappresenta la ragione principale perché topi wild-type non sviluppare aterosclerosi spontanea⁴. Inoltre, topi wild type sono generalmente resistenti ad assorbire colesterolo dalla dieta, mentre gli esseri umani assorbono circa il 50% di colesterolo dietetico⁴. Per superare queste limitazioni, sono stati generati diversi modelli murini geneticamente modificati. Mouse di apolipoproteina E-carente (ApoE^−/−) e mouse ricevitore-carenti di LDL (LDLr^−/−) sono ampiamente usati. Una dieta ad alta percentuale di grassi colesterolo alto, ApoE^−/− topi sviluppano la placca più rapidamente rispetto ai topi^−−/LDLr, e per questo motivo, l'uso di topi^{− −/}di ApoE è più esteso che quello del LDLr^−/−topi^5,6. I topi^{− −/}di ApoE sviluppano lesioni in qualsiasi fase della aterosclerosi e sono comparabili a quelli osservati negli esseri umani, anche se le piastre del mouse non mostrano un fenotipo instabile⁷. In genere, ApoE^−/− topi sviluppano spontaneamente l'aterosclerosi e questo processo è accelerato con una dieta occidentale³. La severità di aterosclerosi può essere valutata a livello della carotide, polmonare, femorale e dell'arteria brachiocefalica e la radice aortica⁶. In particolare, la radice aortica rappresenta un sito anatomico incline sviluppano lesioni aterosclerotiche nei topi. Per questo motivo, è pratica comune per valutare la formazione di placche aterosclerotiche in questa regione.

Diversi studi hanno dimostrato che l'aldosterone è implicato nello sviluppo di aterosclerosi^8,9,10. Infusione di aldosterone in ApoE^−/− topi alimentati una dieta atherogenic accelera lo sviluppo delle lesioni aterosclerotiche della radice aortica, inducendo la formazione di placca infiammata e ricca di lipidi¹⁰.

In breve, descriviamo un protocollo tra cui infusione dell'aldosterone, dieta atherogenic alimentazione, incorporamento di tessuti del cuore, quantificazione e caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche nei topi di ApoE^{- /} . Questa procedura favorisce un'efficiente formazione di placche aterosclerotiche infiammate, ricca di lipidi e rappresenta un valido modello per lo studio di atherogenesis.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dalle commissioni di utilizzo, numero autorizzazione 493/2016-Pr. e italiana istituti nazionali di sanità Tutte le procedure sono state condotte per le linee guida della Comunità europea per l'uso di animali da esperimento (direttiva europea 2010/63/UE).

Nota: L'impianto sottocutaneo di osmotico Minipompa contenente veicolo (etanolo in soluzione salina) o dell'aldosterone (240 µ g · kg^-1 · d^-1) in 8-10 settimana-vecchi maschi topi carenti per il gene ApoE . In generale, 8-10 settimana-vecchi maschi ApoE^del −/topi pesano intorno ai 25-26 g.

1. dissoluzione dell'Aldosterone

1. Sciogliere 5 mg di polvere dell'aldosterone in 1 mL di etanolo assoluto.
2. Aggiungi 56,7 µ l di aldosterone (disciolto in etanolo) 68,3 µ l di soluzione fisiologica al fine di ottenere una concentrazione di 2,27 µ g / µ l. riempire l'intero minipompe osmotiche completamente con 125 µ l di questa soluzione (capacità massima di ogni Minipompa è 125 µ l).
3. Utilizzare una velocità di flusso Minipompa di 0,11 µ l/h; di conseguenza viene rilasciato 2,64 µ l della soluzione ogni 24 h. dare ciascuno il mouse intorno 6 µ g · d^-1 dell'aldosterone per 28 giorni.

2. l'impianto e la pompa osmotica riempimento

Nota: Le pompe vengono fornite in due parti distinte: il corpo principale della pompa e il regolatore di flusso.

