Inducción de las placas ateroscleróticas a través de la activación de los receptores de mineralocorticoides en ratones deficientes en apolipoproteína E

Resumen

Se describe un protocolo para inducir ateroesclerosis en la raíz aórtica de ApoE^{- / -} los ratones alimentados con una dieta aterogénico, a través de una continua liberación de aldosterona. También se describen métodos para caracterizar la composición de la placa.

Resumen

Aterosclerosis es debido a una respuesta inflamatoria crónica que afecta el endotelio vascular y es promovida por varios factores como la hipertensión, la dislipidemia y la diabetes. Hasta la fecha, hay evidencia para apoyar un papel circulante aldosterona como un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. Se han generado modelos de ratón transgénico para estudiar procesos celulares y moleculares que llevan a la aterosclerosis. En este manuscrito, se describe un protocolo que se aprovecha de la infusión continua de la aldosterona en ApoE^{- / -} ratones y genera las placas ateroscleróticas en la raíz aórtica después de 4 semanas de tratamiento. Nosotros, por lo tanto, ilustra un método para la cuantificación y caracterización de las lesiones ateroscleróticas en la raíz aórtica. El valor añadido de la infusión de aldosterona está representado por la generación de las lesiones ateroscleróticas ricas en lípidos y células inflamatorias después de 4 semanas de tratamiento. Describimos en detalle los procedimientos de tinción para cuantificar el contenido de lípidos y macrófagos dentro de la placa. En particular, en este protocolo, realizamos corazón tejido-inclusión en OCT con el fin de preservar la antigenicidad del tejido cardíaco y facilitar la detección de antígenos de interés. Análisis del fenotipo de placa representa un enfoque válido para el estudio de la fisiopatología del desarrollo de aterosclerosis y para identificar nuevas dianas farmacológicas para el desarrollo de fármacos anti-aterogénicos.

Introducción

La ateroesclerosis es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo¹. Se caracteriza por un estado inflamatorio crónico donde los vasos sanguíneos están infiltrados por los lípidos y leucocitos que determinan la formación de placas ateroscleróticas. La mayoría de los eventos cardíacos agudos se asocian con eventos trombóticos debido a la ruptura de la placa. Propensos a la ruptura de las placas se definen "vulnerables" y se caracterizan por la infiltración creciente de leucocitos proinflamatorios, un núcleo necrótico y una cubierta fibrosa delgada². En las últimas décadas, estudios clínicos y experimentales han aclarado la compleja Fisiopatología de la enfermedad. Varios modelos animales se utilizan para investigar los mecanismos moleculares implicados en la inducción de ateroesclerosis³. Actualmente, el ratón es la especie más frecuentemente usada para el estudio de ateroesclerosis a pesar de algunas diferencias específicas de especies existentes en su fisiopatología en comparación con los seres humanos. En particular, colesterol de circulación está compuesto principalmente por lipoproteínas de alta densidad (con propiedades antiaterogénica) en modelos de ratón, mientras que en los seres humanos circulantes de colesterol principalmente es transportado como lipoproteínas de baja densidad (LDL), probablemente que representa la razón principal por qué ratones de tipo salvaje no desarrollan aterosclerosis espontánea⁴. Además, ratones de tipo salvaje son generalmente resistentes a la absorción de colesterol de la dieta, mientras que los seres humanos absorben aproximadamente el 50% de colesterol de la dieta⁴. Para superar estas limitaciones, se han generado varios modelos de ratón modificados genéticamente. Apolipoproteína E-deficiente ratón (ApoE^−/−) y el ratón – deficiencia del receptor de LDL (LDLr^−/−) son ampliamente utilizados. En una dieta de alto contenido de grasa de colesterol alto, ApoE^−/− ratones desarrollan placa más rápidamente en comparación con ratones^−−/LDLr, y por esta razón, el uso de ratones^{− −/}ApoE es más extenso que el de LDLr^−/−ratones^5,6. Los ratones^{− −/}de ApoE desarrollan lesiones en cualquier etapa de la aterosclerosis y son comparables a los observados en seres humanos, aunque las placas de ratón no muestran un fenotipo inestable⁷. Generalmente, ApoE^−/− ratones espontáneamente desarrollan aterosclerosis y este proceso se acelera con una dieta occidental³. La severidad de la aterosclerosis puede ser evaluada a nivel de la carótida, femoral, pulmonar y la arteria braquiocéfala y la raíz aórtica⁶. En particular, la raíz aórtica representa un sitio anatómico propenso para el desarrollo de lesiones ateroscleróticas en ratones. Por esta razón, es práctica común para evaluar la formación de placas ateroscleróticas en esta región.

