通过 iscat 显微镜对活细胞分泌的单一蛋白质进行无标签成像

摘要

我们提出了一种实时光学检测单个未标记蛋白质的协议, 因为它们是从活细胞分泌的。这是基于干涉散射 (iscat) 显微镜, 可应用于各种不同的生物系统和配置。

摘要

我们展示了干涉散射 (iscat) 显微镜, 这是一种能够实时检测单个活细胞分泌的单个未标记蛋白质的方法。在该协议中, 我们涵盖了实现 iscat 显微镜的基本步骤, 并以额外的成像通道对其进行补充, 以监测正在研究的细胞的生存能力。接下来, 我们使用的方法, 实时检测单个蛋白质, 因为他们是从一个活细胞分泌, 我们演示与不朽的 b 细胞系 (laz388)。讨论了显微镜和样品制备以及记录数据分析的必要步骤。视频协议表明, iscat 显微镜为研究单分子水平的分泌物提供了一种简单的方法。

引言

分泌的蛋白质在各种生理过程中起着重要作用¹。正因为如此, 它们通常作为一个集体组合 (蛋白质组学) 或作为单个实体^2,3进行研究。蛋白质组学传统上通过酶联免疫吸附法 ( elisa )、流式细胞仪或质谱^4,5、 ⁶。另一方面, 单一蛋白质通常使用基于荧光^7、8、等离子体 9^、10或低温电子^{11 的}各种技术来检测显微镜。所有这些技术都使用复杂的仪器、标签或两者兼而有之, 并且通常缺乏动态信息, 因为它们只提供有关所研究系统的长期信息。

在这里, 我们使用 iscat^12,13显微镜来检测单个分泌蛋白与亚秒时间^{分辨率 14}。重要的是, 该技术检测每个蛋白质^12,14所固有的微弱分散信号。小生物的光的数量随其极化性而扩展。假设蛋白质的形状可以用一个有效的散射球体^14,15,16近似, 并且不同的蛋白质具有非常相似的折射率, 测量的信号可以直接连接到蛋白质的分子量 (mw)。通过参考测量对 iscat 对比度与分子量进行经验校准, 可以区分不同大小的蛋白质。iscat 实验可以很容易地得到荧光显微镜^17、18、免疫吸附试剂以及荧光或散射标签的补充, 以便对任何感兴趣的蛋白质进行特定检测^14,17,19岁

原则上, iscat 的功能是通过与二次参考波的干涉混合来放大蛋白质的弱散射光。在 iscat 显微镜中检测到的强度 () 由

入射强度在哪里, 是参考波贡献的系数, 表示所研究的纳米物体的散射强度, 是散射与参量之间的相移波¹⁴。传输的入射光或反向反射的入射光通常用作参考波, 在每一种情况下分别考虑样品室的透射率或反射率。这个术语与蛋白质的散射截面成正比, 与交叉项相比可以忽略。因此, 在设置完全破坏性干扰时, 检测到的光是由参考强度和干扰强度给出的。

iscat 显微镜为研究单分子水平的生物过程提供了一种很好的方法。例如, 我们研究了 laz388 细胞--epstein-barr 病毒 (ebv) 转化为 b 淋巴细胞^{系 20,21} --因为它们分泌蛋白质, 如 igg 抗体¹⁶。然而, 这种方法是通用的, 可以应用于各种其他生物系统。iscat 本质上是不具体的, 可以检测任何蛋白质或纳米颗粒, 或者它可以扩展与一般的表面功能化方法, 用于特定或多路复用检测。它的简单性和与荧光显微镜等其他光学技术相结合的能力, 使 iscat 成为细胞生物学中一个有价值的补充工具。

研究方案

注意: 在使用任何化学品之前, 请阅读所有相关材料安全数据表 (msds), 遵守所有适当的安全措施, 并根据需要佩戴个人防护设备 (激光安全护目镜、护目镜、手套、实验室外套)。