1. Compilare e gestire le minipompe utilizzando guanti chirurgici.
   Nota: Gli oli della pelle possono interferire con le prestazioni di Minipompe. La procedura seguente deve essere eseguita in una cappa a flusso laminare sterile.
2. Collegare il tubo di riempimento (in dotazione con le minipompe) a una siringa da 1 mL e redige la soluzione dell'aldosterone o il veicolo.
   Nota: È importante evitare le infiltrazioni di aria nella siringa mentre aspirando soluzioni dal tubo per evitare la formazione di bolle d'aria nella pompa.
3. Inserire il tubo di riempimento attraverso il foro nella parte superiore della Minipompa fino a quando esso non può andare (Figura 1A-1B). Riempire lentamente la pompa con l'aldosterone o veicolo. Si noti l'ombra scura all'interno della pompa che indica il livello del liquido. Guarda questo innalzamento del livello del insieme con la pompa di riempimento.
   1. Smettere di riempire la pompa quando una goccia di liquido fuoriesce il corpo pompa.
4. Rimuovere il tubo di riempimento con cautela e inserire il regolatore di flusso nel corpo di Minipompa (Figura 1). Accertarsi che il regolatore è posizionato saldamente contro il corpo della pompa. Lasciare le pompe osmotiche riempite in un becher contenente soluzione fisiologica sterile a 37 ° C per 24 h prima dell'impianto nel topo (procedura di rabbocco).
5. Condurre l'ambulatorio in una zona disinfettata con etanolo al 70% che promuove asepsi.
6. Applicare 1-3 gocce al sito di incisione di bupivacaina 0,25% e anestetizzare l'animale con 3% isoflurane. Accendere il gas di alimentazione e impostare il misuratore di portata di 500-1000 mL/min posto l'animale nella camera di induzione e sigillare la parte superiore. Accendere il vaporizzatore per 5% isoflurane e monitorare il mouse fino a recumbent.
   1. Interruttore del sistema di fluire verso la punta conica. Rimuovere l'animale dall'aula e posizione nella punta conica. In 2-3 minuti, il mouse comincia a risvegliarsi. Riavviare il flusso di gas con il misuratore di portata a 100-200 mL/min e il vaporizzatore a 3% isoflurane.
   2. Garantire un'adeguata profondità di anestesia prima di eseguire procedure testando pedale ritiro e riflessi palpebrali. Monitorare la respirazione e la risposta alla stimolazione durante la procedura e regolare del vaporizzatore, se necessario.
   3. Proteggere le cornee dall'asciugarsi applicando un unguento oftalmico.
7. Preparare l'animale rimuovendo capelli dal sito chirurgico utilizzando un rasoio (Figura 1). Il solito sito per l'impianto sottocutaneo di pompe è sul retro.
8. Preparare il sito chirurgico con materiale non tessuto pad imbevuto di alcool isopropilico al 70%.
9. Utilizzare uno spazio pulito e dedicato (disinfettato con etanolo al 70%) e coperto con un telo sterile. Posizionare la punta degli strumenti in uno sterilizzatore di perlina di vetro. Iniziare la chirurgia con strumenti sterilizzati e maneggiare gli strumenti in modo asettico.
10. Utilizzare forbici chirurgiche per rendere un 0.8-1 incisione cm (circa 2 cm vicino alla coda), come mostrato in figure 1E-1F. Mantenere la sterilità di non toccare nulla all'esterno nello spazio chirurgico dedicato con guanti sterili o punte degli strumenti.
11. Fare attenzione a tagliare solo la pelle ma non ai tessuti sottostanti. Usare una mano per tenere il forcipe per aprire l'incisione. Usare l'altra mano per tenere il trocar a diffondere la pelle per creare una tasca per la pompa dalla parte posteriore verso l'alto alla scapola (sul lato destro o sinistro del mouse).
12. Inserire la pompa nell'incisione. Spingere delicatamente la pompa completamente nella tasca (Figura 1 H). Ci dovrebbe essere abbastanza pelle libero di chiudere la ferita senza tensione o stiramento della pelle necessaria. Una volta che la pompa è stata inserita, suturare l'incisione con filo di chirurgia (polyglactin 910 con sutura dimensione 6-0)
    Nota: La testa del regolatore deve essere orientata verso la parte anteriore del mouse (Figura 1).
13. Applicare l'unguento d'attualità di iodio di povidone 10% con un tampone pulito (Figura 1I) e tenere l'animale su una fase di riscaldamento. Non lasciare topi in automatico fino a quando recuperano decubito sternale. Valutare lo stato di idratazione e somministrare per via sottocutanea 0,5 mL di soluzione fisiologica 0,9% se necessario. Restituire l'animale nella sua sede ordinaria.
14. Seguire le linee guida istituzionali per la documentazione (ad es., compilare un modulo chirurgico con informazioni operative e post-operatorie, aggiornamento carta di gabbia con procedura e data) e fornire analgesici (buprenorfina, 0,05 mg/kg) per ridurre il dolore post-chirurgico e antibiotici (enrofloxacina 85 mg/kg) per evitare l'infezione post-chirurgica.
    1. Continuare il monitoraggio quotidiano ed esaminare per segni di dolore. Prestare attenzione che la ferita è completamente chiusa e Minipompa è mantenuta nella tasca sottocutanea. La ferita può essere aperto e il mouse potrebbe perdere la Minipompa.

