Indução de ateroma através da ativação de receptores de mineralocorticoide em camundongos deficientes em Apolipoprotein E

Resumo

Descreveremos um protocolo para induzir a aterosclerose na raiz da aorta de ApoE^{- / -} ratos alimentados com uma dieta aterogênico, através de uma contínua liberação de aldosterona. Também são descritos métodos para caracterizar a composição da placa bacteriana.

Resumo

Aterosclerose é devido a uma resposta inflamatória crônica, afetando o endotélio vascular e é promovido por vários fatores, tais como hipertensão arterial, dislipidemia e diabetes. Até à data, não há evidência para apoiar um papel para circulantes de aldosterona como um fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Modelos de rato transgénico foram gerados para estudar processos celulares e moleculares que conduzem à aterosclerose. Este manuscrito, descrevemos um protocolo que tira proveito da infusão contínua de aldosterona em ApoE^{- / -} ratos e gera ateroma na raiz aórtica após 4 semanas de tratamento. Estamos, portanto, ilustrar um método para a quantificação e caracterização de lesões ateroscleróticas no nível da raiz da aorta. O valor acrescentado da infusão de aldosterona é representado pela geração de lesões ateroscleróticas ricas em lipídios e células inflamatórias após 4 semanas de tratamento. Descrevemos em detalhes os procedimentos de coloração para quantificar o conteúdo lipídico e macrófagos dentro da placa. Notavelmente, neste protocolo, realizamos coração tecido-incorporação na OCT para preservar a antigenicidade do tecido cardíaco e facilitar a detecção de antígenos de interesse. Análise do fenótipo placa representa uma abordagem válida para estudar a fisiopatologia do desenvolvimento de aterosclerose e identificar novos alvos farmacológicos para o desenvolvimento de drogas anti aterogênico.

Introdução

A aterosclerose é uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo¹. É caracterizada por um estado inflamatório crônico, onde os vasos sanguíneos estão infiltrados por lipídios e leucócitos que determinam a formação de ateroma. A maioria dos eventos cardíacos agudos está associada com eventos trombóticos, devido à ruptura da placa. Propenso a ruptura de placas são definidas como "vulneráveis" e caracterizam-se pela maior infiltração de leucócitos pró-inflamatórios, um núcleo necrótico e um fino fibroso cap². Nas últimas décadas, estudos clínicos e experimentais clarificaram a complexa fisiopatologia da doença. Vários modelos animais são usados para investigar os mecanismos moleculares envolvidos na indução de aterosclerose³. Atualmente, o rato é a espécie mais frequentemente usada para estudar a aterosclerose, apesar de algumas diferenças espécie-específicas existentes na sua fisiopatologia em comparação com os humanos. Em particular, circular o colesterol é principalmente composta por lipoproteínas de alta densidade (com propriedades antiatherogenic) em modelos do rato, enquanto nos seres humanos circular o colesterol é principalmente transportado como lipoproteínas de baixa densidade (LDL), provavelmente representando a principal razão por que os ratos do selvagem-tipo não desenvolvem aterosclerose espontânea⁴. Além disso, o tipo selvagem ratos são geralmente resistentes a absorção de colesterol da dieta, Considerando que os seres humanos absorvem cerca 50% de colesterol dietético⁴. Para superar essas limitações, foram gerados vários modelos do rato geneticamente modificado. Mouse de Apolipoprotein E – deficiente (ApoE^−/−) e LDL receptor – deficiente mouse (LDLr^−/−) são amplamente utilizados. Em uma dieta de alto teor de gordura colesterol alto, ApoE ratos^{− −/}desenvolvem a placa mais rápida em comparação com ratos^−−/LDLr, e por este motivo, o uso de ratos^{− −/}ApoE é mais difundida do que a do LDLr^−/−ratos^5,6. Os ratos^{− −/}ApoE desenvolvem lesões em qualquer fase da aterosclerose e são comparáveis aos observados em humanos, embora placas de rato não mostram um fenótipo instável⁷. Geralmente, ApoE^−/− ratos espontaneamente desenvolvem aterosclerose e este processo é acelerado com uma dieta ocidental³. A severidade da aterosclerose pode ser avaliada ao nível da carótida, femoral, pulmonar e artéria Braquiocefálica e a raiz aórtica⁶. Em particular, a raiz aórtica representa um sítio anatômico propenso a desenvolver lesões ateroscleróticas nos ratos. Por esta razão, é prática comum para avaliar a formação de ateroma nesta região.

