Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

Özet

Onlar yaşayan hücrelerden salgılanan gibi biz tek etiketlenmemiş proteinler gerçek zamanlı Optik algılama için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çeşitli farklı biyolojik sistemleri ve yapılandırmaları için uygulanabilir dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi dayanmaktadır.

Özet

Dalgaboyu saçılma (iSCAT) mikroskopi, gerçek zamanlı olarak bireysel yaşayan hücrelerden salgılanan tek etiketlenmemiş proteinler algılama yeteneğine sahip bir yöntemi göstermektedir. Bu protokol için biz bir iSCAT mikroskobu gerçekleştirmek ve bir hücre altında eğitim canlılığı izlemek için ek görüntüleme kanalları ile tamamlayıcı için temel adımları kapsar. Onlar biz bir ölümsüzleştirdi B-hücre hattı (Laz388) ile göstermek bir canlı hücreden salgılanan gibi bu, biz tek proteinlerin gerçek zamanlı algılama yöntemini kullanın. Mikroskop ve örnek hazırlanması yanı sıra kaydedilen verilerin analizi ile ilgili gerekli adımları ele alınmıştır. Video iletişim kuralı o iSCAT mikroskobu salgı tek molekül düzeyinde eğitim için basit bir yöntem sunmaktadır gösterir.

Giriş

Salgılanan proteinler çeşitli fizyolojik süreçleri¹içinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, onlar düzenli olarak toplu ensemble (proteomik) veya tek bir varlık^2,3olarak incelenmektedir. Proteomik geleneksel olarak proteinler Örneğin, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA), akış sitometresi veya kütle spektrometresi^{4,5yoluyla belirli bir biyolojik sistemi mevcut kümesinin tamamını inceler, 6}. Tek proteinler, öte yandan, genellikle çeşitli floresan^7,8, plasmonics^9,10veya kriyojenik elektron¹¹ temel teknikler kullanarak algılanır microscopies. Tüm bu tekniklerin karmaşık aletler, etiketleme veya her ikisini kullanmak ve onlar sadece altında eğitim sistemi hakkında uzun vadeli bilgi teslim gibi genellikle dynamics bilgi eksikliği.

Burada alt ikinci zamansal çözünürlük¹⁴ile iSCAT^12,13 mikroskobu anlamda bireysel salgı proteinler için kullanırız. Önemlisi, bu teknik zayıf dağınık sinyal her protein^12,14' e içsel algılar. Küçük bir bioparticle scatters ışık miktarını onun polarizability ile ölçekler. Bir proteinin şekil farklı bir etkili saçılma küre^14,15,16ve bunu yaklaşık varsayarak proteinler çok benzer Kırılma endeksi var, ölçülen sinyali doğrudan olabilir Moleküler Ağırlık (MW) protein bağlı. İSCAT kontrast karşı moleküler ağırlığa göre başvuru ölçümleri ampirik kalibrasyonu bir proteinler farklı boyutlarda ayırt etmek izin verir. iSCAT deneyler kolayca floresans mikroskobu^17,18, immunosorbent reaktifler yanı sıra herhangi bir protein faiz¹⁴ özel bir algılama için izin vermek için floresan veya saçılmasını etiketleri tarafından tamamlanmaktadır ^{, 17 , 19}.

Prensip olarak, protein zayıf dağınık ışık dalgaboyu ikincil başvuru dalga ile karıştırma yoluyla yükseltecek tarafından iSCAT çalışır. Algılanan yoğunluğu () bir iSCAT içinde mikroskop tarafından anlatılan

nerede olay yoğunluğu, bir katsayısı referans dalga katkı için nano nesnenin altında eğitim, saçılma gücünü belirtir ve faz kayması arasında dağınık olduğunu ve başvuru dalgalar¹⁴. Ya iletilen veya geri yansıyan olay ışık genellikle her durumda nerede bir referans dalga kullanılan transmissivity veya yansıtma örnek odası için sırasıyla hesapları. Dönem protein çapraz bölüm saçılma için orantılıdır ve çapraz bir süre için karşılaştırıldığında ihmal. Böylece, ayarı tam yıkıcı girişim için algılanan ışık tarafından verilen nerede başvuru yoğunluğu ve parazit yoğunluğu.

iSCAT mikroskobu biyolojik süreçlerin tek molekül düzeyinde eğitim için mükemmel bir yöntem sunmaktadır. Örnek olarak, biz Laz388 hücreleri araştırmak — bir Epstein - Barr virüsü (EBV) B lenfosit hücre satır^20,21 dönüştürülmüş — onlar IgG antikorlar¹⁶gibi proteinler salgılar gibi. Ancak, yöntem genel ve çeşitli diğer biyolojik sistemleri için uygulanabilir. iSCAT doğal olarak belirsiz ve herhangi bir protein-ebilmek bulmak veya nanopartikül veya bu belirli veya çoğaltılmış algılama için ortak yüzey functionalization yöntemleri ile genişletilebilir. Sadeliği ve floresan mikroskopisi gibi görme duyusuyla ilgili diğer teknikleri ile kombine edilebilir yeteneği iSCAT hücre biyolojisi içinde değerli bir tamamlayıcı araç olun.