Varios estudios han demostrado que la aldosterona está implicada en el desarrollo de ateroesclerosis^8,9,10. Infusión de aldosterona en ApoE^−/− ratones alimentados con una dieta aterogénico acelera el desarrollo de lesiones ateroscleróticas de la raíz aórtica inductora de la formación de placa inflamada y rico en lípidos¹⁰.

En Resumen, se describe un protocolo de infusión de la aldosterona, aterogénico dieta alimentación, fijación de los tejidos del corazón, cuantificación y caracterización de las lesiones ateroscleróticas en ApoE^{- / -} ratones. Este procedimiento promueve una eficiente formación de placas ateroscleróticas inflamadas, rico en lípidos y representa un modelo valioso para el estudio de la aterogénesis.

Protocolo

El estudio fue aprobado por los comités de uso, autorización número 493/2016-PR y el italiano nacional institutos de salud Todos los procedimientos se realizaron por las directrices de la Comunidad Europea para el uso de animales de experimentación (Directiva Europea 2010/63/UE).

Nota: La implantación subcutánea de minipump osmótico con vehículo (etanol en solución salina) o aldosterona (240 μg · kg^-1 · d^-1) en 8-10 semanas-viejo hombres ratones deficientes para el gen de la ApoE . En general, 8-10 semanas-viejo ApoE^del −/ratones machos pesan alrededor de 25-26 g.

1. disolución de aldosterona

1. Disolver 5 mg de polvo de aldosterona en 1 mL de etanol absoluto.
2. Añadir 56,7 μl de aldosterona (disuelta en etanol) a 68,3 μl de solución salina para obtener una concentración de 2.27 μg / μl. Llene la minipumps osmótico todo completo con 125 μl de esta solución (capacidad máxima de cada minipump es 125 μL).
3. Utilizar un caudal minipump 0.11 μl/h; por lo tanto se libera 2.64 μl de la solución cada 24 h. dar cada ratón alrededor de 6 μg · d^-1 de la aldosterona durante 28 días.

2. implantación y el llenado de la bomba osmótico

Nota: Las bombas se suministran en dos partes separadas: el cuerpo principal de la bomba y el regulador de flujo.