Vários estudos têm mostrado que aldosterona está implicada no desenvolvimento de aterosclerose^8,9,10. Infusão de aldosterona em ApoE^−/− ratos alimentados com uma dieta aterogênico acelera o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas raiz aórtica, induzindo a formação de placa inflamada e rica em lipídios¹⁰.

Em resumo, nós descrevemos um protocolo, incluindo a infusão de aldosterona, aterogênico dieta alimentar, a incorporação de tecidos do coração, quantificação e caracterização de lesões ateroscleróticas em ApoE^{- / -} ratos. Este procedimento promove uma formação eficiente de ateroma inflamadas, rica em lipídios e representa um modelo valioso para o estudo da atherogenesis.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo italiano institutos nacionais de cuidados de saúde e comissões de uso, autorização número 493/2016-PR. Todos os procedimentos foram realizados pelas directrizes da Comunidade Europeia para o uso de animais experimentais (Directiva Europeia, 63/2010/UE).

Nota: Implantação subcutânea de minipump osmótica contendo veículo (etanol em solução salina) ou aldosterona (240 µ g · kg^-1 · d^-1) na semana de 8-10-velhos machos camundongos deficientes para o gene ApoE . Em geral, semana de 8-10-velhos ratos masculinos de ApoE^−/− pesam cerca de 25-26 g.

1. dissolver a aldosterona

1. Dissolva 5 mg de pó de aldosterona em 1 mL de etanol absoluto.
2. Adicionar 56.7 µ l de aldosterona (dissolvida em etanol) a 68,3 µ l de solução salina para obter uma concentração de 2.27 µ g / µ l. Encha o inteiro minipumps osmótica completamente com 125 µ l desta solução (capacidade máxima de cada minipump é 125 µ l).
3. Usar uma taxa de fluxo de minipump de 0.11 µ l/h; Consequentemente 2.64 µ l da solução é liberado cada 24 h. dar cada um mouse ao redor 6 µ g · d^-1 de aldosterona durante 28 dias.

2. implantação e enchimento da bomba osmótica

Nota: As bombas são fornecidas em duas partes distintas: o corpo principal da bomba e o regulador de fluxo.