1. 构建 iscat 显微镜^16、18

注: isccat 显微镜通常由改进后的倒置显微镜装置组成。简而言之, 激光聚焦在高数值孔径 (na) 目标的后焦平面上, 并使用成像透镜将粒子的后散射光聚焦到相机芯片上。一般来说, 这种广域显微镜可以从零开始制造, 也可以建立在现有倒置显微镜的基础上。此协议涵盖了实现设置的基本步骤, 同时可以更改使用的硬件。在 arroyo 等人的工作中可以找到关于 iscat 显微镜组装的更详细的描述.^18岁

注意: iscat 显微镜涉及 iib 类激光光源。在组装和对齐显微镜光学时, 需要适当的眼睛保护。在显微镜组装过程中, 请确保激光束路径保持直, 并且不会在添加新的光学元件时偏转。

1. 设置显微镜的照明路径。
   1. 使用阻尼光学表和硬质金属块, 构建一个显微镜样品阶段¹⁸ , 其中包含一个高数值孔径 (na) 目标 (100x/1.46 na) 和一个翻译单元, 允许横向样品翻译和焦距的变化的目标位置。
      注: 在检测单个蛋白质的极限下操作 iscat 显微镜极易受到外部振动的影响。建议采用支持从各方面支持样品的中心对称压电级, 以限制样品的声学激发, 否则会损害焦和侧向稳定性。图 1显示了一个合适的示例阶段, 包括压电转换单元和目标。此外, 建议对以下步骤中讨论的所有光学元件使用大量稳定的安装。这些组件可随时从商业光学供应商处获得。
   2. 使用50厘米焦距单面透镜 (广域透镜) 和 45° (垂直) 耦合镜将波长 445 nm 的二极管激光器的光聚焦到目标的后焦距平面上。这将在目标的正向聚焦处创建一个准直光束, 并将成为 iscat 照明源。如有必要, 可在50厘米镜头前, 通过30μm 针孔或单模光纤对激光进行空间过滤。
   3. 在目标上涂上一滴浸入式油, 并在显微镜阶段的样品平面上放置玻璃覆盖片。这将导致光束通过成像目标反射下来。
      注: 反射产生于样品盖板上部表面的空气玻璃界面, 并将作为 iscat 参考光束的基础。覆盖图表面的残留污垢或灰尘会产生散射点源, 这有助于在接下来的步骤中正确聚焦成像目标。
      注意: 大部分激光通过覆盖滑移传输, 并直接从目标向上传播。将不透明的镜面扩散器 (例如, 纸卡) 放置在盖板上方, 以最大限度地降低激光受伤的风险。

图1:iscat 样本阶段.照片显示了安装压电翻译单元 (黑色) 的巨大铝块以及居中的100x 目标。3轴压电级允许在目标的焦平面上精确定位样品。粗聚焦是通过旋转安装目标的螺纹管进行的 (未描述)。该块位于光学台上, 在45°耦合镜上方有四个钢座。请点击这里查看此图的较大版本.

2. 设置显微镜的成像路径。
   1. 在相对于入射光束的45°角和广域透镜后约10厘米的角度引入反反射 (ar) 涂层分束器 (70% 反射, 30% 传输)。将 ar 涂层指向激光源。这传递入射光束, 并反映参考和散射光束在90°角的入射光束。
      注: 建议使用光束拆分立方体或未涂布平面分束器时, 会产生显著的鬼影和条纹效应。有关详细信息, 请参阅讨论.如果需要, 从分束器背面产生的任何不需要的反射光束都可能通过使用虹膜膜片来阻塞。
   2. 厚光束分离器将引入显著的光束位移, 使激光可能不再进入目标直线。如有必要, 请在分束器之前重新调整激光束路径, 以确保通过目标进行正确的传播。
      注: 在放置宽场透镜和显微镜舞台之前 (在1.1.2 的步骤中), 也可以添加光束分离器, 以便以后不会移位光束。
   3. 此时, 聚焦干涉仪的成像臂, 并确保样品平面和摄像机是副聚焦的。将凹面 f =-45 厘米的镜头放置在入射光束路径的广域透镜之后的位置5厘米处。这将导致准直光束进入目标的后光圈。
   4. 将屏幕放置在干涉仪的反射臂上, 沿垂直方向移动目标以找到粗糙的焦距位置。当击中屏幕的光束被准直时, 目标是对焦的。
      注:图 2显示了此过程的示意图。
   5. 完成粗对焦时, 卸下 f =-45 厘米的镜头和屏幕。
      注: 而不是使用负焦距镜头, 广域镜头本身可以放置在一个可移动的安装和移动出光束路径, 为这一步。但是, 为了实现最稳定的显微镜配置, 建议将广域镜头固定在固定位置。
   6. 添加第二个 f = 50 厘米的单面镜头, 以聚焦散射光, 并将反射光准直到 cmos 相机的传感器上。确保镜头放置在距离目标的后焦平面50厘米处, 以便重新准直参考光束并聚焦散射光。
   7. 将 cmos 芯片放置在距离 f = 50 厘米镜头50厘米的地方, 并将光束直接放置在芯片的中间。
      注: 以下参数通常用于成像。激光的输出功率 (波长 445 nm) 设置为 100 mw。针孔和分束器衰减透射光, 使进入目标的有效功率约为9mw。样品位置处的光束直径为6μm。使用旧的成像镜头, 系统的有效放大倍率约为300x。cmos 芯片上的图像大小设置为照明区域内的128x128 像素, 从而产生约 5x5μm²的视场。图 3显示了完全组装的 iscat 显微镜的示意图。

