Induktion von atherosklerotischen Plaques durch Aktivierung von Mineralocorticoid-Rezeptoren im Apolipoprotein E-defizienten Mäusen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Atherosklerose in die Aortenwurzel von ApoE^{- / -} Mäusen gefüttert mit einem atherogenen Diät durch eine kontinuierliche Freisetzung von Aldosteron zu induzieren. Methoden zur Charakterisierung von Plaque Zusammensetzung werden ebenfalls beschrieben.

Zusammenfassung

Atherosklerose ist aufgrund einer chronischen Entzündungsreaktion beeinflussen Gefäßendothels und wird durch verschiedene Faktoren wie Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen und Diabetes gefördert. Bisher gibt es Beweise für eine Rolle für zirkulierenden Aldosteron als Risikofaktor für die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Krankheit zu unterstützen. Transgenen Mausmodellen wurden erstellt, um die zellulären und molekularen Prozesse, die zu Arteriosklerose führen zu studieren. In diesem Manuskript beschreiben wir eine Protokoll, die nutzt die Vorteile der kontinuierlichen Infusion von Aldosteron bei ApoE^{- / -} Mäusen und erzeugt arteriosklerotische Plaques in der Aortenwurzel nach 4 Wochen der Behandlung. Wir zeigen daher eine Methode zur Quantifizierung und Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen auf der Ebene der Aortenwurzel. Der Mehrwert der Aldosteron-Infusion wird durch die Generation der reich an Lipiden und Entzündungszellen atherosklerotische Läsionen nach 4-wöchiger Behandlung dargestellt. Wir beschreiben ausführlich die befleckenden Verfahren zur Quantifizierung der Lipid- und Makrophagen Inhalt innerhalb der Plakette. Insbesondere in diesem Protokoll führen wir Herzen im OAT Nachweisbarkeit von Antigenen von Interesse zu bewahren die Antigenität von Herzgewebe Gewebe einbetten. Analyse der Plaque-Phänotyp ist einen gültigen Ansatz, die Pathophysiologie der Atherosklerose-Entwicklung zu studieren und um neue pharmakologische Targets für die Entwicklung von Anti-atherogenen Drogen zu identifizieren.

Einleitung

Arteriosklerose ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit¹. Es zeichnet sich durch eine chronische entzündliche Zustand, wo Blutgefäße infiltriert werden durch Lipide und Leukozyten, die die Bildung von atherosklerotischen Plaques zu bestimmen. Die Mehrheit der akuten kardialen Ereignissen sind verbunden mit thrombotischen Ereignissen durch Plaque-Ruptur. Plaques anfällig für Bruch "anfällig" definiert werden und zeichnen sich durch erhöhte Infiltration von Pro-inflammatorischen Leukozyten, einem nekrotischen Kern und eine dünne fibröse Kappe². In den letzten Jahrzehnten haben klinische und experimentelle Studien der komplexen Pathophysiologie der Erkrankung geklärt. Verschiedenen Tiermodellen werden verwendet, um die molekularen Mechanismen der Induktion von Atherosklerose³zu untersuchen. Die Maus ist derzeit die am häufigsten verwendeten Arten, Atherosklerose trotz einiger artspezifische Unterschiede in der Pathophysiologie im Vergleich zu Menschen zu studieren. Insbesondere zirkulierenden Cholesterin von High-Density-Lipoproteine (mit antiatherogenic Eigenschaften) in Mausmodellen besteht hauptsächlich während beim Menschen zirkulierenden Cholesterin vor allem als Low-Density-Lipoproteine (LDL) transportiert wird wahrscheinlich Vertretung der Hauptgrund, warum Wildtyp Mäusen nicht spontan Atherosklerose⁴entwickeln. Wildtyp-Mäusen sind darüber hinaus in der Regel resistent gegen die Aufnahme von Cholesterin aus der Nahrung, während Menschen rund 50 % des diätetischen Cholesterins⁴aufnehmen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere gentechnisch veränderte Mausmodelle generiert. Apolipoprotein E-defizienten Maus (ApoE^−/−) und LDL-Rezeptor-defizienten Maus (LDLr^−/−) sind weit verbreitet. Eine fettreiche cholesterinreichen Diät ApoE^−/− Mäuse entwickeln Plaque mehr schnell im Vergleich zu LDLr^−/−Mäuse, und aus diesem Grund ist die Verwendung von ApoE^−/− Mäuse weiter verbreitet als die LDLr^−/−Mäuse^5,6. Die ApoE^−/− Mäuse Läsionen in jedem Stadium der Arteriosklerose zu entwickeln und sind vergleichbar mit denen bei Menschen beobachtet, obwohl Maus Plaketten keine instabile Phänotyp⁷zeigen. In der Regel ApoE^−/− Mäuse entwickeln spontan Atherosklerose und dieser Prozess wird beschleunigt, mit einem westlichen Diät³. Die Schwere der Atherosklerose kann auf der Ebene der Carotis, pulmonale, Femur- und Brachiocephalic Arterie und die Aortenwurzel⁶ausgewertet werden. Insbesondere stellt die Aortenwurzel einen anatomischen Ort anfällig für atherosklerotische Läsionen bei Mäusen zu entwickeln. Aus diesem Grund ist es üblich, die Bildung von atherosklerotischen Plaques in dieser Region zu bewerten.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass Aldosteron in der Entwicklung von Atherosklerose^8,9,10beteiligt ist. Aldosteron-Infusion bei ApoE^−/− Mäusen eine atherogenen Diät gefüttert beschleunigt die Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen Aortenwurzel induzierende entzündet und lipidreichen Plaque-Bildung-¹⁰.