Protokol

Uyarı: Lütfen okuyun ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) herhangi bir kimyasal kullanmadan önce tüm uygun güvenlik uygulamaları gözlemlemek ve kişisel koruyucu donanımları (lazer koruyucu gözlük, göz koruması, eldiven, laboratuvar mont) gerektiği gibi.

1. mikroskop^16,18 iSCAT bina

Not: İSCAT mikroskop genellikle değiştirilmiş ters mikroskop kuruluşu oluşur. Kısacası, bir lazer yüksek sayısal diyafram (NA) objektif geri odak düzlem odaklanmıştır ve görüntüleme bir objektif parçacığın geri dağınık ışık kamera çip üzerine odaklanmak için kullanılır. Genel olarak, bu geniş alanlı mikroskop sıfırdan inşa edilmiş veya varolan bir ters mikroskobunun dayalı. Bu protokolü kullanılan donanım değişiklikleri mümkün olmakla birlikte kurulumu gerçekleştirmek için temel adımları kapsar. Bir iSCAT mikroskobu Meclisi daha ayrıntılı bir açıklama Arroyo ve ark. çalışmalarında bulunabilir ¹⁸.

Dikkat: Bir iSCAT mikroskobu Sınıf IV lazer ışık kaynağı için bir sınıf IIIB içerir. Montaj ve mikroskop optik hizalama uygun göz koruma gereklidir. Mikroskop derleme sırasında lazer ışını yolu düz kalır ve yeni optik bileşenleri eklendikçe bükülmesi değil emin olun.

1. Mikroskop ışık yolunu kadar ayarlayın.
   1. Damped optik tablo ve bir katı metal blok kullanarak oluşturduğunuz bir yüksek sayısal diyafram (NA) hedefi birleştirmek mikroskop örnek sahne¹⁸ (100 X / 1,46 NA) ve yanal örnek çeviri için değişikliği odak izin verir bir çeviri birimi amaç için konum.
      Not: Bir iSCAT mikroskop limitte tek proteinleri tespit harici titreşimler son derece duyarlı bir işlemdir. Her taraftan örnek destekler bir centrosymmetric piezo sahne akustik uyarilmalar Aksi halde odak ve yanal istikrarı tehlikeye atabilir örnek sınırlamak için önerilir. Şekil 1 piezo çeviri birimi ve amacı da dahil olmak üzere bir uygun örnek sahne gösterir. Buna ek olarak, bu büyük ve kararlı bağlar aşağıdaki adımlarda açıklanan tüm optik bileşenler için kullanılır önerilir. Böyle bileşenleri Belçika'dan tedarikçilerin ticari optik kolayca kullanılabilir.
   2. 50 cm odak uzaklığı singlet objektif (geniş alanlı objektif) ve 45 ° (dikey ışık diyot lazer dalga boyu 445 nm amacın geri odak düzlem üzerine, odaklanmak için ayna kaplin) kullanın. Bu amacın ileri odak collimated bir ışın oluşturur ve iSCAT aydınlatma kaynağı olacaktır. Gerekirse, dağınık şekilde 30 µm iğne deliği veya tekli mod fiber üzerinden 50 cm objektif önce lazer filtreleyin.
   3. Bir damlacık Daldırma yağ amaca uygulamak ve bir cam coverslip mikroskop sahne örnek düzlemde yer. Bu geri aşağı görüntüleme amacı yansıtan bir ışın da yol açar.
      Not: Yansıma örnek coverslip üst yüzeyde hava-cam arabiriminden ortaya çıkar ve iSCAT referans ışını için temel olarak hizmet verecek. Artık kir veya toz coverslip yüzeyine artış saçılma noktasının kaynakları, sonraki adımda görüntüleme amacı doğru odak içinde yardım verecektir.
      Dikkat: Lazer ışık çoğunluğu coverslip iletir ve dik objektif hareket eder. Bir opak aynasal difüzör yerleştirin (e.g., bir kağıt kartı) lazer ışık yaralanma riskini en aza indirmek için coverslip yukarıda.