1. Preencher e lidar com o minipumps usando luvas cirúrgicas.
   Nota: A oleosidade da pele pode interferir com o desempenho de minipumps. As seguintes etapas devem ser executadas numa vizinhança de estéril de fluxo laminar.
2. Prenda o tubo de enchimento (fornecido com o minipumps) a uma seringa de 1 mL e elaborar a solução de aldosterona ou veículo.
   Nota: É importante evitar deixar ar dentro da seringa enquanto aspira soluções do tubo para evitar a formação de bolhas de ar para a bomba.
3. Insira o tubo de enchimento pelo buraco no topo da minipump até que posso ir adiante (figura 1A-1B). Lentamente, encha a bomba com a aldosterona ou veículo. Observe a sombra escura no interior da bomba, indicando o nível de líquido. Assista a este nível alta juntamente com a bomba de enchimento.
   1. Pare de encher a bomba quando uma gota de líquido levanta-se fora do corpo da bomba.
4. Cuidadosamente remova o tubo de enchimento e insira o regulador de fluxo no corpo da minipump (Figura 1). Certifique-se de que o regulador está assentado firmemente contra o corpo da bomba. Embora as bombas osmóticos cheias num copo contendo solução salina estéril a 37 ° C por até 24 h antes da implantação no mouse (procedimento).
5. Realizar a cirurgia em uma área desinfectada com etanol a 70% que promove a assepsia.
6. Aplique 1-3 gotas no local da incisão de bupivacaína 0,25% e anestesiar o animal com 3% de isoflurano. Ligue o fornecimento de gás e definir o medidor de vazão de 500-1000 mL/min. lugar do animal na câmara de indução e selar o topo. Ligue o vaporizador para 5% de isoflurano e monitorar o mouse até reclinada.
   1. Interruptor do sistema a fluir para o cone do nariz. Retire o animal da sala e a posição do cone de nariz. Em 2-3 minutos, o rato começa a despertar. Reinicie o fluxo de gás com o medidor de vazão de 100 a 200 mL/min e o vaporizador em 3% de isoflurano.
   2. Assegure a adequada profundidade de anestesia antes de realizar procedimentos testando reflexos palpebrais e retirada de pedal. Monitorar a respiração e resposta à estimulação durante o procedimento e ajuste o vaporizador, conforme necessário.
   3. Protege as córneas de secar por aplicação de uma pomada oftálmica.
7. Prepare o animal, removendo o cabelo do local cirúrgico usando uma navalha (Figura 1). O local habitual para implantação subcutânea de bombas está na parte de trás.
8. Prepare o local cirúrgico com material de não tecido almofada saturada com álcool isopropílico a 70%.
9. Usar um espaço limpo e dedicado (desinfectado com 70% de etanol) e coberto com um pano estéril. Coloque a ponta dos instrumentos em um esterilizador de grânulo de vidro. Começar a cirurgia com instrumentos esterilizados e lidar com instrumentos em condições assépticas.
10. Use uma tesoura cirúrgica tornar-se um 0,8-1 incisão cm (cerca 2 cm perto da cauda), como mostrado em figuras 1E-1F. Manter a esterilidade por não tocar em nada fora do espaço dedicado cirúrgico com luvas estéreis ou dicas de instrumentos.
11. Tome cuidado para cortar somente a pele mas não os tecidos subjacentes. Utilize uma mão para segurar a pinça para abrir a incisão. Use a outra mão para segurar o trocarte para espalhar a pele a fim de criar um bolso para a bomba de trás para cima para a escápula (no lado direito ou esquerdo do mouse).
12. Introduza a bomba na incisão. Empurre a bomba completamente no bolso (Figura 1 H). Deve haver suficiente pele livre para fechar a ferida com nenhuma tensão ou alongamento da pele necessária. Uma vez que a bomba foi inserida, suturar a incisão com fio de cirurgia (Poliglactina 910 com sutura tamanho 6-0)
    Nota: A cabeça do regulador deve estar voltada para a frente do rato (Figura 1).
13. Aplicar a pomada tópica de iodopovidona/10% com um cotonete limpo (Figura 1I) e manter o animal em uma fase de aquecimento. Não deixe os ratos autônoma até se recuperarem prostração esternal. Avaliar o estado de hidratação e administrar 0,5 mL de solução salina 0,9% por via subcutânea, se necessário. Retorne o animal ao seu alojamento rotineiro.
14. Siga as orientações institucionais para documentação (por exemplo, preencher um formulário de cirúrgico com informações operatória e pós-operatório, atualização gaiola cartão com data e procedimento) e fornecer analgésicos (buprenorfina, 0,05 mg/kg) para reduzir a dor pós-operatória e antibióticos (enrofloxacina 85 mg/kg) para evitar a infecção pós-operatória.
    1. Continuar a acompanhar diariamente e examinar sinais de dor. Preste atenção que a ferida está completamente fechada e minipump é mantida para a bolsa subcutânea. Pode abrir a ferida e o mouse pode perder a minipump.