Zusammenfassend lässt sich sagen beschreiben wir ein Protokoll einschließlich Aldosteron Infusion, atherogenen Ernährung Fütterung, Einbettung von Herzen Gewebe, Quantifizierung und Charakterisierung von atherosklerotischen Läsionen in ApoE^{- / -} Mäusen. Dieses Verfahren fördert eine effiziente Bildung von entzündeten, lipidreichen arteriosklerotische Plaques und stellt ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Atherogenese.

Protokoll

Die Studie wurde vom italienischen National Institute of Health Care und Nutzung Ausschüsse, Autorisierung Nr. 493/2016-PR. Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft für den Einsatz von Versuchstieren durchgeführt (EU-Richtlinie 2010/63/UE).

Hinweis: Subkutane Implantation des osmotischen Minipump mit Fahrzeug (Äthanol in Kochsalzlösung) oder Aldosteron (240 µg · kg^-1 · d^-1) in 8-10 Woche-alten männlichen Mäusen unzulänglich für das ApoE -gen. Im Allgemeinen, 8-10 Wochen-alte männliche ApoE^−/− Mäuse wiegen ca. 25-26 g.

(1) Auflösung Aldosteron

1. 5 mg Aldosteron Pulver in 1 mL absolutes Ethanol auflösen.
2. 68.3 µL Kochsalzlösung 56,7 µL Aldosteron (gelöst in Ethanol) hinzufügen, um eine Konzentration von 2,27 µg zu erhalten / µL. füllen die gesamte osmotische Minipumps komplett mit 125 µL dieser Lösung (maximale Kapazität jeder Minipump ist 125 µL).
3. Verwenden Sie einen Minipump Durchfluss von 0,11 µL/h; Daher 2.64 µL der Lösung veröffentlicht alle 24 Std. geben jeder Maus etwa 6 µg · d^-1 von Aldosteron für 28 Tage.

(2) osmotischen Pumpe Befüllen und Implantation

Hinweis: Pumpen werden in zwei getrennten Teilen geliefert: der Hauptteil der Pumpe und der Durchflussregler.