Şekil 1: iSCAT örnek sahne. Fotoğraf üzerinde piezo çeviri ünitesi (siyah) yanı sıra ortalanmış 100 monte büyük alüminyum blok gösterir amaç x. 3-eksenli piezo sahne objektif odak düzlemi örnekte hassas konumlandırma için sağlar. Kaba odaklanarak (değil tasvir) objektif monte dişli bir tüp çevirerek yapılır. Blok 45 ° kaplin ayna yukarıda dört çelik kaideleri ile optik tabloda yer alıyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. Mikroskop düşsel yolunu kadar ayarlayın.
   1. Bir antireflection (AR) tanıtmak-ışın ayırıcı (% 70 yansıma, % 30 iletim) göre olay kiriş ve yaklaşık 10 cm 45° açıyla sonra geniş alanlı lens kaplı. AR kaplama Lazer kaynak doğru gelin. Bu olay ışın iletir ve başvuru yansıtır ve kirişler olay kirişe 90 ° açıyla dağınık.
      Not: önemli gölgelenme ve yan etkileri ışınını küpleri veya kaplamasız düzlemsel ışın kırma bölme kullanırken oluşabilir gibi AR-kaplı ve/veya kamalı ışın kırma tavsiye edilir. Tartışma daha fazla bilgi için bkz. İsterseniz, herhangi bir istenmeyen yansıyan ışın demeti bölücü arka taraftan doğan bir iris diyafram kullanımı tarafından engellenmiş olabilir.
   2. Böylece lazer amaç düz artık girebilirsiniz değil kalın kiriş splitter önemli kiriş deplasman tanıtacak. Gerekirse, doğru yayılma hedefi aracılığıyla sağlamak için ışın ayırıcı önce lazer ışını yol yeniden hizalayın.
      Not: Işın bölücü de geniş alan lens daha önce eklenmiş olabilir ve böylece ışın daha sonra yerlerinden değil mikroskop sahne (adım 1.1.2.), konumlandırılmış.
   3. Bu noktada, Girişmölçeri görüntüleme ve kol odaklanmak ve örnek uçak ve kamera parfocal olduğundan emin olun. İçbükey bir f yerleştirin sonra olay ışın yolundaki geniş alanlı objektif-45 cm objektif bir pozisyonda 5 cm =. Bu amacın arka diyafram girerek collimated bir ışının içinde sonuçlanır.
   4. Girişmölçeri yansıyan kolundan yerleştirilen bir ekran ile amaç kaba odak konumu bulmak için dikey yönde hareket ettirin. Ekranın isabet ışın collimated zaman odakta hedefidir.
      Not: Bu işlem şematik resim 2 gösterir.
   5. Her iki f kaldırmak kaba odaklanarak tamamlandığında =-45 cm objektif ve belgili tanımlık perde.
      Not: bir negatif odak lens kullanmak yerine, geniş alanlı objektif hareketli bir monte yerleştirilen olabilir ve o ışın yolu bu adım için dışarı kayar. Ancak, en istikrarlı mikroskop yapılandırma elde etmek için bu geniş alanlı objektif sabit bir pozisyonda tutmak için önerilir.
   6. Eklemek ikinci bir f = 50 cm singlet objektif dağınık ışık odaklanmak ve CMOS Kamera sensör üzerine yansıyan ışık collimate. Objektif geri odak düzlemi referans ışını yeniden collimate ve dağınık ışık odaklanmak için amacın 50 cm yerleştirilir emin olun.
   7. Yer CMOS chip 50 cm uzakta f = 50 cm objektif ve kiriş doğrudan doğruya üstüne belgili tanımlık küçük parça ortasına yerleştirin.
      Not: Aşağıdaki parametreler genellikle görüntüleme için kullanılır. Lazer (dalga boyu 445 nm) çıkış gücü 100 olarak ayarlanmışsa mW. İğne deliği ve ışın splitter azalt iletilen ışık böylece amaç girerek etkili güç yaklaşık 9 mW. Örnek konumundaki ışın çapı 6 µm için tutarlar. Kullanılan görüntüleme ile etkili büyütme sistemi yaklaşık 300 x camdır. CMOS yonga üzerinde görüntü boyutu 128 × 128 piksel bir görüş alanı içinde yaklaşık 5 × 5 µm²sonuçlanan aydınlatılmış alanı içinde ayarlanır. Şekil 3 tam olarak birleştirilmiş iSCAT mikroskop şematik gösterir.

Şekil 2: kaba iSCAT mikroskop odaklanarak. Şematik sistem odak haline getirmek için optik yerleşimi gösterir. Işın bölücü AR kaplı arka yüzü (70/30 BS) kırmızı olarak işaretlenir. Önemli mesafeler yeşille sağlanır. Kullanılan lensler odak uzaklık (f) belirtilir. Bileşenler mavi kesik kutusunda adımları 1.2.6 - 1.2.7 eklenir. İçbükey mercek (yakınsak iSCAT ışını yeniden collimate için kullanılır) ve ekran daha sonra kaldırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: iSCAT mikroskobu. Şematik tamamen monte iSCAT mikroskop gösterir. Işın bölücü AR kaplı arka yüzü (70/30 BS) kırmızı olarak işaretlenir. Önemli mesafeler yeşille sağlanır. Kullanılan lensler odak uzaklık (f) belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. Ek görüntüleme kanalları kadar ayarla.
   Not: Bu bölümde iSCAT lazer parlak alan mikroskobu ile ve hücre canlılığı floresans mikroskobu ile izlemek için çevreleyen geniş bir alana gözlenmesi için izin veren mikroskop başka bir görüntüleme yolunu ekler.
   1. Bir LED ışık kaynağının çıkış çift (yaklaşık 500 nm < λ < 580 nm) içine uzun bir çalışma mesafesi 20 X / 0.4 NA amaç ve örnek odası üzerinde odaklanan ve yanal LED çıkış konumlandırma için izin mekanik bileşenleri yüklemek örnek.
      1. LED spektrum hücre ölüm işaretleyici (propidium iyodür (PI)) uyarma yelpazesini kapsayan ve onun Floresan (λ > 600 nm) ile müdahale değil çıkış'ın emin olun. Optik filtreler kullanın.
   2. Üst (geniş-alan) ve alt (iSCAT) hedefleri collinear üst amaç yanal taşıyın. Bu bir ekran alt amaç altında yerleştirerek ve ekrandaki iletilen LED ışık yoğunluğunu en üst düzeye çıkarma tarafından belirlenir. Yere bir λ = 550 nm kısa taramalı Dikroik ayna (SPDM) iletilen LED iSCAT lazer yolundan ışık bölmek için.
   3. Bu ışın iki kanalı ile bir % 8 reflective/92% aktarıcı kiriş kırık (BS) ayrılmıştır. Floresans kanal % 92 yoludur ve % 8 yol alan parlak görüntüleme için kullanılır.
   4. Alan parlak kanalı üzerine bir f kullanarak bir CMOS Kamera görüntü = 5 cm akromatik tamamen objektif.
   5. Floresans kanalı üzerine bir f kullanarak ayrı bir CMOS Kamera görüntü = 5 cm akromatik tamamen objektif ve bir λ = 600 nm uzun-pass filtre uyarma ışık engellemek için. Şekil 4a bir şematik tüm görüntüleme kanallar dahil olmak üzere tam olarak birleştirilmiş mikroskop gösterir.