图 2: iscat 显微镜的粗聚焦.原理图显示了光学的排列, 以帮助使系统成为焦点。分束器 (70余 30 bs) 的 ar 涂层背面用红色标记。重要距离以绿色提供。所使用的镜头的焦距 (f) 表示。蓝色虚线框中的组件将 1.2.6-1.2.7 的步骤添加。凹透镜 (用于重新准直收敛 icat 光束), 稍后将移除屏幕。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: isccat 显微镜.示意图显示了完全组装的 iscat 显微镜。分束器 (70余 30 bs) 的 ar 涂层背面用红色标记。重要距离以绿色提供。所使用的镜头的焦距 (f) 表示。请点击这里查看此图的较大版本.

3. 设置其他成像通道。
   注: 本节在显微镜上添加了另一条成像路径, 允许通过光田显微镜观察 iscat 激光周围的大片区域, 并通过荧光显微镜监测细胞活力。
   1. 将 led 光源的输出 (约500纳米 & lt; lt; lt; 580 nm) 放入一个较远的工作距离 20x/0.4 na 目标中, 并在样品室上方安装机械组件, 以便将 led 输出聚焦和横向定位到样品。
      1. 确保 led 的输出谱覆盖细胞死亡标记 (碘化物 (pi)) 的激发范围, 并且不会干扰其荧光 (& gt; 600 nm)。如有必要, 请使用光学滤光片。
   2. 侧向移动上目标, 使上 (广域) 和下 (iscat) 目标是共线的。这是通过将屏幕置于较低的目标下并最大限度地提高屏幕上传输的 led 灯的强度来确定的。放置一个 = 550 nm 短通双色镜 (spdm), 将传输的 led 灯从 iscat 激光路径中分割出来。
   3. 用8% 的反射将这一光束分割成两个通道92% 透射分束器 (bs)。92% 路径是荧光通道, 8% 的路径用于明亮场成像。
   4. 使用 f = 5 厘米无色双片透镜将明亮的场通道成像到 cmos 相机上。
   5. 使用 f = 5 厘米无色双片透镜和 = 600 nm 长通滤波器将荧光通道成像到单独的 cmos 相机上, 以阻挡激发光。图 4a显示了包括所有成像通道在内的完全组装显微镜的示意图。

图 4: iscat 单细胞分泌的蛋白质显微镜。(a)议定书中描述的显微镜示意图。有关详细信息, 请参阅第1节。缩写: led, 发光二极管;spf, 短通滤波器;obj, 目标;spdm, 短通双色镜;bs, 分束器;lpf, 长通滤波器;高炉、明亮场;氟化物, 荧光;c1-c3, 相机1-3。(b)距离 iscat 视场约4μm 的单个 laz388 单元的明亮场图像 (由白色正方形描绘)。由相机 c3 拍摄的图像, 刻度条: 10μm . (c)相同区域的荧光图像, 如 (b) 所示, 细胞的位置以白色圆圈为标记。荧光的缺失表明细胞是可行的。相机 c2 拍摄的图像, 刻度条: 10μm . (d)原始 iscat 相机图像快照, 曝光时间为80μs。相机 c1 拍摄的图像。(e)讨论部分所述时空背景减法后同一区域的 iscat 图像。该图像集成了1000多个连续的原始帧 (d), 最终帧时间为400毫秒, 揭示了玻璃覆盖板的表面粗糙度。(f)相应的差分 iscat 图像, 显示2种蛋白质与覆盖液的结合事件。图像是通过减去两个连续的过滤图像 (e) 来构造的。(d)、(e) 和 (f) 中的刻度条: 1 微米。这一数字是根据麦当劳、m. p. 等人的.¹⁶. 版权所有2018年美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