1. Füllen und die OP-Handschuhe mit Minipumps zu behandeln.
   Hinweis: Hautöle können die Leistung des Minipumps stören. Die folgenden Schritte sollten in einem sterilen Laminar-Flow-Abzug durchgeführt werden.
2. Legen Sie die Füllung Schlauch (im Lieferumfang der Minipumps) auf eine 1 mL Spritze und erarbeiten Sie die Aldosteron-Lösung oder Fahrzeug.
   Hinweis: Es ist wichtig zu vermeiden, dass Luft in die Spritze beim Absaugen von Lösungen aus der Tube, die Bildung von Luftblasen in der Pumpe zu verhindern.
3. Legen Sie die Füllung Schlauch durch das Loch am oberen Rand der Minipump, bis es nicht weiter gehen kann (Abbildung 1A-1 b). Langsam füllen der Pumpe mit dem Aldosteron oder Fahrzeug. Beachten Sie den dunklen Schatten im Inneren der Pumpe unter Angabe des Flüssigkeitsspiegels. Sehen Sie sich diese Ebene steigen zusammen mit der Zapfsäule.
   1. Befüllpumpe steigt eine Perle von Flüssigkeit aus dem Pumpenkörper zu stoppen.
4. Sorgfältig entfernen Sie den Füllung-Schlauch und stecken Sie den Durchflussregler in den Körper des Minipump (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass der Regler fest gegen den Pumpenkörper sitzt. Verlassen Sie die gefüllten osmotischen Pumpen in ein Becherglas mit steriler Kochsalzlösung bei 37 ° C für bis zu 24 h vor der Implantation in der Maus (Priming-Verfahren).
5. Führen Sie Operation in eine desinfizierte Bereich mit 70 % Ethanol, die Asepsis fördert.
6. 1-3 Tropfen am Schnitt Standort von Bupivacain 0,25 % und Betäuben Sie das Tier mit 3 % Isofluran zu. Schalten Sie das Gas Versorgung und Durchflussmessers auf 500-1000 mL/min Platz das Tier in der Induktion Kammer und Dichtung oben. Schalten Sie den Verdampfer, 5 % Isofluran und überwachen Sie die Maus bis Liegerad.
   1. Schalten Sie das System um das Nosecone fließen. Entfernen Sie das Tier aus der Kammer und Position in das Nosecone. In ca. 2-3 Minuten beginnt die Maus zu wecken. Starten Sie neu Gasstrom mit Durchflussmesser mit 100-200 mL/min und der Verdampfer bei 3 % Isofluran.
   2. Sorgen Sie für ausreichende Tiefe der Narkose vor der Durchführung von Verfahren durch das Pedal Rückzug und palpebrale Reflexe testen. Atmung und Reaktion auf die Stimulation während des Verfahrens zu überwachen und Verdampfer nach Bedarf anpassen.
   3. Zum Schutz der Hornhaut vor dem Austrocknen durch die Anwendung einer ophthalmologischen Salbe.
7. Bereiten Sie das Tier durch Entfernen von Haaren aus der Operationsstelle mit einem Rasiermesser (Abbildung 1). Die üblichen Website für subkutane Implantation von Pumpen ist auf der Rückseite.
8. Vorbereiten der Operationsstelle mit Vlies Polstermaterial mit 70 % Isopropylalkohol gesättigt.
9. Verwenden Sie ein sauberes und engagierten Leerzeichen (mit 70 % igem Ethanol desinfiziert) und mit einem sterilen Tuch abgedeckt. Setzen Sie die Spitze der Instrumente in einem Glas Bead Sterilisator. Chirurgie mit sterilisierte Instrumente beginnen und Instrumente aseptisch zu behandeln.
10. Verwenden, chirurgische Scheren um 0,8-1 cm Schnitt (ca. 2 cm in der Nähe der Rute), wie in Figuren 1E 1F. Pflegen Sie Sterilität durch etwas außerhalb der chirurgischen Raum gewidmet mit sterilen Handschuhen oder Spitzen der Instrumente nicht zu berühren.
11. Achten Sie darauf, um nur die Haut, aber nicht das darunter liegende Gewebe zu schneiden. Verwenden Sie einerseits, um Zange, öffnen Sie den Schnitt zu halten. Verwenden Sie hingegen um den Trokar an die Haut zu verteilen, um eine Tasche für die Pumpe von der Rückseite nach oben auf das Schulterblatt (auf der rechten oder linken Seite der Maus) erstellen zu halten.
12. Legen Sie die Pumpe in den Schnitt. Schieben Sie die Pumpe komplett in die Tasche (Abbildung 1 H). Es sollte genug Haut frei, schließen Sie die Wunde ohne Spannung oder Dehnung der Haut benötigt. Sobald die Pumpe eingefügt worden ist, Naht des Schnittes mit Chirurgie Draht (Polyglactin 910 mit Naht Größe 6-0)
    Hinweis: Der Kopf des Reglers muss auf der Vorderseite der Maus (Abbildung 1) ausgerichtet sein.
13. Aktuell 10 % Povidon/Jod Salbe mit einem sauberen Wattestäbchen (Abbildung 1I) und halten Sie das Tier auf einer Erwärmung Bühne. Verlassen Sie Mäuse nicht in unbeaufsichtigten, bis sie sternalen liegen erholen. Werten Sie die Flüssigkeitszufuhr Status aus und verwalten Sie 0,5 mL 0,9 % Kochsalzlösung subkutan zu, wenn nötig. Das Tier mit seiner Routine Gehäuse zurück.
14. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für Dokumentation (z. B. eine chirurgische Form füllen Sie mit operativen und postoperativen Informationen, Update-Käfig-Karte mit Verfahren und Datum) und Analgetika (Buprenorphin, 0,05 mg/kg), um postoperative Schmerzen zu lindern und Antibiotika (Enrofloxacin 85 mg/kg), postoperative Infektion zu vermeiden.
    1. Weiterhin täglich überwachen und untersuchen Sie auf Anzeichen von Schmerzen. Achten Sie darauf, die Wunde ist komplett geschlossen und Minipump bleibt in der subkutanen Tasche. Die Wunde kann geöffnet werden und die Maus kann die Minipump verlieren.