Şekil 4: tek hücreleri tarafından salgılanan proteinlerin iSCAT mikroskobu. (a) iletişim kuralında tanımlanan mikroskop şematik. 1 daha fazla bilgi için bkz:. Kısaltmalar: LED ışık yayan diyot; SPF, kısa geçiren filtre; obj, amaç; SPDM, kısa taramalı Dikroik ayna; BS, ışın ayırıcı; LPF, uzun geçiren filtre; BF, aydınlık alan; Fluor, floresans; C1 C3, kamera 1-3. (b) parlak-alan görüntü tek bir Laz388 hücre iSCAT (beyaz bir kare tarafından tasvir) görüş alanı uzak yaklaşık 4 µm. C3, kamera tarafından çekilen görüntü ölçek çubuğu: 10 µm. (c) floresan görüntü (b) hücrenin konumu ile gösterilen aynı bölgenin beyaz bir daire tarafından işaretlenmiş. Floresans yokluğu hücre uygun olduğunu gösterir. C2, kamera tarafından çekilen görüntü ölçek çubuğu: 10 µm. (d) ham iSCAT kamera görüntü anlık görüntü ile 80 µs çekim hızı. C1 kamera tarafından çekilen görüntü. Tartışma bölümünde açıklandığı gibi kronolojik zamanmekansal arka plan çıkarma sonra aynı bölgede (e) iSCAT görüntüsü. Görüntü 1000 sıralı ham çerçevelerle 400 MS (d) son karesine vakit entegre edildi ve cam coverslip yüzey pürüzlülüğü ortaya koymaktadır. (f) bağlama olay coverslip üzerine 2 proteinlerin gösteren sorumlu fark iSCAT görüntü. Görüntünün iki ardışık filtre uygulanmış resim (e) çıkarılarak inşa edilmiştir. Ölçek çubukları (d), (e) ve (f): 1 µm. Bu rakam McDonald, M.P. vd adapte edilmiş ¹⁶. telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. Bilgisayar ve yazılım ayarlayın.
   1. Bütün kameralar bir bilgisayara bağlayın. İlgili sürücü paketlerini yüklemek ve onların control yazılımı edinmek/yazma.
      Not: Yüksek hızlı satın almalar için uygun donanım gereklidir. En azından, çok çekirdekli işlemci, 16 GB-in koç, bir çerçeve kapmak kartı ve veri depolama için bir katı hal diski tavsiye edilir.
   2. CMOS Kamera iSCAT görüntü gözlemlemek ve cam coverslip üzerinde kalan toz veya kir parçacık bularak odakta olduğundan emin olun. Parçacığın görüntü işlevi (PSF) dairesel yayın simetrik bir noktaya yayılmış olduğundan emin olun.
      Not: Lazer ışını amaç düz ama optik eksen ile ilgili küçük bir açıyla geçmiyor ki bir dairesel yayın olmayan simetrik PSF ana nedeni var. Bu açı ve 45 ° kaplin ayna ile olay ışın konumunu ayarlayarak düzeltilmiştir.
   3. Parlak alanını ve floresan kanal kamera görüntülerini incelemenizi öneririz. Her ikisi de odak ve aynı alanı görüntülemek emin olun. İSCAT lazer konumunu yaklaşık görüntünün ortasında olduğundan emin olun ve konumunu daha sonra başvurmak üzere not alın. Şekil 4b – 4f tipik kamera görüntüleri için bkz.
      Not: bir hücre örneği veya floresan boncuk odağı iki kanal bulmak için kullanın. Geçici olarak sistem ayarlamak için floresans uzun taramalı filtreyi kaldırın. Hücrelerin konvansiyonel görüntüleme için odak iSCAT odak düzlem biraz daha yüksek olması gerekir. Bunun için amacı taşımadan telafi etmek için iki ilgili f odak noktası konumlarında kameralardan yerinden 5 cm lensler =.
   4. Gerekli kamera parametrelerini ayarlayın. Sabit kare hızını kullanın ve yazılım kazanç ve düzeltme araçlarını devre dışı bırak.
      Not: Aşağıdaki parametreler kullanılır: iSCAT kamera 5000 kare / saniye (fps) 80 µs bir çekim hızı ile ayarlanır. Yukarıda belirtildiği gibi 128 × 128 piksel görüntü boyutudur. Alan parlak ve floresan fotoğraf makinesi tam çerçeve boyutu (1280 × 1024 piksel) çalışır. Bright-alan görüntüleme 20 ms çekim hızı ile yapılır. Floresans kamera 750 ms pozlama süresi için ayarlanır ve 5 ardışık kare bir son görüntüyü oluşturmak üzere toplanır. Bright alanlı ve floresan görüntüleri 20 sabit s zaman aralıklarında elde edilir.