4. 设置计算机和软件。
   1. 将所有摄像机连接到计算机。安装相应的驱动程序包和 obtain/编写软件以进行控制。
      注: 高速采集需要合适的硬件。至少建议使用多核处理器、16 gb ram、帧采集卡和用于数据存储的固态光盘。
   2. 观察 cmos 相机上的 iscat 图像, 并通过在玻璃覆盖板上找到残留的灰尘或污垢颗粒来确保其处于焦点位置。验证粒子的图像是圆对称点扩散函数 (psf)。
      注: 非圆对称 psf 的主要原因是激光束不进入目标直线, 而是相对于光轴以很小的角度进入。这可以通过使用45°耦合镜调整入射光束的角度和位置来纠正。
   3. 比较明亮场和荧光通道的相机图像。确保两者都处于焦点, 并显示相同的区域。验证 iscat 激光的位置大致位于图像的中心, 并记下其位置以供以后参考。有关典型的相机图像, 请参见图 4b–4f 。
      注: 使用细胞样本或荧光微珠查找两个通道的焦点。暂时去除荧光长通滤光片以调整系统。常规细胞成像的焦点需要略高于 iscat 焦平面。为了在不移动目标的情况下补偿这一点, 请将摄像机从其在两个 f = 5 厘米镜头的焦点上的位置上移开。
   4. 设置必要的相机参数。使用固定的帧速率和禁用软件增益和校正工具。
      注: 使用以下参数: isccat 相机设置为5000帧/秒 (fps), 曝光时间为80μs。如上所述, 图像大小为128x128 像素。明亮场摄像机和荧光摄像机的工作空间均为全帧尺寸 (1280x1024 像素)。明亮的场成像是在20毫秒的曝光时间内进行的。荧光相机设置为750毫秒曝光时间, 并累积5个连续帧, 形成一个最终图像。在固定的20秒时间间隔内获得明亮场和荧光图像。

2. 实验的准备

1. 准备库存显微镜介质。
   1. 在 rpmi 1640 介质的 975 ml 中加入25毫升的 hepes 缓冲液 (1 mol), 得到最终的 1 l 25 mmolhepes 溶液。或者, 使用已包含 hepes 的缓冲介质。
      注: hepes 用于在环境条件下 (例如,在孵化器外, 在没有恒定的 co2 供应_的情况下) 进行测量时保持介质的 ph 值。
   2. 取一个实验所需的解决方案, 让它加热到室温。2毫升的介质就足够了。将剩余库存解决方案保持在4°c。
2. 准备显微镜。
   注: 以下步骤描述了由铝基板和丙烯酸杯组成的定制样品支架的过程, 它们既能修复盖板, 又能将其与压电3d 定位器耦合。还可以使用商业上可获得的带玻璃底部的无菌培养皿。
   注:图 5显示了定制示例支架的照片。
   1. 取一个新的显微镜覆盖, 用去离子水 (di-水) 和乙醇冲洗。用氮气或加压空气吹干滑块。
   2. 在氧气等离子体气氛 (0.3 mbar 气体压力) 中清洁盖板 10分钟, 功率为 500 w rf。这可以去除表面中的所有有机杂质。
   3. 将丙烯酸杯在 0.2 momol naoh 溶液中浸泡约 10分钟, 用 di 水冲洗, 以清洁丙烯酸杯。
   4. 将样品架组装在一起, 用塑料培养皿覆盖, 直到实验中需要为止。

图 5: 自定义生成的示例持有者.(a)样品架组件: (1) 亚克力杯;(2) 铝基板;(3) 固定螺丝;(4) 硅胶 o 形圈;(5) 盖板。(b)完全组装的样品架。请点击这里查看此图的较大版本.