1. Llenar y manejar el minipumps usando guantes quirúrgicos.
   Nota: Aceites de la piel pueden interferir con el funcionamiento de minipumps. Los pasos siguientes deben realizarse en una campana de flujo laminar estéril.
2. Conecte el tubo de llenado (provisto con el minipumps) a una jeringa de 1 mL y elaborar la solución de aldosterona o vehículo.
   Nota: Es importante evitar que el aire dentro de la jeringa mientras soluciones del tubo para evitar la formación de burbujas de aire en la bomba de aspiración.
3. Inserte el tubo de llenado a través del orificio en la parte superior de la minipump hasta puede ir a ninguna otra (figura 1A-1B). Poco a poco, llenar la bomba con la aldosterona o vehículo. Observe la sombra oscura dentro de la bomba que indica el nivel de líquido. Ver este aumento de nivel junto con la bomba de llenado.
   1. Parar la bomba de llenado cuando una gota de líquido se eleva fuera del cuerpo de la bomba.
4. Cuidadosamente retire el tubo de llenado e Introduzca el regulador de flujo en el cuerpo de minipump (figura 1). Asegúrese de que el regulador esté asentado firmemente contra el cuerpo de la bomba. Deja las bombas osmóticas llenadas en un vaso de precipitados que contiene solución salina estéril a 37 ° C por hasta 24 h antes de la implantación en el ratón (procedimiento de cebado).
5. Realizar cirugía en un área de desinfectado con etanol al 70% que promueve la asepsia.
6. Aplique 1-3 gotas en el sitio de la incisión de la bupivacaína 0.25% y anestesiar el animal con 3% de isoflurano. Encienda el suministro de gas y ajustar el flujómetro a 500-1000 mL/min lugar el animal en la sala de inducción y la parte superior del sello. Encienda el vaporizador a 5% isoflurano y controlar el ratón hasta reclinada.
   1. Cambiar el flujo de la nariz. Sacar el animal de la cámara y en la nariz. En 2-3 minutos, el ratón empieza a despertar. Reinicie el flujo de gas con el medidor de caudal de 100-200 mL/min y el vaporizador en el 3% de isoflurano.
   2. Garantizar la adecuada profundidad de la anestesia antes de realizar procedimientos de prueba pedal retiro y reflejos palpebrales. Controlar la respiración y la respuesta a la estimulación durante el procedimiento y ajuste vaporizador según sea necesario.
   3. Proteger las córneas de la desecación mediante la aplicación de un ungüento oftálmico.
7. Preparar el animal mediante la eliminación de pelo del sitio quirúrgico utilizando una maquinilla de afeitar (figura 1). El lugar habitual para la implantación subcutánea de bombas es en la parte posterior.
8. Preparar el sitio quirúrgico con material del cojín no tejido impregnado de alcohol isopropílico al 70%.
9. Utilice un espacio limpio y dedicado (desinfectado con etanol al 70%) y cubierto con un paño estéril. Coloque la punta de los instrumentos en un esterilizador de bolas de cristal. Comienza la cirugía con instrumentos esterilizados y manejar instrumentos asépticamente.
10. Utilice tijeras quirúrgicas para hacer un 0.8-1 incisión cm (aproximadamente 2 cm cerca de la cola), como se muestra en figuras 1E-1F. Mantener la esterilidad no tocando nada fuera del espacio dedicado quirúrgico guantes estériles o puntas de instrumentos.
11. Tenga cuidado de cortar solo la piel pero no los tejidos subyacentes. Utilice una mano para sujetar pinzas para abrir la incisión. Use la otra mano para sostener el trocar para difundir la piel para crear un bolsillo para la bomba de la parte posterior hacia arriba de la escápula (en el lado derecho o izquierdo del ratón).
12. Introducir la bomba en la incisión. Empuje suavemente la bomba completamente en el bolsillo (figura 1 H). Debe haber suficiente piel libre cerrar la herida sin tensión o estiramiento de la piel necesitada. Una vez que la bomba se ha insertado, sutura la incisión con el alambre de la cirugía (polyglactin 910 con el tamaño de la sutura 6-0)
    Nota: La cabeza del regulador debe estar orientada hacia el frente del ratón (figura 1).
13. Aplicar pomada tópica de yodo de povidona 10% con una esponja limpia (figura 1I) y mantener el animal en una etapa de calentamiento. No deje ratones sin supervisión hasta que se recupere recumbency esternal. Evaluar el estado de hidratación y administrar 0,5 mL de solución salina 0.9% por vía subcutánea si es necesario. Devolver el animal a su vivienda habitual.
14. Siga las directrices institucionales para la documentación (por ejemplo, llenar un formulario quirúrgico con información operativa y postoperatoria, actualización tarjeta de jaula con procedimiento y fecha) y analgésicos (buprenorfina, 0,05 mg/kg) para reducir el dolor post-surgical y antibióticos (enrofloxacina 85 mg/kg) para evitar la infección post-surgical.
    1. Continuar seguimiento diario y examinar en busca de signos de dolor. Prestar atención que la herida esté completamente cerrada y minipump se mantiene en el bolsillo subcutáneo. Puede abrir la herida y el ratón puede perder la minipump.