2. deneme hazırlanması

1. Prepare hisse senedi mikroskobu orta.
   1. 25 mL HEPES tampon çözeltisi ekleyin (1 mol/L) son 1 L 25 mmol/L HEPES çözüm elde etmek için RPMI 1640 orta 975 ml. Alternatif olarak, bir arabellek aracı zaten dahil HEPES ile kullanın.
      Not: HEPES ortam koşulları (Örneğin, bir kuluçka dışında ve sürekli CO₂ kaynağı olmayan) bir ölçüm sırasında ortamın pH değerini korumak için kullanılır.
   2. Bir aliquot bir deney için gerekli çözüm ve oda sıcaklığına kadar sıcak izin. Orta 2 mL yeterli olur. Kalan stok çözüm 4 ° C'de tutmak
2. Mikroskop küvet hazırla.
   Not: Aşağıdaki adımları bir alüminyum taban plakası ve hem coverslip giderir ve piezoelektrik 3D Pozisyoner çiftler bir akrilik küvet yemek oluşan bir özel olarak oluşturulmuş örnek sahibi için açıklayınız. Ticari olarak mevcut steril kültür yemekleri bir cam alt ile de kullanılabilir.
   Not: Fotoğraflar özel olarak oluşturulmuş örnek sahibinin Şekil 5 gösterir.
   1. Yeni mikroskopi coverslip almak ve deiyonize su (DI-su) ve etanol ile durulayın. Hava kuru azot veya basınçlı hava ile slayt.
   2. 500 W RF güç 10 min için bir oksijen plazma atmosferde (0.3 mbar gaz basıncı) coverslip temiz. Bu yüzeyden tüm organik kirleri kaldırır.
   3. Akrilik küvet çanak ın 0.2 mol/L NaOH çözüm için yaklaşık 10 dk. durulama DI su ile çeker tarafından temiz.
   4. Örnek sahibi montaj ve bir plastik Petri denemeye ihtiyaç kadar çanak yeterli.

Şekil 5: özel olarak oluşturulmuş örnek sahibi. (a) sahibi bileşenleri örnek: (1) akrilik küvet çanak; (2) alüminyum taban plakası; (3) vida tutarak; (4) silikon O-ring; (5) coverslip. (b) tam olarak örnek sahibi toplandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. Mikroskobu hazırlayın.
   1. İSCAT aydınlatma lazer, parlak-alan/floresan aydınlatma LED, kameralar ve satın alma bilgisayar/yazılım açın. Lazer ışını bir pozisyonda amacı önce engelleyin.
   2. 100 X sağlamak / 1,46 NA amacı temiz. Eğer değilse, lens Temizleme mendili ve etanol üretici yönergeleri uyarınca hedefi temizlemek için kullanın.
   3. Bir damla daldırma yağı mikroskop hedefte uygulanır.
   4. (2.2 bölümünde monte) örnek tutucu al ve örnek coverslip mikroskop amaçta ortalanacak şekilde dikkatle iSCAT mikroskop piezo sahnede monte edin. Özenli ve objektif lens zarar dikkatli olun. Maksimum tork değil aştı üretici belirtilen sağlanması sırasında parmak vida ile piezoelektrik Pozisyoner birimine bağlayın.
   5. 1 mL (2.1 bölümünde hazır.) hisse senedi mikroskobu orta küvet ekleyin.
   6. 2 damla propidium iyodür leke orta olarak bir hücre ölüm işaretçisi^16,22ekleyin.
   7. Lazer engelini kaldırmak ve sistem odak haline getirmek. Önce adımları 1.2.3 yineleyerek amacı coverslip doğru mesafede konumlandırılmış doğrulayın. -1.2.5. (Şekil 2). O zaman, odak piezo sahne alanı'nın z ekseni ile ince ayarını yapın.
   8. Işık kaynakları, kameralar ve yazılım tüm ayarlarını doğru şekilde ayarladığınızı doğrulayın. Bu lazer gücü, LED yoğunluğu, kamera kare hızları, fotoğraf makinesi pozlama süreleri veya yolları kaydetme yazılımı gibi parametreleri içerir.
      Not: yüksek kare hızları videoları tasarrufu büyük dosya boyutları üretebilir. Bilgisayar üzerinde yeterli boş disk alanı sağlamak.
   9. Lazer ışını yeniden engelleyin. Mikroskop şimdi bir deney için hazırdır.
4. Hücreleri hazırlayın.
   Not: Laz388 hücreleri^%20 10 fetal buzağı serum (FCS), amino asitler, pyruvate ve antibiyotik ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamda kültürlü. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO₂ adlı inkübe ve bölünmüş ve her 2-3 gün²³ile taze orta sağlanan.
   1. Hücre kültür şişeye kuluçka makinesi alın ve yaklaşık 1 x 10⁶ hücreleri içeren orta Aspire edin. Doğru birim belirlemek için bir hemasitometre kullanımını tarafından hücre kültürü konsantrasyonu ölçmek.
   2. RPMI 1640 Orta oda sıcaklığında 10 mL ile hücre çözüm mix ve 300 x g 7 min için de örnek santrifüj kapasitesi.
   3. Dikkatle ayıklamak ve süpernatant konsantre hücre Pelet rahatsız edilmeden kalır sağlarken.
   4. 2.4.2 adımları yineleyin. -2.4.3. hücrelerin konsantre Pelet ile.
   5. 0.5 mL stok mikroskobu Orta (2.1 bölümünde hazır.) hücreleri yeniden askıya alma ve hemen bir denemede kullanabilirsiniz.