3. die Dissektion des Herzens

1. Zum Zeitpunkt des Opfers, Anestethize Mäuse mit 80-100 mg/kg Zoletil intramuskulär verabreicht. Zoletil induziert Tiefe Narkose. Hinweis: sicherstellen Sie, dass Mäuse auf eine ausreichende Tiefe der Narkose vor der Durchführung von Verfahren durch das Testen der Pedal und palpebrale Reflexe sind; Mäuse werden durchblutet werden, während tief narkotisiert. Öffnen Sie die Brusthöhle, mit Schere und Pinzette, durch Ablängen der Rippen seitlich des Brustbeins, mit dem Brustbein in Richtung zum Kopf zurückgezogen wird.
2. Durchspülen Sie die Maus über die linke Herzkammer durch Schwerkraft Perfusion System mit 10-15 mL eiskaltes Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und dann mit 40-50 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin, das Gefäßsystem zu beheben. Fixierung ist indiziert, wenn die Mäuse kräftige Muskelkontraktionen zeigen und steif.
   Hinweis: Die Befestigung erfolgt in 10-20 min. Es ist möglich, die feste Organe und Gewebe zu verwenden, um Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie Analysen durchzuführen. Wichtig ist, können solchen festen Geweben für die Genexpression und western Blot Analysen verwendet werden.
3. Trennen Sie das Herz aus der Aorta durch das Herz mit der Zange halten und Schneiden mit Schere oder einem Skalpellklinge senkrecht zur Achse der Aorta, so nah wie möglich an das Herz, ohne Schaden anzurichten (Abbildung 2A). Verwenden Sie eine Skalpellklinge schneiden quer entlang einer geraden Linie, die die unteren Punkte von den rechten und linken Vorhof (Abb. 2 b) verbindet.
4. Füllen Sie den oberen Teil des geschnittenen Herzen (durch die Kavität des Herzens) mit optimale Verbindung (OCT) (Abb. 2D-2E). Legen Sie das Gewebe innerhalb einer Cryosection Kunststoff-Formenbau mit der Achse der Aorta platziert senkrecht auf der Basis der rechteckigen Form und Deckel mit OCT (Abb. 2F). Es darf keine Luftblase gefangen. Wenn jede Blase vorhanden ist, versuchen Sie es an den Rand zu verdrängen.
5. Legen Sie eine Metallplatte auf Trockeneis und setzen Sie dann die Form vorsichtig auf (Abbildung 2). Wenn das Office-Anpassungstool weiß wird, wickeln Sie den Schimmel mit Silberfolie und dann speichern bei –80 ° C.

