Индукция атеросклеротических бляшек через активацию рецепторов минералокортикоиды аполипопротеин E-недостаточным мышей

Резюме

Мы описываем протокол побудить атеросклероза в корня аорты ароЕ^{- / -} мышей кормили с атерогенные диеты, посредством непрерывного освобождения альдостерона. Также описаны методы характеризовать состав зубного налета.

Аннотация

Атеросклероз является из-за хронической воспалительной реакции, затрагивающих эндотелия и способствует ряд факторов, таких как артериальной гипертензии, дислипидемии и сахарного диабета. На сегодняшний день, есть доказательства в поддержку роли для циркулирующих альдостерона как фактор риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Трансгенные мыши модели были созданы для изучения молекулярных и клеточных процессов, ведущих к атеросклероза. В этой рукописи мы описываем протокол, который использует преимущества непрерывной инфузии альдостерона в ароЕ^{- / -} мышей и генерирует атеросклеротических бляшек в корня аорты после 4 недель лечения. Мы, таким образом, иллюстрируют метод количественного определения и характеристики атеросклеротических поражений на уровне корня аорты. Добавленной стоимости альдостерона настой представлена поколения атеросклеротических поражений богатые липидов и воспалительных клеток после 4 недель лечения. Мы подробно описать окрашивание процедуры для количественного определения липидов и макрофагов содержимое налета. В частности в настоящем Протоколе, мы выполняем сердце ткани встраивание в OCT для сохранения антигенностью сердечной ткани и облегчения выявления антигенов интерес. Анализ фенотипа доска представляет собой допустимый подход для изучения патофизиологии развития атеросклероза и выявления роман фармакологических цели в области развития анти атерогенные наркотиков.

Введение

Атеросклероз является одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире¹. Он характеризуется хронические воспалительные состояния, где кровеносные сосуды находятся проникли липиды и лейкоциты, которые определяют формирование атеросклеротических бляшек. Большинство острых сердечных событий связаны с тромботических вследствие разрыва зубного налета. Мемориальные доски подвержены разрыву определяются «уязвимых» и характеризуются увеличение проникновения провоспалительных лейкоцитов, некротические ядра и тонким волокнистым Кап². В последние десятилетия клинических и экспериментальных исследований уточнили комплекс Патофизиология болезни. Несколько животных моделей используются для изучения молекулярных механизмов, участвующих в индукции атеросклероза³. В настоящее время мышь является наиболее часто используемых видов для изучения атеросклероза, несмотря на некоторые конкретные виды различий, существующих в патофизиологии по сравнению с людьми. В частности циркулирующих холестерина главным образом состоит из высокоплотного липопротеинов (с антиатерогенными свойствами) в моделях мыши, в то время как в организме человека холестерина циркулирующих транспортируется главным образом как липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), вероятно Представляя Главная причина, почему мышах одичал типа не развиваются спонтанное атеросклероза⁴. Кроме того мышей дикого типа обычно устойчивы к поглощая холестерин из рациона, в то время как люди поглощают около 50% диетического холестерина⁴. Чтобы преодолеть эти ограничения, были созданы несколько моделей генетически модифицированные мыши. Аполипопротеин E – дефицит мышь (ароЕ^−/−) и ЛПНП рецепторов – дефицит мышь (LDLr^−/−) широко используются. На высокой жирностью высокий холестерин диета мышей^{− −/}ароЕ развивать налета более быстрыми темпами по сравнению с мышей⁻LDLr^−/, и по этой причине, использование ароЕ мышей^{− −/} более широко, чем у LDLr^/−−мышей^5,6. Мышей^{− −/}ароЕ развиться поражения на любой стадии атеросклероза и сопоставимы с теми, которые наблюдались в организме человека, хотя мыши бляшек не показывать нестабильной фенотип⁷. Как правило мышей^{− −/}ароЕ спонтанно развитие атеросклероза и ускорить этот процесс с западной диете³. Тяжесть атеросклероза может оцениваться на уровне сонных, тромбоэмболии, бедренных и плечеголовной артерии и корня аорты⁶. В частности корня аорты представляет анатомические сайт, склонны к развитию атеросклеротических поражений у мышей. По этой причине это обычная практика для оценки формирования атеросклеротических бляшек в этом регионе.

Несколько исследований показали, что альдостерон замешан в развитии атеросклероза^8,9,10. Настой альдостерона в ароЕ^−/− мышей кормили атерогенные диета ускоряет развитие корня аорты атеросклеротических поражений, вызывая воспаление и липидов богатых налета формирования¹⁰.