3. dissezione del cuore

1. Al momento del sacrificio, anestethize topi con 80-100 mg/kg di Zoletil somministrato per via intramuscolare. Zoletil induce l'anestesia profonda. Nota: controllare che i topi sono ad un'adeguata profondità di anestesia prima di eseguire procedure di test il pedale e riflessi palpebrali; topi saranno essere irrorati mentre anestetizzati. Aprire la cavità toracica, con delle forbici, pinze, tagliando le costole lateralmente allo sterno, con lo sterno retratto verso la testa.
2. Irrorare mouse tramite ventricolo sinistro da sistema di perfusione di gravità con 10-15 mL di soluzione fisiologica di Dulbecco ghiacciata tampone fosfato (PBS) e poi con 40-50 mL di 10% di formalina neutra tamponata per correggere il sistema vascolare. La fissazione è indicata quando i topi mostrano contrazioni muscolari vigoroso e diventano rigidi.
   Nota: Il processo di fissaggio avviene in 10-20 min. È possibile utilizzare il fissi organi e tessuti per eseguire immunofluorescenza o analisi immunoistochimica. Cosa importante, tali tessuti fissi non possono essere utilizzati per l'espressione genica e analisi macchiantesi occidentali.
3. Separare il cuore dall'aorta che tengono il cuore con le pinze e taglio con forbici o un bisturi, perpendicolarmente all'asse dell'aorta, il più vicino possibile al cuore senza causare danni (Figura 2A). Utilizzare un bisturi per tagliare trasversalmente lungo una linea retta che unisce i punti più bassi dell'atrio destro e sinistro (Figura 2B).
4. Riempire la parte superiore del cuore sezionato (attraverso la cavità del cuore) con taglio ottimale composto (OCT) (Figura 2D-2E). Mettere il tessuto all'interno di uno stampo di plastica di donatrici con l'asse dell'aorta posizionato perpendicolarmente alla base della stampo rettangolare e coperchio con OCT (Figura 2F). Non ci dovrebbe essere nessuna bolla di aria intrappolata. Se qualsiasi bolla è presente, provare a spostare verso il bordo.
5. Inserire una piastra metallica su ghiaccio secco e poi attentamente mettere lo stampo su (Figura 2). Quando il OCT diventa bianco, avvolgere lo stampo con un foglio d'argento e quindi conservare a-80 ° C.

4. taglio di sezioni della radice aortica

1. Impostare la macchina criostato a – 20 ° C. Prima del taglio, posizionare il tessuto incorporato e lasciarlo lì per circa 15 min regolare la temperatura. Impostare la temperatura di titolare esemplare a-17 ° C (Figura 3A).
2. Posizionare il blocco cuore congelato all'interno della macchina di criostato per equilibrare la temperatura del blocco a quello del criostato (Figura 3B) e togliere il blocchetto di cuore congelato dallo stampo (Figura 3). Tagliare l'OCT in eccesso dal blocco congelato per meglio adattare le dimensioni di blocco per il portacampioni (Figura 3D).
3. Montare il blocchetto di cuore congelato sul portacampioni orientato con la ventricolare rivolto verso l'esterno (Figura 3E-3I) e inserire il portacampioni nel campione di orientare la testa (Figura 3J). Regolare l'orientamento del portapreparato per consentire il taglio del blocco al fine di rendere la radice aortica perpendicolare alla lama (Figura 3 K).
4. Tagliare il blocco e scartare le fette fino a raggiunta la radice aortica (Figura 3 L-3N). Raccogliere le sezioni di serie e metterli sulle lastre di vetro (Figura 3O). Monitorare il profilo anatomico della radice aortica al microscopio finché non vengono visualizzate tutte le 3 valvole aortiche (Figura 3 P-3Q).
5. Raccogliere le sezioni a 10 µm/sezione per Oil Red O e colorazione Picro Sirius rosso e a 6 µm/sezione per MAC3 macchiatura (Figura 3R). Raccogliere intorno a 6-8 scivoli (per ogni cuore) fino ad una delle tre valvole scompare o non è più intatti.