3. iSCAT mikroskobu salgılayan hücre

1. Lazer ışını hücreleri iSCAT lazer ışığına doğrudan maruz önlemek için bloke olur emin olun.
2. Hücreleri örnek küvet enjekte.
   1. Yaklaşık 3 µL hücre örneği (hazırlanan Bölüm 2.4.) biraz kapalı merkezi örnek küvet enjekte. Coverslip için pipet ucu hafifçe dokun ve yavaş yavaş hücre çözümü enjekte. Hücreleri coverslip üzerinde yerleşmek için izin verir.
      Not: küçük hacimli pipet uçları (10 µL) ya da uzun, esnek jel-yükleme ipuçları kullanın.
   2. Böylece tek hücreli ölçümleri iSCAT lazer çevresi birden çok hücreyi tarafından akıttıkları hücre yoğunluğu yaklaşık 1 hücre başına 500 µm² altında olduğundan emin olun.
   3. Hücre sayısı çok düşük, tekrar adım 3.2.1 ise. yeterli sayıda kullanılabilir duruma gelene kadar.
   4. Hücre kapsamı çok yoğun ise, yaklaşık 20 µL ek mikroskobu orta bir enjeksiyon hücreleri arasında coverslip dağıtmak için kullanın.
3. Piezo Pozisyoner kullanarak, örnek yanal bir hücreye kapat (yaklaşık 10 µm) iSCAT görüş alanı yerleştirmek için taşıyın. 445 nm lazer ışığı doğrudan maruz hücre için zararlı olabilecek gibi hücre iSCAT görüş alanı girmezse emin olun.
4. Alan parlak ve floresan resimler bulun ve hücre canlılığı²⁵doğrulamak için kullanın.
   Not: Uygun bir hücre yuvarlak bir şekil alan parlak görüntü vardır ve hücre ölümü propidium iyodür hücre²²içinde varlığını kaynaklanan güçlü floresan sinyallerini belirtilir, ancak floresan, değil.
5. İSCAT lazer ışını engelini kaldırmak ve coverslip yüzey hala odakta olduğundan emin olun. Drift ve akustik bağlantı üzerinden ortam çevrenin en aza indirmek için yalıtım tablo içine alın.
   Not: İkinci ağır optik perde veya optik tablo çevreleyen akrilik paneller ile gerçekleştirilir.
6. Ölçüm iSCAT, alan parlak ve floresan kameralardan gelen görüntüleri kazanılması by başlatın. Otomatikleştirmek ve deneysel verimliliği maksimize etmek için yazılım sürecinde kontrol edin. Hücre canlılığı ve odağı sistemin düzenli olarak kontrol edin.
   Not: lazer yoğunluğu, optik bileşenleri ve pozlama zaman ayarları kameranın bağlı olarak, iSCAT lazer floresans kamera ile etkileşebilir. Bu davranış görülmektedir, iSCAT lazer geçici olarak floresan görüntü alımları sırasında perde düşünün.

4. veri analizi

Not: Deneysel veriler doğal olarak gürültülü ve farklı iSCAT görüntülerdir. Wavefront deformasyonları da dahil olmak üzere olay ışık kaynağı, coverslip ve kamera gürültü yüzey pürüzlülüğü tipik iSCAT ölçümü, gürültü birkaç kaynaklarıdır. Aşağıdaki bölümde hangi üzerinden işlem sonrası bu gürültü kaynaklarından giderildiği bazı yollar sunar. Ayrıca, kurulum yanal mekanik kararsızlıklara gürültülü veri için kurşun ve buna göre aşağıdaki tartışma bölümünde açıklandığı gibi ele alınması gerekir. Açıklanan analizleri özel MATLAB komut dosyaları ile gerçekleştirilir.