3. 准备好显微镜
   1. 打开 iscat 照明激光器、明亮领域/荧光照明 led、摄像机和采集计算机软件。将激光束阻挡在目标前的位置。
   2. 确保 100 x/1.46 na 目标是干净的。如果没有, 请使用镜片清洁湿巾和乙醇来按照制造商的准则进行清洁。
   3. 在显微镜目标上涂一滴浸油。
   4. 取样品支架 (在第2.2 节组装), 并仔细地将其安装在 iscat 显微镜的压电阶段, 使样品覆盖片以显微镜目标为中心。要细心和小心, 以免损坏的物镜。用拇指螺钉将设备固定在压电定位器上, 同时确保不超过制造商指定的最大扭矩。
   5. 在试剂盒中加入1毫升的股票显微镜介质 (在第2.1 节中制备)。
   6. 在培养基中加入2滴碘化丙酸假, 作为细胞死亡标记^16,22。
   7. 解锁激光并使系统对焦。首先, 通过重复步骤1.2.3 来验证目标是否与盖板的距离正确。-1.2.5。(图 2)。然后, 微调焦点与压电阶段的 z 轴。
   8. 确认光源、相机和软件的所有设置都设置正确。这包括激光功率、led 强度、相机帧速率、相机曝光时间或软件保存路径等参数。
      注: 以较高的帧速率保存视频可能会产生较大的文件大小。确保计算机上有足够的可用磁盘空间。
   9. 再次阻止激光束。显微镜现在已经准备好进行实验了。
4. 准备好细胞
   注: laz388 细胞²⁰在 rpmi 1640 培养基中培养, 辅以10% 的胎儿小牛血清 (fcs)、氨基酸、丙酮酸和抗生素。细胞在37°c 和 5% co 2 下孵育, 每 2-3天^{23 分培养}一次新鲜培养基。
   1. 从孵化器中提取细胞培养瓶, 并吸入含有约 1 x^{10 6 细胞}的培养基。要确定正确的体积, 请使用血细胞计量化细胞培养的浓度。
   2. 将电池溶液与 rpmi 1640 介质在室温下的10毫升混合, 并以 300 x g 离心样品7分钟。
   3. 小心提取和丢弃上清液, 同时确保浓缩细胞的颗粒不受干扰。
   4. 重复步骤2.4.2。-2.4.3。与细胞的浓缩颗粒。
   5. 在 0.5 ml 库存显微镜介质中重新悬浮细胞 (在第2.1 节中制备), 并立即在实验中使用它们。

3. 分泌细胞的 iscat 显微镜

1. 确保激光束被阻塞, 以防止细胞直接暴露在 iscat 激光下。
2. 将单元格注入样本杯中。
   1. 将细胞样品的大约 3μl (在第2.4 节中制备) 稍微向中心向样品立方体中注入。轻轻触摸移液器尖端到盖板上, 慢慢地注入细胞溶液。让牢房在被单上安顿下来。
      注: 使用小体积移液器吸头 (10μl) 或长, 灵活的凝胶加载吸头。
   2. 确保细胞密度低于每500μm²约1个细胞, 以便单细胞测量不受 iscat 激光周围区域多个单元的影响。
   3. 如果单元格数太低, 请重复步骤3.2.1。直到有足够的数字。
   4. 如果细胞的覆盖密度过高, 请使用注射大约20μl 的附加显微镜介质, 将细胞分散到覆盖物上。
3. 使用压电定位器, 侧向移动样品, 将电池靠近 iscat 视场 (约 10μm)。确保细胞不进入 iscat 视场, 因为直接照射 445 nm 激光可能对细胞有害。
4. 使用明亮的场和荧光图像来定位和验证细胞的活力²⁵。
   注: 一个可行的细胞在明亮的场图像中具有圆形, 而不是荧光, 而细胞死亡是由细胞22内存在的强荧光信号表示的.
5. 解锁 iscat 激光束, 并确保覆盖滑移表面仍处于焦点位置。封闭隔离台, 最大限度地减少与周围环境的漂移和声学耦合。
   注: 后者是完成与沉重的光学窗帘或丙烯酸面板周围的光学工作台。
6. 通过从 iscat、光田相机和荧光摄像机获取图像来开始测量。通过软件实现流程自动化和控制, 最大限度地提高实验效率。定期检查细胞的活力和系统的重点。
   注: 根据相机的激光强度、光学元件和曝光时间设置, iscat 激光可能会干扰荧光相机。如果观察到这种行为, 请考虑在荧光图像采集过程中暂时关闭 iscat 激光。