3. dissecação do coração

1. No momento do sacrifício, anestethize ratos com 80-100 mg/kg de Zoletil administrada por via intramuscular. Zoletil induz anestesia profunda. Nota: Verifique se os ratos estão a uma profundidade adequada de anestesia antes de realizar procedimentos testando o pedal e reflexos palpebrais; os ratos vão ser perfundidos enquanto anestesiados profundamente. Abra a cavidade torácica, usando uma tesoura e pinça, cortando as costelas lateralmente ao esterno, com o esterno se retrair em direção a cabeça.
2. Perfundir o rato através do ventrículo esquerdo pelo sistema de perfusão de gravidade com 10-15 mL de solução salina de gelada Dulbecco tampão fosfato (PBS) e, em seguida, com 40-50 mL de 10% de formol tamponado neutro para consertar o sistema vascular. Fixação é indicada quando os camundongos apresentam contrações musculares vigorosas e tornar-se rígida.
   Nota: O processo de fixação ocorre em 10-20 min. É possível usar o fixo de órgãos e tecidos para realizar análises de imuno-histoquímica ou imunofluorescência. Importante, tais tecidos fixos não podem ser usados para a expressão de gene e análises de mancha ocidentais.
3. Separe o coração da aorta, mantendo o coração com a pinça e corte com tesoura ou com uma lâmina de bisturi, perpendicularmente ao eixo da aorta, tão próximo quanto possível ao coração sem causar danos (Figura 2A). Use uma lâmina de bisturi para cortar transversalmente ao longo de uma linha reta que une os pontos mais baixos do átrio direito e esquerdo (Figura 2B).
4. Preencher a parte superior do coração seccionado (através da cavidade do coração) com composto de corte ideal (OCT) (Figura 2D-2E). Coloca o tecido dentro de um molde de plástico cryosection com o eixo da aorta colocado perpendicularmente à base do molde retangular e cubra com OCT (Figura 2F). Não deve haver nenhuma bolha de ar presa. Se houver qualquer bolha, tente deslocá-lo para a borda.
5. Coloque uma placa de metal sobre gelo seco e cuidadosamente coloque o molde sobre (Figura 2). Quando a OCT torna-se branco, enrole o molde com a folha de prata e em seguida armazenar a –80 ° C.

4. seções corte da raiz aórtica

1. Ajuste a máquina do criostato a – 20 ° C. Antes de cortar, coloque o tecido incorporado e deixá-lo lá por cerca de 15 min ajustar-se a esta temperatura. Defina a temperatura de titular do espécime de-17 ° C (Figura 3A).
2. Coloque o bloco de coração congelado dentro da máquina do criostato para equilibrar a temperatura do bloco do criostato (Figura 3B) e retire o bloco de coração congelado do molde (Figura 3). Corte a excesso OCT de bloco congelado para melhor se adaptar as dimensões do bloco para o suporte de amostra (Figura 3D).
3. Montar o bloco de coração congelado no porta-amostra orientada com o ventricular virada para fora (Figura 3E-3I) e insira o suporte de amostra a amostra orientando a cabeça (Figura 3J). Ajuste a orientação do porta-amostra para permitir o corte do bloco a fim de fazer a raiz aórtica perpendicular da lâmina (Figura 3 K).
4. Corte o bloco e elimine fatias até atingir a raiz aórtica (Figura 3 L-3N). Recolher seções seriais e colocá-los nas corrediças de vidro (Figura 3O). Monitorar o perfil anatômico da raiz aórtica sob o microscópio, até que apareçam todos os 3 válvulas aórtica (Figura 3 P-3Q).
5. Recolher seções em 10 µm/seção para O vermelho de óleo e coloração Picro Sirius vermelho e a 6 µm/seção para MAC3 coloração (Figura 3R). Coletar em torno de slides de 6-8 (para cada coração) até uma das três válvulas desaparece ou já não está intactas.

5. imuno-histoquímica

Nota: Todas as etapas de coloração relatadas nos seguintes protocolos são executadas em potes de coloração de Coplin vidro.