5. Immunohistochemistry

Nota: Tutti i passaggi colorazione riportati nei protocolli seguenti vengono eseguiti nelle vaschette per colorazione vetro Coplin.

1. Macchia di rosso O di olio per grassi neutri
   1. Difficoltà sezioni in 70 mL di formaldeide al 37% per 5 min, lavare bene in acqua corrente e asciugare l'acqua in eccesso.
   2. Diluire 48 mL di Oil Red O (0,5% in isopropanolo) in 32 mL di acqua distillata per ottenere Oil Red O 0,3%.
   3. Macchia sezioni in 70 mL di olio rosso O 0,3% per sezioni di lavaggio 10 min in acqua corrente per 10 min.
   4. Macchia per 1 min in 70 mL di ematossilina di Mayer. Lavare le sezioni in acqua di rubinetto per 1 min.
   5. Immergere le sezioni in 70 mL di 0.5% di carbonato di litio. Lavare in acqua corrente per 1 min.
   6. Montare profili con un montaggio acquoso medio e catturare le immagini utilizzando una fotocamera digitale montata su un microscopio ottico.
2. Picro Sirius rosso macchia per il collagene
   1. Tagliare 10 µm congelati sezioni e montare nella parte inferiore della diapositiva.
   2. Difficoltà sezioni in 70 mL di acetone per 5 min, aria secca e risciacquare brevemente in acqua distillata.
   3. Inserire sezioni in 70 mL di Acido fosfomolibdico 0,2% per 5 min, sciacquare brevemente in acqua distillata.
   4. Inserire sezioni in 70 mL di soluzione di Picro Sirius 0,1% per 90 min. Sciacquare una volta con 70 mL di soluzione 0,01 N HCl. scartare.
   5. Posto in 70 mL di 0.01 N HCl per 2 min risciacquare brevemente in acqua distillata. Asciugare all'aria.
   6. Posto brevemente in 70 mL di etanolo al 70%.
   7. Quando è completamente asciutto, mettere in 70 mL di compensazione agente di origine terpene e montare sezioni utilizzando poli (Butil metacrilato -co-metacrilato di metile) base montaggio medio e catturare le immagini utilizzando una fotocamera digitale montata su un microscopio ottico.
      Nota: Uno dei vantaggi della colorazione Picro Sirius Red è che è possibile distinguere il tipo I (fibre spesse, birifrangenza giallo-arancio) e reti di fibre di collagene di tipo III (fibre sottili, birifrangenza verde) da microscopia polarizzata¹¹ .
3. Mac3 macchia per la colorazione del macrofago
   1. Tagliare 6 µm congelati sezioni e montare nella parte inferiore della diapositiva.
   2. Difficoltà sezioni in 70 mL di acetone freddo per 5 min immergere in 70 mL di PBS per 2 min.
   3. Utilizzando una pipetta, profili di copertura con 1% di sodio dodecil solfato soluzione (SDS) e incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA) per ricupero dell'antigene. Immergere in 70 mL di PBS per 5 min.
   4. Utilizzando una pipetta, coprire le fettine con 0,3% perossido di idrogeno per 20 min. Wash in 70 mL di PBS 3 volte per 5 min.
   5. Utilizzare complessi avidina-biotina (ABC)-HRP Kit per le seguenti operazioni.
   6. Utilizzando una pipetta, bloccare sezioni nel siero di coniglio normale a temperatura ambiente per 20 min. Non risciacquare.
   7. Macchiare con MAC3 (1: 300) per 90 minuti a RT. Wash in 70 mL di PBS 3 volte per 5 min.
   8. Macchia con secondario biotinilato anti-ratto IgG (1: 200) per 45 min a RT. risciacquo con 70 mL di PBS 3 volte per 5 min.
   9. Coprire le sezioni con coniglio IgG ABC per 30 min a RT. risciacquo con 30 mL di PBS 3 volte per 5 min.
   10. Coprire le sezioni con 3-ammino-9-ethylcarbazole (AEC) per 10 min. risciacquo con 70 mL di acqua distillata per 10 volte.
   11. Macchia per 1 min in 70 mL di ematossilina di Mayer. Lavare le sezioni in acqua di rubinetto per 1 min.
   12. Immergere le sezioni in 70 mL di 0.5% carbonato di litio. Lavare in acqua corrente per 1 min.
   13. Montare profili con un montaggio acquoso medio e catturare le immagini utilizzando una fotocamera digitale montata su un microscopio ottico.