4. 数据分析

注: 实验数据本质上是嘈杂的, iscat 图像也没有什么不同。在典型的 iscat 测量中, 有多种噪声源, 包括入射光源中的波前失真、盖板的表面粗糙度和相机噪声。下一节介绍了通过后处理来纠正这些噪声源的一些方法。此外, 设置的横向机械不稳定性会导致嘈杂的数据, 必须相应地解决, 如下面的讨论部分所述。所描述的分析是使用自定义 matlab 脚本执行的。

1. 通过使用不排除高空间频率的二维傅立叶滤波器过滤原始数据, 最大限度地降低相机噪音。需要调整滤清器的大小以适应特定的实验配置 (主要由系统的数值孔径决定)。
   注: 空间频率高于光学系统的图像中的特征来自外部来源 (如摄像机读出噪声), 可以忽略。
2. 将原始相机计数中的图像转换为 iscat 对比度。
   注: 摄像机检测到的信号是 。iscat 对比度的定义是参考光的强度在哪里, 在这种情况下, 覆盖滑移反射的部分, 以及之间的干扰和散射强度 ()。
   1. 将信号分离到不存在感兴趣粒子的特定帧的时间平均值中并通过计算。生成的图像提供参考信号 。
      注: 或者, 可以按照下面的讨论中所述执行活动背景减法步骤。
   2. 根据 ^12、14、16计算对比度。
3. 通过从后续帧中减去每个连续帧来创建滚动差分图像。
   注: 在此步骤中, 由于覆盖线表面粗糙度和波前畸变的残余信号在连续帧内是恒定的, 因此可以有效地去除这些信号。滚动差分消除了这些残余信号, 只留下从一个帧到下一个帧的蛋白质绑定。这种动态背景减法是有益的, 因为它对长期样品漂移不敏感。
4. 应用寻峰算法来检测和索引每个帧的单个粒子, 并确定它们的特定对比度和位置。
5. 使用步骤4.4 中收集的信息创建蛋白质结合事件的直方图, 并通过从已知蛋白质样本^{14、24 编译}的校准曲线将其提取的对比与蛋白质质量^联系起来。

结果

imscat 显微镜的示意图如图 4a所示。图 4b、4b 和4b 分别显示了代表性的明亮场、荧光和原始iscat 图像. 图 4e和4e显示了背景去除和差异后处理的结果;在图4f 中, 两种吸附蛋白是可见的衍射有限点。图 6显示了125秒期间检测到的蛋白质的直方图。这些数据是通过对捕获的图像应用寻峰算法来计算绑定事件并对其对比进行分类^的16。共检测到503种蛋白质。

接下来, 通过与对纯化蛋白质溶液进行的参考测量进行比较, 或通过与功能化玻璃表面 14^,16进行的额外测量, 确定分泌物种。因此, iscat 数据可直接显示亚秒尺度16上的细胞分泌动力学.例如, 我们之前发现 igg 抗体是 laz388 分泌物的主要部分, 以每秒约100个分子16的速度从细胞中释放.此外, 其他粒子的范围为 100 k–1000 kda 的细胞16分泌.所描述的方法可以进一步使用, 例如,研究^细胞16 周围分泌物的空间浓度梯度, 或确定细胞裂解¹⁶的时间动态。

图 6: 由单个 laz388 细胞对分泌的蛋白质进行定量.直方图显示在125秒的时间段内检测到的蛋白质, 对比度值积累在 1 x^10-4对比箱 (蓝条) 中。在此测量过程中, 共计算了503单个蛋白质。实验重复了 1 0次, 结果相似。这一数字是根据麦当劳、m. p. 等人的.¹⁶. 版权所有2018年美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