1. Kamera gürültü yüksek uzaysal frekansları dışlayan bir iki boyutlu Fourier süzgeç ile raw veri süzerek en aza indirmek. Filtre boyutu (çoğunlukla sistemin sayısal diyafram tarafından belirlenir) belirli deneysel yapılandırma sığacak şekilde ayarlanması gerekir.
   Not: Optik sisteminden daha yüksek uzaysal frekansları ile yansımadaki özelliklerin (örneğin kamera okuma gürültü) yabancı kaynaklardan kaynaklanan ve ihmal.
2. Görüntüleri raw kamera sayar iSCAT tersine dönüştürmek.
   Not: fotoğraf makinesi tarafından tespit sinyali olduğunu . iSCAT kontrast olarak tanımlanan nerede başvuru ışığın şiddetini bölümü tarafından coverslip, bu durumda yansıyan olduğunu ve arasında girişime olduğunu ve dağınık yoğunluğu ().
   1. Sinyalin içine ayrı ve belirli çerçeveler içinde faiz parçacıkların bulunmaz zamansal ortalaması bilgisayar tarafından. Referans sinyali ortaya çıkan görüntü sağlar .
      Not: Alternatif olarak, aşağıdaki konuya açıklandığı gibi bir etkin arka plan çıkarma adım gerçekleştirilebilir.
   2. Kontrast göre hesaplamak ^12,14,16.
3. Onun halefi her ardışık çerçevesinden çıkararak çalışırken fark görüntü oluşturun.
   Not: Artık coverslip yüzey pürüzlülüğü sinyalleri ve ardışık çerçeveler sabit oldukları gibi wavefront distorsiyonları etkili bu adımda kaldırılır. Çalışırken diferansiyel bir çerçeveden diğerine oluşan protein bağlamaları bırakarak bu kalıntı sinyaller kaldırır. Uzun vadeli örnek sürüklenir duyarlı olmadığından bu dinamik arka plan çıkarma faydalıdır.
4. Algılamak ve her çerçeve için tek parçacıklar dizin ve onların belirli kontrast ve konumunu belirlemek için bir zirve arayışı algoritması uygulanır.
5. Protein bağlayıcı olayların çubuk grafikler oluşturmak ve onların ayıklanan tezat bilinen protein örnekleri^14,24derlenmiş bir kalibrasyon eğrisi yoluyla protein kitle ile arasında bir ilişki için adım 4.4 toplanan bilgileri kullanın.

Sonuçlar

Bir şematik bir iSCAT mikroskop Şekil 4aiçinde gösterilir. Temsilcisi parlak alan, floresan ve ham iSCAT görüntüleri Şekil 4b, 4 cve 4 d, sırasıyla¹⁶gösterilir. Şekil 4e ve 4f arka planı kaldırma ve diferansiyel posta işleme sonuçlarını göstermek; iki adsorbe protein Şekil 4fkırınım-sınırlı noktalar olarak görülebilir. Şekil 6 125 boyunca algılanan proteinler histogramını gösterir s. Bu veri bağlama olaylar ve onların kontrast¹⁶Katalog için çekilen resimlere bir tepe aramak algoritma uygulanarak elde edilmiştir. 503 proteinler toplam sayısı tespit edildi.

Sonraki, salgılanan türler başvuru ölçümleri saf protein çözümler üzerinde veya aracılığıyla ek ölçümleri functionalized cam yüzeyler^14,16ile yürütülen yasland tanımlanır. İSCAT veri böylece, doğrudan hücresel salgı dynamics subsecond ölçek¹⁶gözünde canlandır. Örnek olarak, biz daha önce IgG antikorlar Laz388 secretome büyük bir kısmını vardır ve yaklaşık 100 molekülleri başına ikinci¹⁶oranında hücreden çıkış bulduk. Ayrıca, a sıra-in 100 kDa - 1000 kDa kapsayan diğer parçacıklar hücreleri¹⁶tarafından salgılanan. Açıklanan yöntemi istihdam Örneğin, hücresel lizis¹⁶zamansal dinamiği belirlemek için veya bir hücre¹⁶çevreleyen salgıları kayma konsantrasyon degrade araştırmak için daha fazla olabilir.

Şekil 6: tek bir Laz388 hücre tarafından salgılanan proteinlerin Quantification. Histogram 125 s. kontrast değerleri 1 x 10^-4 kontrast kutulara (mavi çubuklar) birikmiş olan dönemde saptanan proteinler gösterir. Toplam 503 bireysel proteinlerin Bu ölçüm sırasında sayılan. Deneme ile benzer sonuçlar 10 kez tekrarlandı. Bu rakam McDonald, M.P. vd adapte edilmiş ¹⁶. telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Yararlı iSCAT veri alma için en önemli yönleri biridir yeteneği doğru odak konumuna coverslip yüzeyde ve, Ayrıca, için bulmak için uzun bir süre için bu konumu koruyun. Bunu yapmak başarısız genişletilerek PSFs, zayıf iSCAT sinyalleri ve drift ilişkilendirilmiş yapıların dynamics analizlerde neden olur. Yüzey özellikleri büyük referans ışını arka planı görünür değildir olarak odak düzlemi üzerinde temiz, çıplak coverslip bulma yüzey kolay bir iş olmadığını ortaya çıktı (bkz. Şekil 4 d).