В целом мы описываем протокол, включая альдостерона инфузии, атерогенные диета питание, встраивание тканей сердца, количественной оценки и характеристики атеросклеротических поражений в ароЕ^{- / -} мышей. Эта процедура способствует эффективное формирование воспаленной, липидов богатых атеросклеротических бляшек и представляет собой ценный модель для изучения атерогенеза.

протокол

Исследование было одобрено итальянских национальных институтов здравоохранения и использования комитетов, авторизация номер 493/2016-PR. Все процедуры были проведены с требованиями Европейского сообщества для использования экспериментальных животных (Европейская директива, 2010/63/ЕС).

Примечание: Подкожной имплантации осмотические minipump, содержащих транспортное средство (этанола в физиологический раствор) или альдостерона (240 мкг кг^-1 · d^-1) в неделю 8-10-старых самцов мышей, недостаточно для гена ароЕ . В общем, 8-10 недели-старых самцов мышей^−/− ароЕ весят около 25-26 g.

1. растворение альдостерона

1. Растворяют 5 мг порошка альдостерона в 1 мл абсолютного этанола.
2. 56.7 мкл альдостерона (растворимые в этиловом спирте) до 68,3 мкл физраствора с целью получения концентрации 2,27 мкг / мкл. заполнить весь осмотического minipumps полностью с 125 мкл этого решения (максимальная вместимость каждого minipump-125 мкл).
3. Использовать скорость потока minipump 0.11 мкл/ч; Таким образом освобождается 2.64 мкл раствора каждые 24 ч. дать каждой мыши вокруг 6 мкг · d^-1 альдостерона на 28 дней.

2. осмотический насос наполнения и имплантации

Примечание: Насосы поставляются в двух отдельных частей: основной части насоса и регулятор потока.

1. Заполните и обрабатывать minipumps, используя хирургические перчатки.
   Примечание: Кожу масла могут мешать выполнению minipumps. Следующие шаги должны выполняться в стерильных Ламинарный шкаф.
2. Придаем наполняющей трубки (поставляется с minipumps) 1 мл шприц и составить альдостерона решения или транспортного средства.
   Примечание: Важно избежать давая воздух внутри шприца при аспирационных решения от трубки для предотвращения образования воздушных пузырей в насос.
3. Вставить наполняющей трубки через отверстие в верхней части minipump, до тех пор, пока он может идти не далее (Рисунок 1A-1В). Медленно заполните насос с альдостерона или транспортного средства. Обратите внимание на темные тени внутри насоса, указывающее уровень жидкости. Смотрите это повышение уровня наряду с заполнения насоса.
   1. Остановите заполнение насоса, когда поднимается шарик жидкость из корпуса насоса.
4. Осторожно удалите наполняющей трубки и вставить регулятор потока в тело minipump (рис. 1 c). Убедитесь, что регулятор сидит плотно против корпуса насоса. Оставьте заполненные осмотических насосов в стакан, содержащие стерильным физиологическим раствором при 37 ° C до 24 ч до имплантации в мышь (грунтовки процедура).
5. Проведение операции в обрабатываемой области с 70% этанола, что способствует асептики.
6. Применяют 1-3 капли на сайте разрез бупивакаин 0,25% и анестезировать животное с 3% изофлюрановая. Включите поставки газа и расходомера для 500-1000 мл/мин место животного в зале индукции и уплотнение верхней. Включите испарителем до 5% изофлюрановая и контролировать мышь до лежа.
   1. Переключение системы на ураном. Удаление животное из камеры и позиции в ураном. В 2-3 минуты мышь начинает будить. Перезапустите газового потока с расходомером на 100-200 мл/мин и испарителем в 3% изофлюрановая.
   2. Обеспечение адекватной глубины анестезии перед выполнением процедуры тестирования педали вывода и глазной рефлексов. Контролировать дыхание и ответ на стимуляции во время процедуры и при необходимости измените испарителем.
   3. Защищайте роговицы от высыхания, применяя глазная мазь.
7. Подготовьте животного, удаление волос с хирургической сайта с помощью бритвы (рис. 1 d). Обычный сайт для подкожной имплантации насосов — на задней.
8. Подготовьте Хирургический сайт с нетканых площадку материал, насыщенный, с 70% изопропиловый спирт.
9. Использование чистой и посвященный пространства (вылечить с 70% этиловом спирте) и покрыта стерильной пелерина. Место кончике инструментов в стеклянный шарик стерилизатор. Начать операцию с стерилизовать инструменты и обрабатывать документы асептически.
10. Используйте Ножницы хирургические сделать 0,8-1 см разрез (около 2 см вблизи хвост), как показано в мультфильмов 1E-1F. Поддерживайте стерильность, не касаясь ничего вне хирургического выделенного пространства с стерильных перчаток или советы инструментов.
11. Позаботьтесь, чтобы вырезать только кожи, но не основной ткани. Использование одной стороны провести щипцы для открытия разрез. Используйте другой стороны провести троакара распространить кожи для того, чтобы создать карман для насоса от задней вверх на лопатки (на правой или левой стороне мыши).
12. Вставьте насос в разрез. Аккуратно задвиньте насоса в карман (Рисунок 1 H). Там должно быть достаточно кожи, чтобы закрыть рану не напряженности или растяжения кожи необходимы. После вставки насос шовные разрез с хирургии проволока (полиглактин 910 с швом размер 6-0)
    Примечание: Глава регулятор должен быть ориентирована на передней части мыши (рис. 1 g).
13. Применять повидон/йод 10% мази с чистым тампоном (Рисунок 1I) и держать животное на потепление сцене. Не оставляйте мышей в автоматическом режиме, до тех пор, пока они восстановить грудной recumbency. Оценить состояние гидратации и администрировать 0,5 мл 0,9% физиологического раствора подкожно, в случае необходимости. Вернуть животное его обычного жилья.
14. Следуйте институциональных руководящих принципов для документации (например, заполнить форму хирургические с оперативной и послеоперационные информации, обновление Кейдж карта с процедуры и дата) и обеспечивают анальгетиков (бупренорфина, 0,05 мг/кг), чтобы уменьшить послеоперационный боли и антибиотики (Энрофлоксацин 85 мг/кг) чтобы избежать хирургической инфекции.
    1. Продолжать ежедневный мониторинг и изучение признаков боли. Обратите внимание, что рана полностью закрыт и minipump поддерживается в подкожной карман. Рана может открыть и мышь может потерять minipump.