获得有用的 iscat 数据的最关键的一个方面是能够在覆盖层表面找到正确的焦点位置, 此外, 还能够长时间保持这一位置。如果做不到这一点, 就会导致 psf 扩大, iscat 信号变弱, 动态分析中与漂移相关的伪影。事实证明, 在干净、裸露的盖板表面上找到焦面并不是一件容易的事情, 因为在大参考光束背景下看不到表面特征 (见图 4d)。

原始的 iscat 图像通常被激发源中的波前杂质产生的背景信号所掩盖, 并可能阻碍一个人找到正确成像平面的能力。主动波前减法是一种有用的方法来规避此问题, 并随后在测量¹⁶期间监视 iscat 焦点。实现此目的的一种方法是通过空间采样调制。简而言之, 函数发生器将 50 hz 方波应用于压电级的外部控制端口, 从而在应用频率 (290 nm 振幅) 处进行空间采样调制。同步摄像机采集是从同一来源触发的, 如果通过锁定原理组合, 会产生波前补偿图像^14,16。生成的图像通常显示盖板的表面粗糙度 (图 4e)。清洁后玻璃上剩余的小特征可用于使显微镜聚焦。此活动背景减法步骤所使用的参数可以根据帧速率、曝光时间或硬件进行更改。

如上所述, 建议在 iscat 设置 (步骤 1.2.1) 中使用高质量的光束拆分器, 因为成像的人工制品, 如由薄薄的平面光束拆分器产生的鬼影或干扰, 会影响图像并干扰测量。图 7显示了高质量和低质量分束器之间的比较。这两个原始的 iscat 图像都显示了包含一些残余颗粒的覆盖物上的相同区域。使用相同的 iscat 设置来捕获这两个图像, 只交换了分束器。图 7a显示了使用较厚 (5 毫米)、ar 涂层和楔形分束器在相机上形成的图像。由于楔形设计, 分束器后表面的反射光束与前表面产生的反射是反平行的, 没有进入目标。不发生干扰文物。图 7b显示了样品上的相同视场, 但这次使用了较薄的平面分束器。从分束器的前表面和后表面反射的两个反射是平行的, 并传播到相机。干涉文物是显而易见的。

图 7: 使用高质量和低质量分束器生成的 iscat 图像的比较.(a)使用5毫米厚、ar 涂层和楔形分束器生成的原始 iscat 图像。(b)使用1毫米厚的平面分束器生成同一区域的原始 iscat 图像。两个分束器具有相同的分裂比 (50% 反射, 50% 传输)。在1毫米厚的平面分束器产生的图像中, 可以清楚地观察到菲涅耳反射产生的干扰文物。刻度条: 2μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

在该协议中, 我们描述了 iscat 的广域照明方案, 因为它快速、易于实现, 并允许在大面积^{14 上进行}并行检测。另一种常见的方法是使用声光偏转器 (aod) 并扫描样品 12^、17的共聚焦光束。这种方法避免了对高质量波前的需求, 但比传统的广域成像在实验上更为复杂。此外, 共聚焦照明的速度受到 aod 照明速度的限制。根据所需的实验参数, 原则上可以利用共聚焦或广域照明方案来检测活细胞分泌的单一蛋白质。

正如整个协议所讨论的, 必须最大限度地减少显微镜样品阶段的横向机械波动。即使是样品位置上的纳米偏差也会导致连续相机帧的变化, 并在差分图像中产生明显的外部噪声。因此, 建议在实验期间使用机械稳定的显微镜级和阻尼光学工作台 (步骤 1.1.1), 并在实验期间用光学窗帘或面板覆盖设置 (步骤 3.5)。

还可以考虑为长期测量制定积极的重点稳定计划。在这种方法中, 第二个激光被整合到显微镜中的一个总内部反射 (tir) 安排, 然后成像到一个象限光电二极管。系统焦距的变化转化为象限二极管上 tir 激光光斑的侧向位移, 然后可在有源反馈回路中使用该位移来控制压电第26阶段的 z 轴.因此, 消除了长期的垂直漂移效应。