1. Mancha de óleo O vermelho para gorduras neutras
   1. Corrigir as seções em 70 mL de formol 37% por 5 min. Lave bem em água corrente e borre fora excesso de água.
   2. Diluir 48 mL de óleo vermelho O (0,5% em isopropanol) em 32 mL de água destilada para obter o óleo vermelho O 0.3%.
   3. Mancha de seções em 70 mL de óleo vermelho O 0.3% por 10 min. seções de lavagem em água por 10 min da torneira.
   4. Manchar-se por 1 min em 70 mL de hematoxilina de Mayer. Lave as seções na água da torneira por 1 min.
   5. Mergulhe as seções em 70 mL de 0.5% de carbonato de lítio. Lavar em água da torneira por 1 min.
   6. Monte seções com uma montagem aquoso médio e captura de imagens usando uma câmera digital montada em um microscópio de luz.
2. Picro-Sirius vermelho mancha de colágeno
   1. 10 µm congelado de seções de corte e montagem na parte inferior do slide.
   2. Corrigi as seções em 70 mL de acetona para 5 min, ar seco e enxágue brevemente em água destilada.
   3. Insira seções em 70 mL de ácido fosfomolíbdico de 0,2% por 5 min. Enxágue brevemente em água destilada.
   4. Colocar seções em 70 mL de solução de Picro-Sirius 0,1% de 90 min. Lave uma vez com 70 mL de solução 0,01 N HCl. descartar.
   5. Lugar em 70 mL de 0,01 N HCl por 2 min. Enxágue brevemente em água destilada. Secar ao ar.
   6. Lugar brevemente em 70 mL de etanol a 70%.
   7. Quando estiver completamente seco, coloque em 70 mL de agente de origem terpenos de limpeza e montar seções usando poli (butil metacrilato -co-metacrilato de metila) com base de montagem média e captura de imagens usando uma câmera digital montada em um microscópio de luz.
      Nota: Uma das vantagens da coloração Picro Sirius vermelho é que é possível distinguir o tipo I (fibras grossas, birrefringência amarelo-laranja) e das redes de fibras de colágeno tipo III (fibras finas, birrefringência verde) por microscopia de luz polarizada¹¹ .
3. Mac3 mancha para coloração do macrófago
   1. 6 µm congelado de seções de corte e montagem na parte inferior do slide.
   2. Corrigi as seções em 70 mL de acetona gelada por 5 min. mergulhar em 70 mL de PBS por 2 min.
   3. Utilizando uma pipeta, seções de tampa com 1% de sódio Dodecil sulfato de solução (SDS) e incubam por 5 min à temperatura ambiente (RT) para recuperação do antígeno. Mergulhe em 70 mL de PBS por 5 min.
   4. Usando uma pipeta, cubra as fatias com 0,3% de água oxigenada de 20 min. lavar em 70 mL de PBS 3 vezes por 5 min.
   5. Use complexos avidina-biotina (ABC)-Kit de HRP para as etapas seguintes.
   6. Utilizando uma pipeta, bloquear seções no soro Normal de coelho em temperatura ambiente por 20 min. Não enxague.
   7. Mancha com MAC3 (1: 300) 90 min. a RT. Wash em 70 mL de PBS 3 vezes por 5 min.
   8. Mancha com secundário biotinilado anti-Rat IgG (1: 200) por 45 min em RT. Rinse com 70 mL de PBS 3 vezes por 5 min.
   9. Cobrir as seções com ABC de IgG de coelho por 30 min em RT. Rinse com 30 mL de PBS 3 vezes por 5 min.
   10. Cobrir as seções com 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) por 10 min. enxaguar com 70 mL de água destilada por 10 vezes.
   11. Manchar-se por 1 min em 70 mL de hematoxilina de Mayer. Lave as seções na água da torneira por 1 min.
   12. Mergulhe as seções em 70 mL de 0,5% de carbonato de lítio. Lavar em água da torneira por 1 min.
   13. Monte seções com uma montagem aquoso médio e captura de imagens usando uma câmera digital montada em um microscópio de luz.