3. рассечение сердца

1. В то время жертвоприношения, anestethize мышей с 80-100 мг/кг Zoletil ведении внутримышечно. Zoletil вызывает глубокий наркоз. Примечание: Убедитесь, что мышь на адекватной глубины анестезии перед выполнением процедуры тестирования на педаль и глазной рефлексов; мышь будет увлажненную хотя глубоко под наркозом. Откройте грудной полости, используя ножницы, щипцы, путем разрезания ребра боков к грудине, с грудины, убирается сторону головы.
2. Тяжести перфузии системы с 10-15 мл ледяной Дульбекко фосфат буфер солевой раствор (PBS), а затем с 40-50 мл 10% нейтрального формалина буферизации исправить сосудистую perfuse мыши через левого желудочка. Фиксация обозначается когда мышей экспонат энергичные мышечных сокращений и стать жестким.
   Примечание: Процесс фиксации занимает место в 10-20 мин. Это позволяет использовать фиксированный органов и тканей для выполнения иммунофлюоресценции или иммуногистохимия анализы. Важно отметить, что такой фиксированной тканей не может использоваться для экспрессии генов и западных blotting анализов.
3. Отделить сердце от аорты, держа сердце с щипцами и резать с ножницами или лезвие скальпеля, перпендикулярно к оси аорты, как можно ближе к сердцу без причинения ущерба (рисунок 2A). Используйте лезвие скальпеля резать поперек вдоль прямой линии, соединяющей точки нижнего правого и левого предсердия (рис. 2B).
4. Заполнить верхнюю часть секционного сердца (через полость сердца) с оптимального раскроя соединений (OCT) (Рисунок 2D-2E). Положите ткань в пределах cryosection пластмасс с осью аорты, помещены перпендикулярно к основанию прямоугольной формы и крышка с октября (Рисунок 2F). Там должно быть без воздушный пузырь ловушку. Если любой пузырь отсутствует, попробуйте сместить его к краю.
5. Установите металлическую пластину на сухой лед и затем тщательно надел плесень (рис. 2 g). Когда OCT становится белым, оберните прессформы с серебряной фольгой и затем хранить – 80 ° c.