3. disección del corazón

1. En el momento del sacrificio, ratones anestethize con 80-100 mg/kg Zoletil administrado por vía intramuscular. Zoletil induce anestesia profunda. Nota: Compruebe que los ratones son en una adecuada profundidad de la anestesia antes de realizar procedimientos de pruebas el pedal y reflejos palpebrales; ratones se inundada mientras que profundamente anestesiados. Abrir la cavidad torácica, usando tijeras y pinzas, cortando las costillas lateralmente al esternón, con el esternón está retraído hacia la cabeza.
2. Perfusión de ratón a través del ventrículo izquierdo por sistema de perfusión por gravedad con 10-15 mL de una solución salina de helada Dulbecco tampón fosfato (PBS) y luego con 40-50 mL de 10% de formalina tamponada neutra para fijar la vasculatura. La fijación está indicada cuando los ratones presentan contracciones musculares vigorosas y se vuelven rígidos.
   Nota: El proceso de fijación ocurre en 10-20 minutos. Es posible utilizar los órganos fijos y tejidos para realizar la inmunofluorescencia o análisis de inmunohistoquímica. Lo importante, estos tejidos fijos no pueden utilizarse para western blot análisis y expresión génica.
3. Separar el corazón de la aorta manteniendo el corazón con las pinzas y cortar con tijeras o una cuchilla de bisturí, perpendicular al eje de la aorta, lo más cerca posible al corazón sin causar daño (figura 2A). Utilice una hoja de bisturí para cortar transversalmente a lo largo de una línea recta que une los puntos bajos del atrio derecho e izquierdo (figura 2B).
4. Llenar la parte superior del corazón seccionado (a través de la cavidad del corazón) con corte óptimo compuesto (OCT) (Figura 2D-2E). Poner el tejido dentro de un molde de plástico de criosección con el eje de la aorta situada perpendicular a la base del molde rectangular y cubierta con OCT (figura 2F). No debe haber ninguna burbuja de aire atrapada. Si alguna burbuja está presente, tratar de desplazar al borde.
5. Coloque una placa de metal en hielo seco y luego con cuidado el molde en la (figura 2). Cuando el OCT se vuelve blanco, envuelva el molde con papel de plata y luego almacenar en –80 ° C.

4. cortar secciones de la raíz aórtica

1. Coloque la máquina de criostato a-20 ° C. Antes de cortar, coloque el tejido embebido y déjelo allí por unos 15 min a esta temperatura. Ajuste la temperatura de sostenedor de la muestra a-17 ° C (Figura 3A).
2. Coloque el bloque de corazón congelado dentro de la máquina de criostato para equilibrar la temperatura del bloque a del criostato (figura 3B) y toma el bloque corazón congelado del molde (figura 3). Corte el exceso OCT del bloque congelado para adaptar mejor las dimensiones del bloque para las mordazas (figura 3D).
3. Monte el bloque de corazón congelado en el soporte de muestras con la ventricular hacia afuera (figura 3E-3I) e inserte el soporte de espécimen de la muestra orienta de la cabeza (figura 3J). Ajustar la orientación de las mordazas para permitir el corte del bloque y para hacer la raíz aórtica perpendicular a la lámina (figura 3 K).
4. Cortar el bloque y deseche rebanadas hasta llega a la raíz aórtica (figura 3 L-3N). Recoger las secciones seriales y colocarlos en el portaobjetos (figura 3O). Vigilar el perfil anatómico de raíz aórtica al microscopio hasta que aparezcan las 3 válvulas aórticas (figura 3 P-3Q).
5. Recoge secciones de 10 μm/sección de aceite rojo O y tinción de Picro Sirius rojo y 6 μm/sección para MAC3 tinción (figura 3R). Recoger alrededor de 6-8 diapositivas (para cada corazón) hasta que uno de las tres válvulas desaparece o ya no está intactos.

5. inmunohistoquímica

Nota: Todos los pasos de tinción en los protocolos siguientes se realizan en frascos tinción Coplin de vidrio.