4. Schneiden Abschnitte von der Aortenwurzel

1. Festlegen der Kryostat-Maschine bis – 20 ° C. Legen Sie vor dem Schneiden das eingebettete Gewebe und lassen Sie ihn dort für ca. 15 min. auf dieser Temperatur einstellen. Stellen Sie die Probe Halter Temperatur bis-17 ° C (Abb. 3A).
2. Legen Sie die gefrorenen Herzblock innerhalb der Kryostat-Maschine zu equilibrate die Temperatur des Blocks der Kryostat (Abb. 3 b) und nehmen Sie die gefrorenen Herzblock aus der Form (Abbildung 3). Schneiden Sie das überschüssige OAT aus dem gefrorenen Block Block Abmessungen, Probenhalter (Abbildung 3D) besser anzupassen.
3. Montieren Sie die gefrorenen Herzblock auf Probenhalter mit der linksventrikulären nach außen orientierten (Abbildung 3E-3I) und legen Sie die Probenhalter in der Probe Kopf (Abbildung 3J) orientieren. Stellen Sie die Ausrichtung der Probenhalter Schneiden des Blocks zu ermöglichen, damit die Aortenwurzel senkrecht zur Klinge (Abbildung 3 K) machen.
4. Schneiden Sie den Block und Scheiben zu verwerfen, bis die Aortenwurzel erreicht ist (Abbildung 3 L-3N). Sammeln Sie Serienschnitte zu und legen Sie sie auf den Objektträger (Abbildung 3O). Die Aortenwurzel anatomischen Profil unter dem Mikroskop zu überwachen, bis alle 3 Aortenklappen angezeigt werden (Abbildung 3 P-3Q).
5. Sammeln Sie Abschnitte bei 10 µm/Fachgruppe Öl Rot O Picro Sirius rote Färbung, und bei 6 µm/Fachgruppe MAC3 Färbung (Abbildung 3R). Sammeln um 6-8 Folien (für jedes Herz) bis eines der drei Ventile verschwindet oder nicht mehr intakt ist.

5. Immunohistochemistry

Hinweis: Alle Färbung Schritte in den folgenden Protokollen gemeldet sind im Glas Coplin färbeküvetten durchgeführt.