6. imagem análise de lesões ateroscleróticas nas seções de raiz aórtica

Nota: As seções de raiz aórtica manchadas com óleo vermelho O ou MAC3 ou um anticorpo de interesse podem ser analisadas usando o software apropriado (indicado na Tabela de materiais). Pixéis totais coloração positiva para o componente de interesse é normalizado à área total da placa. Imagens foram recolhidas e analisadas por um investigador de tratamento-cego.

1. Calibração
   1. Software aberto e selecione a imagem (em jpg) para ser analisado.
   2. Selecione a página inicial | Criar | Calibração rápida.
   3. Configurar a calibração da imagem, desenhando uma linha ao longo da barra de escala da imagem.
   4. Guarde a configuração da calibração.
2. Análise de imagem
   1. Selecione a calibração salva a configuração no menu Opções | Opção de calibração espacial.
   2. Selecione calibração | Aplicam-se.
   3. Selecione a ferramenta polígono no menu selecionar e desenhar o perímetro ao longo de todas as lesões ateroscleróticas.
   4. Selecione Contagem/tamanho | Tipos. No menu, adicione área e Por cento.
   5. Menu de Contagem/tamanho , selecione Manual e uma nova janela abrirá.
   6. Desta janela clique na ferramenta escolher cor na imagem e selecione modo de HSI .
   7. Aponte o cursor do mouse sobre os pixels positivos do marcador de interesse para criar uma gama de cores.
   8. Clique em contagem e o valor de soma, observado na Tabela de medição, indica a porcentagem da área do marcador (também expressado em µm²) com relação a área total de lesões ateroscleróticas.

Resultados

Em 8-10 semanas ratos de Apo^{- / -} , minipumps foram implantados para infundir com veículo ou aldosterona (Figura 1E-1I) e alimentados com uma dieta aterogênico (42% de gordura da dieta calorias ajustadas) durante 4 semanas. No final do tratamento, os ratos foram sacrificados e perfundidos com PBS e formol a 10% conforme descrito acima. A raiz da aorta foi separada da porção apical do coração e foi incorporada na OCT (

Discussão

Aterosclerose é uma doença inflamatória crônica associada com navios grandes e médios envolvendo interações entre vários tipos de células, como macrófagos, linfócitos T, células endoteliais e células de músculo liso¹. Apesar das limitações dos modelos aterogênico murino, um vasto corpo de evidências sobre o processo aterosclerótico está disponível. Estes modelos têm a vantagem de gerar rapidamente coortes experimentais de uma idade específica e gênero. Ratos também mostram...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat)	Envigo	TD.88137	atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube	Alzet	model 1004	for continous realase
Aldosterone	SIGMA	A9477	hormone
Ethanol	SIGMA	34852-M	solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol	Kendal Webcol	6818	Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0)	Demas	500004	surgery
10% Povidone/iodine ointment	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	Antiseptic
Formalin 10%	SIGMA	HT5012	to fix vascolature
Cryomold	Bio-Optica	07-MP1515	for embedding
O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	for embedding
Cryostat	Leica	CM1900	instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Aurogene	AU-L0615-500	buffer solution
Adhesion Slides Polysine	VWR	631-0107	microscope glasses
Cover Glasses	Bio-Optica	72015	cover glasses
Formaldehyde 37%	SIGMA	252549	solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol)	SIGMA	O1391	staining solution
Mayer’s Hematoxylin	SIGMA	MHS32	staining solution
Lithium Carbonate	SIGMA	62470	washing buffer
Acqueous Mounting Medium	Thermo Scientific	TA-125-AM	mounting solution
Acetone	SIGMA	179124	solvent
Phosphomolybdic acid solution	SIGMA	HT153	for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red)	SIGMA	365548	staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin)	Bio-Optica	06-1782D	product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	SIGMA	3989	mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fluka	71725	powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %)	SIGMA	H1009	solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG ,	Vector Laboratories	PK-6100	staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole	Vector Laboratories	SK-4200	staining solution
Mac3 antibody	BD Biosciences	553322	antibody
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	software to analyze images