可以对所提出的技术进行一些修改和扩展, 以满足特定的实验需要。例如, 商业显微镜阶段孵化器可随时集成到 iscat 显微镜中, 用于细胞的长期成像。其他技术也可以实现, 以补充 iscat 成像, 如共聚焦或 tir 荧光显微镜¹⁷。为了适应所研究的系统, isccat 的分泌量可以在其他细胞介质 (如 dmem 或 dpbs) 中进行, 但由于激光吸收会干扰实验, 因此应避免 ph 指示剂苯酚红色。此外, 补充剂, 如胎儿小牛血清 (fcs) 或人血小板裂解液 (hpl) 含有蛋白质, 可能会干扰 iscat 检测。根据实验所需的灵敏度, 这些补充剂应排除在显微镜介质之外。

iscat 依赖于分析物散射光的能力--这是所有蛋白质所固有的特性--因此本质上是非特异性的。然而, 一定程度的特异性是可能的, 因为 iscat 信号与蛋白质质量^14,27,28呈线性扩展。这样就可以使用标准的蛋白质样本校准 iscat 系统, 如牛血清白蛋白 (bsa) 和纤维蛋白原^14、27、28。事实上, 最近, young等人.^28个扩展了 piliarik & amp; sandoghdar¹⁴的工作, 并表明 iscat 可用于确定小的条纹四维蛋白 (53 kda) 的蛋白质分子量, 质量分辨率为 19 kda, 精度约为 5 kda。几种传统方法可以通过提供额外的特异性来进一步补充 iscat。例如, 酶联免疫吸附试验 (elisa) 和其他表面修饰限制了蛋白质结合事件, 因此只检测到目标蛋白 16.

在这个协议中, 我们描述了如何使用 iscat 显微镜来研究细胞分泌物在单个蛋白质水平与亚秒时间分辨率¹⁶。该技术是通用的, 可以在任何商业或自制显微镜上实施。与单分子荧光方法相比, 该方法不受光漂白或闪烁效应的影响, 但仍能实现单蛋白敏感性。这些特性使 iscat 成为生物传感和显微镜领域的有力工具。未来的应用将侧重于阐明复杂的细胞相互作用, 如对刺激或细胞通信的免疫反应。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item/Device
100x / 1.46 NA objective	Zeiss	420792-9800-000	alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objective	Leica	566049	N Plan
Piezo Stage	PI	P-517k020	3-axis stage with 100x100x10µm range
Diode laser (445 nm)	Lasertack	PD-01236
Optics/Optomechanics	Thorlabs/Newport	-	lenses, mirrors, posts, mounts
Pinhole	Thorlabs	P30H
LED light source	Thorlabs	MCWHL5
Shortpass filter (580 nm)	Omega Optical	580SP	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
Longpass filter (500 nm)	Thorlabs	FEL0500	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
70R/30T beam splitter	Newport	20Q20BS.1
Economy beam splitter	Thorlabs	EBS1	used for the comparison of fringe effects
Wedged plate beam splitter	Thorlabs	BSW26	used for the comparison of fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm)	Edmund Optics	66249
8R/92T beam splitter	Thorlabs	BP108
CMOS camera	Photonfocus	MV1-D1024E-160-CL	for iSCAT aquisition
CMOS cameras	Mightex	SCE-B013-U	for bright field / fluorescence aquisition
Longpass filter (600 nm)	Thorlabs	FELH0600
Computer	Fujitsu Siemens	-	Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD
Acquisition Software	LabVIEW	-	LabVIEW 2016 Suite
Analysis Software	Matlab	-	Matlab 2014 Suite
Plasma Cleaner	Diener	Diener pico
Incubator	Binder	Model CB
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Reagent/Material
RPMI 1640 medium	Gibco	11835063	without phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Sigma Aldrich	59205C
Cover slides	Marienfeld	107052
Glass bottom culture dishes	ibidi	81158
Fluorescent Microspheres	Invitrogen	F8821	used for calibration
Immersol immersion oil	Zeiss	444960
Propidium iodide stain	Invitrogen	R37108
Small pipette tips	Eppendorf	30075005
Flexible pipette tips	Eppendorf	5242956003
Ethanol, 99.8%	Fisher Scientific	E/0650DF/15
Sodium hydroxide, pellets	Sigma Aldrich	221465	for preparing 0.2M NaOH solution