4. режущие части корня аорты

1. Установите машину криостата до 20 ° с. Перед выполнением резки, место встроенных ткани и оставить его там на около 15 минут, чтобы приспособиться к этой температуры. Установите температуру держатель образца-17 ° c (рис. 3A).
2. Поместите Замороженное сердце блок внутри машины криостата сбалансировать температуры блока к тому из криостата (рис. 3B) и вывезти Замороженное сердце блока от плесени (рис. 3 c). Отрежьте избыток октября из замороженного блока лучше адаптировать блок размеры для держателя образца (рис. 3D).
3. Смонтировать Замороженное сердце блок на держатель образца с желудочковой наружу (Рисунок 3E-3I) и вставьте держатель образца образца ориентация голову (Рисунок 3J). Отрегулируйте ориентацию держателя образца, чтобы режущий блок для того чтобы сделать корня аорты перпендикулярно лезвия (рис. 3 K).
4. Вырезать блок и отбросить ломтиками, вплоть до корня аорты (рис. 3 L-3N). Собирать последовательные секции и разместить их на стеклянных вставках (Рисунок 3O). Контролировать корня аорты анатомический профиль под микроскопом, пока не появятся все 3 аортального клапана (рис. 3 P-3Q).
5. Собирать разделы 10 мкм/раздел O красный нефти и Picro Сириус красного окрашивания и 6 мкм/раздел для MAC3 окраски (Рисунок 3R). Собирать вокруг слайды 6-8 (для каждого сердца) до один из трех клапанов исчезает или больше не является неизменным.

5. иммуногистохимии

Примечание: Все окрашивание шаги, сообщили в следующие протоколы выполняются в стеклянных Coplin окрашивание банок.

1. Нефтяные пятна красные O для нейтральных жиров
   1. Исправить разделы в 70 мл 37% формальдегида для 5 минут мыть хорошо в водопроводной воде и Помарки избыток воды.
   2. Разбавить 48 мл масла красный O (0,5% изопропиловый спирт) в 32 мл дистиллированной воды для получения масла красный O 0,3%.
   3. Пятно разделы в 70 мл масла красный O 0.3% за 10 мин мыть секций в водопроводной воды за 10 мин.
   4. Пятно на 1 мин в 70 мл гематоксилином Мейера. Вымойте секций в проточной воде в течение 1 мин.
   5. Погружайте разделы в 70 мл 0,5% лития карбоната. Промыть в проточной воде в течение 1 мин.
   6. Смонтируйте разделы с водной монтажа средних и захвата изображения, с помощью цифровой камеры, установленной на световой микроскоп.
2. Picro Sirius красное пятно на коллаген
   1. Вырезать 10 мкм Замороженные разделы и смонтировать в нижней части слайда.
   2. Исправьте разделы в 70 мл ацетона для 5 мин, воздух сухой и промыть кратко в дистиллированной воде.
   3. Место разделы в 70 мл 0,2% phosphomolybdic кислоты для 5 минут промыть кратко в дистиллированной воде.
   4. Место разделы в 70 мл 0,1% раствора Picro Сириус для 90 минут промыть один раз с 70 мл 0,01 N HCl. отменить решение.
   5. Место в 70 мл 0,01 N HCl на 2 мин полоскания кратко в дистиллированной воде. Сухой воздух.
   6. Место кратко в 70 мл, этанол 70%.
   7. Когда полностью высохнет, место в 70 мл очистки агента терпеновые происхождения и смонтировать разделы, с помощью поли (бутил метакрилат -co-метилметакрилат) на основе монтажа средних и захвата изображения с помощью цифровой камеры, установленной на световой микроскоп.
      Примечание: Одним из преимуществ Picro Сириус красного окрашивания является, что это позволяет отличить тип I (толщиной волокон, желто-оранжевый двулучепреломления) и тип III (тонких волокон, зеленый двулучепреломления) коллагеновые волокна сетей поляризованной световой микроскопии¹¹ .
3. Mac3 пятно для макрофагов пятнать
   1. Вырезать 6 мкм Замороженные разделы и смонтировать в нижней части слайда.
   2. Исправьте разделы в 70 мл холодного ацетона для 5 минут погрузиться в 70 мл PBS на 2 мин.
   3. С помощью пипетки, крышка секции с 1% натрия Додециловый сульфат (SDS) решение и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре (RT) для извлечения антигена. Погрузитесь в 70 мл PBS на 5 мин.
   4. С помощью пипетки, покрывают ломтики с перекисью водорода 0,3% на 20 мин мыть в 70 мл PBS 3 раза за 5 мин.
   5. Используйте авидин-биотин комплексы (ABC)-Комплект HRP для следующих шагов.
   6. С помощью пипетки, блокировать разделы в сыворотке нормальный кролика при комнатной температуре в течение 20 мин. Не смывать.
   7. Пятно с MAC3 (1: 300) за 90 минут на RT. мыть в 70 мл ФСБ 3 раза за 5 мин.
   8. Пятно с средней биотинилированным анти крыса IgG (1: 200) 45 мин на RT. полоскания с 70 мл PBS 3 раза за 5 мин.
   9. Охватывают разделы с ABC IgG кролика для 30 мин на RT. полоскания с 30 мл PBS 3 раза за 5 мин.
   10. Крышка секции с 3-амино-9-ethylcarbazole (АЭС) для 10 минут промыть с 70 мл дистиллированной воды в 10 раз.
   11. Пятно на 1 мин в 70 мл гематоксилином Мейера. Вымойте секций в проточной воде в течение 1 мин.
   12. Погружать секций в 70 мл 0,5% карбонат лития. Промыть в проточной воде в течение 1 мин.
   13. Смонтируйте разделы с водной монтажа средних и захвата изображения, с помощью цифровой камеры, установленной на световой микроскоп.