1. Aceite rojo O mancha de grasas neutras
   1. Fijar las secciones en 70 mL de formaldehído al 37% por 5 min lavar bien en agua del grifo y secar el exceso de agua.
   2. Diluir 48 mL de aceite rojo O (0,5% en isopropanol) en 32 mL de agua destilada para obtener aceite rojo O 0.3%.
   3. Secciones en 70 mL de aceite rojo O la mancha 0.3% para las secciones de lavado de 10 minutos en agua durante 10 minutos del grifo.
   4. Mancha durante 1 minuto en 70 mL de hematoxilina de Mayer. Lávese las secciones en agua del grifo durante 1 minuto.
   5. Sumerja las secciones en 70 mL 0.5% de carbonato de litio. Lavar en agua corriente durante 1 minuto.
   6. Monte las secciones con un medio de montaje acuoso medio y captura imágenes con una cámara digital montada en un microscopio de luz.
2. Tinción de picro Sirius rojo para colágeno
   1. Corte 10 μm congelado secciones y montar en la parte inferior de la diapositiva.
   2. Fijar las secciones en 70 mL de acetona por 5 min, aire seco y enjuague brevemente con agua destilada.
   3. Coloque las secciones en 70 mL de 0,2% ácido fosfomolíbdico 5 minutos enjuague brevemente con agua destilada.
   4. Coloque las secciones en 70 mL de solución al 0.1% Picro Sirius 90 minutos enjuague una vez con 70 mL de solución 0.01 N HCl. Deseche.
   5. Lugar en 70 mL de HCl 0.01 de N durante 2 min enjuague brevemente en agua destilada. Secar al aire.
   6. Lugar brevemente en 70 mL de etanol al 70%.
   7. Cuando esté completamente seco, colocar en 70 mL de agente de origen terpeno del claro y montar secciones usando poli (butil metacrilato -co-metacrilato de metilo) base de montaje medio y captura imágenes con una cámara digital montada en un microscopio de luz.
      Nota: Una de las ventajas de la tinción de Picro Sirius rojo es que es posible distinguir el tipo I (fibras gruesas, birrefringencia de color amarillo-naranja) y redes de fibra de colágeno de tipo III (fibras finas, birrefringencia verde) por microscopía de luz polarizada¹¹ .
3. Mac3 tinción para la tinción de macrófago
   1. Cortar 6 μm congelado secciones y montar en la parte inferior de la diapositiva.
   2. Fijar las secciones en 70 mL de acetona fría por 5 min sumergir en 70 mL de PBS durante 2 minutos.
   3. Usando una pipeta, las secciones de la cubierta con 1% de sodio dodecil sulfato en solución (SDS) e incuban durante 5 min a temperatura ambiente (RT) para la recuperación de antígeno. Sumerja en 70 mL de PBS durante 5 minutos.
   4. Usando una pipeta, cubrir las rebanadas con peróxido de hidrógeno 0.3% durante 20 min lavado en 70 mL de PBS 3 veces durante 5 minutos.
   5. Utilizar complejos avidina-biotina (ABC)-HRP Kit para los siguientes pasos.
   6. Usando una pipeta, bloque de secciones en el suero de conejo Normal a temperatura ambiente durante 20 minutos. No enjuagar.
   7. Mancha con MAC3 (1:300) de 90 min en RT. Wash en 70 mL de PBS 3 veces durante 5 minutos.
   8. Mancha con secundario biotinilado anti-Rat IgG (1: 200) por 45 min en RT. Enjuague con 70 mL de PBS 3 veces durante 5 minutos.
   9. Cubrir las secciones con ABC de IgG de conejo durante 30 min a TA. Enjuague con 30 mL de PBS 3 veces durante 5 minutos.
   10. Cubrir las secciones con 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) durante 10 minutos enjuague con 70 mL de agua destilada durante 10 veces.
   11. Mancha durante 1 minuto en 70 mL de hematoxilina de Mayer. Lávese las secciones en agua del grifo durante 1 minuto.
   12. Sumerja las secciones en 70 mL de 0.5% carbonato de litio. Lavar en agua corriente durante 1 minuto.
   13. Monte las secciones con un medio de montaje acuoso medio y captura imágenes con una cámara digital montada en un microscopio de luz.