1. Rote O Ölfleck für neutrale Fette
   1. Beheben Sie Abschnitte in 70 mL Formaldehyd 37 % für 5 min. Waschen auch in Leitungswasser zu und tupfen Sie überschüssiges Wasser.
   2. Verdünnen Sie 48 mL Öl Rot O (0,5 % Isopropanol) in 32 mL destilliertem Wasser Öl Rot O erhalten 0,3 %.
   3. Färben Sie Abschnitte in 70 mL Öl rot o 0,3 % für 10 min. Waschen Abschnitte in Leitungswasser für 10 Minuten.
   4. Fleck für 1 min in 70 mL von Mayers Hämatoxylin. Waschen Sie Abschnitte im Leitungswasser für 1 min.
   5. Tauchen Sie Abschnitte in 70 mL 0,5 % Lithiumcarbonat. In Leitungswasser für 1 min waschen.
   6. Montieren Sie Abschnitte mit einer wässrigen Montage Medium und Capture Bilder mit einer digitalen Kamera montiert auf einem Lichtmikroskop.
2. Picro Sirius rot färben für Kollagen
   1. 10 µm eingefroren Abschnitte schneiden und montieren in der Unterseite der Folie.
   2. Abschnitte in 70 mL Aceton für 5 min, Lufttrocknen und spülen Sie kurz in destilliertem Wasser zu beheben.
   3. Platzieren Sie Abschnitte in 70 mL 0,2 % Phosphomolybdic Säure für 5 min kurz in destilliertem Wasser spülen.
   4. Legen Sie Abschnitte in 70 mL 0,1 % Picro Sirius Lösung für 90 min. Spülen einmal mit 70 mL 0,01 N HCl. verwerfen Lösung.
   5. Ort in 70 mL 0,01 N HCl für 2 min. Spülen kurz in destilliertem Wasser. An der Luft trocknen.
   6. Kurz in 70 mL 70 % igem Ethanol statt.
   7. Wenn es vollständig getrocknet, in 70 mL clearing Agent Terpene Ursprungs aufgelegt und mit Poly (Butyl Methacrylat -co-methylmethacrylat) basierte Montage Medium und Capture Bilder mit einer digitalen Kamera montiert auf einem Lichtmikroskop.
      Hinweis: Die Vorteile der Picro Sirius rote Färbung gehört, dass es möglich ist, den Typ zu unterscheiden I (Dicke Fasern, Gelb-Orange Doppelbrechung) und Typ III (dünne Fasern, grüner Doppelbrechung) Kollagen Glasfasernetze durch polarisierte Lichtmikroskopie¹¹ .
3. Mac3 Fleck für Makrophagen Färbung
   1. 6 µm eingefroren Abschnitte schneiden und montieren in der Unterseite der Folie.
   2. Abschnitte in 70 mL kaltem Aceton für 5 min. Tauchen in 70 mL PBS für 2 min zu beheben.
   3. Mit einer Pipette, Deckprofile mit 1 % des Sodium Dodecyl sulfat-Lösung (SDS) und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur (RT) für Antigen-Retrieval. Tauchen Sie in 70 mL PBS für 5 Minuten.
   4. Mit einer Pipette, die Scheiben mit 0,3 % Wasserstoffperoxid für 20 min. Waschen in 70 mL PBS 3 Mal für 5 min abdecken.
   5. Verwenden Sie Avidin-Biotin-komplexe (ABC)-HRP-Kit für die folgenden Schritte.
   6. Mit einer Pipette, blockieren Sie Abschnitte im normalen Kaninchen-Serum bei Raumtemperatur für 20 min. Nicht abspülen.
   7. Mit MAC3 verfärben (1: 300) für 90 min. bei RT. Wash in 70 mL PBS 3 Mal für 5 Minuten.
   8. Färben Sie mit weiterführenden biotinylierte Anti-Ratte IgG (1: 200) für 45 min bei RT. Spülen mit 70 mL PBS 3 Mal für 5 Minuten.
   9. Sollte in den Kapiteln mit Kaninchen IgG ABC für 30 min bei RT. Spülen mit 30 mL PBS 3 Mal für 5 Minuten.
   10. Decken Sie die Abschnitte mit 3-amino-9-Ethylcarbazole (AEC) für 10 min. Spülen mit 70 mL destilliertes Wasser für 10-mal.
   11. Fleck für 1 min in 70 mL von Mayers Hämatoxylin. Waschen Sie Abschnitte im Leitungswasser für 1 min.
   12. Tauchen Sie Abschnitte in 70 mL 0,5 % Lithiumcarbonat. In Leitungswasser für 1 min waschen.
   13. Montieren Sie Abschnitte mit einer wässrigen Montage Medium und Capture Bilder mit einer digitalen Kamera montiert auf einem Lichtmikroskop.

(6) Bildanalyse von atherosklerotischen Läsionen in Aortenwurzel Abschnitte

Hinweis: Aortenwurzel Abschnitte gebeizt mit Öl Rot O oder MAC3 oder eines Antikörpers von Interesse können mittels geeigneter Software (Angabe in Tabelle of Materials) analysiert werden. Total Pixel Färbung positiv für die Komponente von Interesse ist auf die Gesamtfläche der Plaque normalisiert. Bilder wurden gesammelt und durch eine Behandlung geblendet Ermittler analysiert.