6. изображения анализ атеросклеротических поражений в разделах корня аорты

Примечание: Разделы корня аорты, окрашенных с O Красного масла или MAC3 или антитело интереса могут быть проанализированы с использованием соответствующего программного обеспечения (указанные в Таблице материалов). Общее число пикселей, окрашивание позитивные для компонента интерес нормируется в общую область зубного налета. Изображения были собраны и проанализированы следователем ослепил лечения.

1. Калибровка
   1. Откройте программное обеспечение, а затем выберите изображение (в jpg) для анализа.
   2. Выберите Главная | Создать | Быстрая калибровка.
   3. Настройка калибровки изображения путем рисования линии вдоль панели масштаб изображения.
   4. Сохраните настройки калибровки.
2. Анализ изображений
   1. Параметры меню выберите сохраненные установки калибровки | Пространственной калибровке вариант.
   2. Выберите калибровка | Применяются.
   3. Выберите инструмент «Многоугольник» в меню выбора и рисовать по периметру вдоль всех атеросклеротических поражений.
   4. Выберите Размер фото | Типы. В меню добавьте области и Процентов.
   5. Меню/Размер выберите руководство и новое окно откроется.
   6. В этом окне нажмите на инструмент выбора цвета на изображении и выберите режим HSI .
   7. Курсора мыши на позитивные пикселей маркера интерес для создания диапазона цветов.
   8. Нажмите на фото , и значение Sum, наблюдается в Таблице измерения, указывает процент области маркера (также выражается в мкм²) отношении Общая площадь атеросклеротических поражений.

Результаты

В 8-10 недель АПО^{- / -} мышей, чтобы наполнить с транспортного средства или альдостерона были имплантированы minipumps (Рисунок 1E-1I) и откармливаются атерогенные (скорректированные калорий диета 42% от жира) за 4 недели. В конце лечения мышей были ум...

Обсуждение

Атеросклероз является хроническим воспалительным расстройства, связанные с крупных и средних судов с участием взаимодействий между несколькими типами клеток, такие как макрофаги, Т-лимфоциты, эндотелиальные клетки и гладкомышечные клетки¹. Несмотря на ограничения мышин?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted calories diet (42 % from fat)	Envigo	TD.88137	atherogenic diet
Osmotic minipump with filling tube	Alzet	model 1004	for continous realase
Aldosterone	SIGMA	A9477	hormone
Ethanol	SIGMA	34852-M	solvent
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol	Kendal Webcol	6818	Disinfectant
Surgery wire (Vicryl 6.0)	Demas	500004	surgery
10% Povidone/iodine ointment	Aplicare-Meriden	52380-0026-1	Antiseptic
Formalin 10%	SIGMA	HT5012	to fix vascolature
Cryomold	Bio-Optica	07-MP1515	for embedding
O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	for embedding
Cryostat	Leica	CM1900	instrument for sectioning
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline	Aurogene	AU-L0615-500	buffer solution
Adhesion Slides Polysine	VWR	631-0107	microscope glasses
Cover Glasses	Bio-Optica	72015	cover glasses
Formaldehyde 37%	SIGMA	252549	solvent
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol)	SIGMA	O1391	staining solution
Mayer’s Hematoxylin	SIGMA	MHS32	staining solution
Lithium Carbonate	SIGMA	62470	washing buffer
Acqueous Mounting Medium	Thermo Scientific	TA-125-AM	mounting solution
Acetone	SIGMA	179124	solvent
Phosphomolybdic acid solution	SIGMA	HT153	for hystology
Direct Red 80 (Picrosirius Red)	SIGMA	365548	staining solution
Bio Clear (clearing agent of terpene origin)	Bio-Optica	06-1782D	product for the preparation of histological samples
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	SIGMA	3989	mounting solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fluka	71725	powder
Hydrogen Peroxide solution (30 %)	SIGMA	H1009	solution
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG ,	Vector Laboratories	PK-6100	staining solution
3-amino-9-ethylcarbazole	Vector Laboratories	SK-4200	staining solution
Mac3 antibody	BD Biosciences	553322	antibody
ImagePro Premier 9	Media Cybernetics	050910000-2534	software to analyze images