6. immagine analisi delle lesioni aterosclerotiche in sezioni di radice aortica

Nota: Sezioni di radice aortica macchiati con Oil Red O o MAC3 o un anticorpo di interesse possono essere analizzati usando il software adatto (indicato in Tabella materiali). Pixel totali macchiatura positiva per il componente di interesse è normalizzato all'area complessiva della placca. Immagini sono stati raccolti e analizzati da un ricercatore accecato trattamento.

1. Calibrazione
   1. Aprire il software e quindi selezionare l'immagine (in formato jpg) per essere analizzati.
   2. Selezionare la casa | Creare | Calibrazione rapida.
   3. Impostare la calibrazione dell'immagine da disegnare una linea lungo la barra di scala dell'immagine.
   4. Salvare le impostazioni di taratura.
2. Analisi dell'immagine
   1. Selezionare la taratura di installazione salvato dal menu Opzioni | Opzione di calibrazione spaziale.
   2. Selezionare taratura | Applicare.
   3. Selezionare lo strumento Poligono dal menu selezionare e disegnare il perimetro lungo tutte le lesioni aterosclerotiche.
   4. Selezionare Conteggio/dimensione | Tipi. Dal Menu, aggiungere e Zona per cento .
   5. Dal Conteggio/dimensione del menu, selezionare manuale e una nuova finestra si aprirà.
   6. Da questa finestra fare clic sullo strumento di selezione di colore sull'immagine e selezionare modalità HSI .
   7. Puntare il cursore del mouse sui pixel positivo del marcatore di interesse per creare una gamma di colori.
   8. Fare clic su totali e il valore somma, osservato nella Tavola di misurazione, indica la percentuale dell'area del marcatore (espresso anche in µm²) per quanto riguarda l'area totale delle lesioni aterosclerotiche.

Risultati

In 8-10 settimane topi^{- / -} Apo, minipompe sono stati impiantati per infondere con veicolo o dell'aldosterone (Figura 1E-1I) e ha alimentato una dieta atherogenic (regolati calorie dieta 42% da grasso) per 4 settimane. Alla fine del trattamento, topi sono stati eutanasizzati ed irrorati con PBS e formalina al 10% come descritto sopra. La radice aortica è stata separata dalla parte apicale del cuore ed è stata incorporata nello st...

Discussione

L'aterosclerosi è un disordine infiammatorio cronico connesso con medie e grandi vasi che coinvolgono interazioni tra diversi tipi di cellule, come i macrofagi, linfociti T, cellule endoteliali e cellule di muscolo liscio¹. Nonostante le limitazioni dei modelli murini atherogenic, un grande corpo di prova il processo aterosclerotico è disponibile. Questi modelli hanno il vantaggio di generare rapidamente sperimentale coorti di una determinata età e sesso. Anche i topi mostrano un background gen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat)	Envigo	TD.88137	atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube	Alzet	model 1004	for continous realase
Aldosterone	SIGMA	A9477	hormone
Ethanol	SIGMA	34852-M	solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol	Kendal Webcol	6818	Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0)	Demas	500004	surgery
10% Povidone/iodine ointment	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	Antiseptic
Formalin 10%	SIGMA	HT5012	to fix vascolature
Cryomold	Bio-Optica	07-MP1515	for embedding
O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	for embedding
Cryostat	Leica	CM1900	instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Aurogene	AU-L0615-500	buffer solution
Adhesion Slides Polysine	VWR	631-0107	microscope glasses
Cover Glasses	Bio-Optica	72015	cover glasses
Formaldehyde 37%	SIGMA	252549	solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol)	SIGMA	O1391	staining solution
Mayer’s Hematoxylin	SIGMA	MHS32	staining solution
Lithium Carbonate	SIGMA	62470	washing buffer
Acqueous Mounting Medium	Thermo Scientific	TA-125-AM	mounting solution
Acetone	SIGMA	179124	solvent
Phosphomolybdic acid solution	SIGMA	HT153	for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red)	SIGMA	365548	staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin)	Bio-Optica	06-1782D	product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	SIGMA	3989	mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fluka	71725	powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %)	SIGMA	H1009	solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG ,	Vector Laboratories	PK-6100	staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole	Vector Laboratories	SK-4200	staining solution
Mac3 antibody	BD Biosciences	553322	antibody
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	software to analyze images