1. Kalibrierung
   1. Öffnen Sie Software und wählen Sie dann das Bild (Jpg) analysiert werden.
   2. Wählen Sie die Home | Erstellen | Schnelle Kalibrierung.
   3. Richten Sie die Kalibrierung des Bildes durch Ziehen einer Linie entlang der Maßstab des Bildes.
   4. Speichern Sie das Setup der Kalibrierung.
2. Bildanalyse
   1. Wählen Sie die gespeicherte Setup Kalibrierung aus Menü " Optionen " | Räumlichen Kalibrierung Option.
   2. Wählen Sie die Kalibrierung | Gelten.
   3. Wählen Sie das Polygon-Werkzeug Wählen Sie im Menü auf und ziehen Sie den Rand entlang aller atherosklerotischen Läsionen.
   4. Wählen Sie Die Anzahl/Größe | Typen. Fügen Sie über das Menü und Prozent-Bereich hinzu .
   5. Anzahl/Größe werden ausgewählte Handbuch und ein neues Fenster öffnen Sie im Menü.
   6. In diesem Fenster klicken Sie auf die Farbauswahl auf Bild und wählen Sie HSI -Modus.
   7. Punkt der Maus-Cursor auf die positive Pixel des Markers von Interesse für eine Palette von Farben zu erstellen.
   8. Klicken Sie auf die Anzahl und den Wert Summe, beobachtet in der Messtisch, gibt den Prozentsatz des Bereichs des Markers (auch ausgedrückt in µm²) in Bezug auf die Gesamtfläche von atherosklerotischen Läsionen.

Ergebnisse

In 8-10 Wochen Apo^{- / -} Mäuse wurden Minipumps zur Infusion mit Fahrzeug oder Aldosteron implantiert (Abb. 1E-1I) und eine atherogenen Diät (bereinigte Kalorien Diät 42 % aus Fett) für 4 Wochen gefüttert. Am Ende der Behandlung waren Mäuse eingeschläfert und durchblutet PBS mit 10 % Formalin wie oben beschrieben. Die Aortenwurzel trennte sich von der apikalen Teil des Herzens und war eingebettet im OAT (...

Diskussion

Arteriosklerose ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die große und mittlere Schiffe mit Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen, wie z. B. Makrophagen, T-Lymphozyten, Endothelzellen und glatten Muskelzellen Zellen¹zugeordnet. Trotz der Einschränkungen der murinen atherogenen Modelle gibt es ein großen Körper des Beweises auf den atherosklerotischen Prozess. Diese Modelle haben den Vorteil, schnell generieren experimentelle Kohorten von einem bestimmten Alter und Geschlecht. Mäuse z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat)	Envigo	TD.88137	atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube	Alzet	model 1004	for continous realase
Aldosterone	SIGMA	A9477	hormone
Ethanol	SIGMA	34852-M	solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol	Kendal Webcol	6818	Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0)	Demas	500004	surgery
10% Povidone/iodine ointment	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	Antiseptic
Formalin 10%	SIGMA	HT5012	to fix vascolature
Cryomold	Bio-Optica	07-MP1515	for embedding
O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	for embedding
Cryostat	Leica	CM1900	instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Aurogene	AU-L0615-500	buffer solution
Adhesion Slides Polysine	VWR	631-0107	microscope glasses
Cover Glasses	Bio-Optica	72015	cover glasses
Formaldehyde 37%	SIGMA	252549	solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol)	SIGMA	O1391	staining solution
Mayer’s Hematoxylin	SIGMA	MHS32	staining solution
Lithium Carbonate	SIGMA	62470	washing buffer
Acqueous Mounting Medium	Thermo Scientific	TA-125-AM	mounting solution
Acetone	SIGMA	179124	solvent
Phosphomolybdic acid solution	SIGMA	HT153	for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red)	SIGMA	365548	staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin)	Bio-Optica	06-1782D	product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	SIGMA	3989	mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fluka	71725	powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %)	SIGMA	H1009	solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG ,	Vector Laboratories	PK-6100	staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole	Vector Laboratories	SK-4200	staining solution
Mac3 antibody	BD Biosciences	553322	antibody
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	software to analyze images