6. imagen análisis de las lesiones ateroscleróticas en las secciones de raíz aórtica

Nota: Las secciones de raíz aórtica teñidas con aceite rojo O o MAC3 o un anticuerpo de interés pueden ser analizadas utilizando el software apropiado (indicado en la Tabla de materiales). Pixeles totales tinción positiva para el componente de interés se normaliza a la superficie total de la placa. Imágenes fueron recogidos y analizados por un investigador cegado por el tratamiento.

1. Calibración
   1. Abra el software y luego seleccione la imagen (en jpg) a analizar.
   2. Seleccione la Página de inicio | Crear | Calibración rápida.
   3. Establecer la calibración de la imagen dibujando una línea a lo largo de la barra de escala de la imagen.
   4. Guardar la configuración de la calibración.
2. Análisis de imagen
   1. Seleccione la calibración de la configuración guardada del menú de Opciones | Opción de calibración espacial.
   2. Seleccione calibración | Aplicar.
   3. Seleccione la herramienta polígono en el menú seleccionar y dibujar el perímetro a lo largo de todas las lesiones ateroscleróticas.
   4. Seleccione el Tamaño de la cuenta | Tipos. En el menú, agregar área y Por ciento.
   5. De Tamaño y conteo de menú, seleccione Manual y una nueva ventana se abrirán.
   6. Desde esta ventana haga clic en la herramienta seleccionar color en la imagen y seleccione modo de HSI .
   7. El punto el cursor del ratón sobre los píxeles positivos del marcador de interés para crear una gama de colores.
   8. Haga clic en cuenta y el valor suma, observado en la Tabla de medida, indica el porcentaje del área del marcador (también expresado en μm²) con respecto al área total de las lesiones ateroscleróticas.

Resultados

En 8-10 semanas ratones^{- / -} Apo, minipumps fueron implantados para infundir con vehículo o aldosterona (Figura 1E-1I) y alimentados con una dieta aterogénico (42% de la grasa de la dieta calorías ajustados) durante 4 semanas. Al final del tratamiento, ratones fueron sacrificados y perfundidos con PBS y formalina al 10% como se describió anteriormente. La raíz aórtica fue separada de la porción apical del corazón y fue enca...

Discusión

La ateroesclerosis es un trastorno inflamatorio crónico asociado con vasos grandes y medianos que implican interacciones entre múltiples tipos de células, como macrófagos, linfocitos T, células endoteliales y músculo liso células¹. A pesar de las limitaciones de modelos murinos aterogénicos, existe un gran cuerpo de evidencia en el proceso aterosclerótico. Estos modelos tienen la ventaja de generar rápidamente cohortes experimentales de una edad específica y sexo. Ratones muestran tambi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat)	Envigo	TD.88137	atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube	Alzet	model 1004	for continous realase
Aldosterone	SIGMA	A9477	hormone
Ethanol	SIGMA	34852-M	solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol	Kendal Webcol	6818	Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0)	Demas	500004	surgery
10% Povidone/iodine ointment	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	Antiseptic
Formalin 10%	SIGMA	HT5012	to fix vascolature
Cryomold	Bio-Optica	07-MP1515	for embedding
O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	for embedding
Cryostat	Leica	CM1900	instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Aurogene	AU-L0615-500	buffer solution
Adhesion Slides Polysine	VWR	631-0107	microscope glasses
Cover Glasses	Bio-Optica	72015	cover glasses
Formaldehyde 37%	SIGMA	252549	solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol)	SIGMA	O1391	staining solution
Mayer’s Hematoxylin	SIGMA	MHS32	staining solution
Lithium Carbonate	SIGMA	62470	washing buffer
Acqueous Mounting Medium	Thermo Scientific	TA-125-AM	mounting solution
Acetone	SIGMA	179124	solvent
Phosphomolybdic acid solution	SIGMA	HT153	for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red)	SIGMA	365548	staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin)	Bio-Optica	06-1782D	product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	SIGMA	3989	mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fluka	71725	powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %)	SIGMA	H1009	solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG ,	Vector Laboratories	PK-6100	staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole	Vector Laboratories	SK-4200	staining solution
Mac3 antibody	BD Biosciences	553322	antibody
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	software to analyze images