Ham iSCAT görüntüleri kez wavefront kirleri uyarma kaynak kaynaklanan ve doğru görüntüleme uçak bulmak için bir yetenek engel olabilir arka plan sinyalleri tarafından kapatmamasını. Etkin wavefront çıkarma bu sorunu aşmak ve daha sonra sırasında bir ölçüm¹⁶iSCAT odak izlemek için kullanışlı bir yoldur. Bunu gerçekleştirmek için bir kayma örnek modülasyon yoludur. Kısacası, bir işlev üreteci bir kayma örnek modülasyon (290 nm genlik) uygulanan frekansta sonuçlanan piezo sahne alanı'nın dış denetim noktasına 50 Hz kare dalga geçerlidir. Zaman uyumlu kamera satın almalar aynı kaynaktan, kilit-in ilkeleri, sonuç wavefront telafi görüntü^14,16ile bir araya geldiğinde tetiklenir. Ortaya çıkan görüntü genellikle coverslip (Şekil 4e) yüzey pürüzlülüğü gösterir. Cama temizlendikten sonra kalan küçük özellikler mikroskop odak haline getirmek için kullanılabilir. Bu etkin arka plan çıkarma adım için kullanılan parametreler kare hızı, pozlama süresi veya donanım göre değiştirilebilir.

Yukarıda belirtildiği gibi bir yüksek kaliteli ışın ayırıcı iSCAT kurulum (adım 1.2.1.) kullanılması önerilir, hayalet gibi eserler Imaging olarak veya ince düzlemsel ışın kırma kaynaklanan parazit görüntüyü etkileyecektir ve ölçüm rahatsız. Şekil 7 bir yüksek kaliteli ve düşük kaliteli ışın ayırıcı arasında bir karşılaştırma gösterir. Her iki ham iSCAT görüntüler aynı bölgede kalan bazı parçacıkları içeren coverslip göstermektedir. Aynı iSCAT Kur hem görüntüleri yakalamak için kullanıldı, sadece ışın bölücü değiş tokuş. Şekil 7a gösterir kamerayı bir daha kalın (5 mm), kullanımı ile oluşan görüntü AR kaplı ve kamalı ışını splitter. Kamalı tasarımı sayesinde ışın bölücü arka yüzeyinden yansıyan ışın ön yüzeyinden kaynaklanan yansıma için anti-paralel ve amacı giriyor değil. Hiçbir girişim eserler meydana gelir. Şekil 7b aynı görüş alanı örnek üzerinde gösterir ama bu sefer bir daha ince (1 mm) düzlemsel ışın ayırıcı kullanıldı. Kiriş kırık, ön ve arka yüzeylerden yansımaları iki paralel ve fotoğraf makinesine aktarabilirsiniz. Girişim eserler açıkça görülebilir.

Şekil 7: karşılaştırma iSCAT görüntülerin üretilen yüksek ve düşük kaliteli ışın ayırıcılar ile. 5 mm kalınlığında, AR kaplı ve kamalı ışın ayırıcı kullanımı tarafından (a) Resulting ham iSCAT görüntü. (b) Resulting ham iSCAT görüntü bir 1 mm kalınlığında düzlemsel ışın ayırıcı kullanılarak aynı bölgede. Her iki kiriş kırık aynı bölme oranı (% 50 yansıma, % 50 iletim) vardır. Fresnel Yansımalar gelen doğan girişim eserler açıkça 1 mm kalınlığında düzlemsel ışın splitter ile üretilen resimdeki gözlenir. Ölçek çubukları: 2 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu protokol için o hızlı, kolay gerçekleştirmek ve paralel üzerinde geniş bir alan¹⁴algılama için sağlar gibi bir geniş-alan aydınlatma düzeni iSCAT için tarif. Başka bir ortak yaklaşım acousto-optik yansıtıcılar (AODs) kullanın ve örnek^12,17confocal bir ışın tarama etmektir. Bu yaklaşım yüksek kaliteli wavefronts engeller ancak daha deneysel olarak geleneksel geniş alanlı görüntüleme daha karmaşıktır. Ayrıca, confocal aydınlatma hız bu AODs tarafından sınırlıdır. İstenen deneysel parametreleri bağlı olarak, ya confocal ya da geniş alanlı aydınlatma düzenleri prensip olarak, canlı hücrelerden salgılanan tek proteinler algılamak için yararlı olabilir.

Boyunca protokolünün anlatıldığı gibi bu örnek sahne yanal mekanik dalgalanmalar mikroskop en aza indirmek için zorunludur. Örnek konumunu bile sapmalar nanometre ardışık kamera çerçeveler farklılığı neden ve önemli yabancı gürültü fark resimdeki teşvik. Bu nedenle bir mekanik olarak istikrarlı mikroskop sahne ve damped optik tablo (adım 1.1.1.) kullanmak için ve optik perde veya paneller ile kurulum (adım 3.5.) bir deney sırasında karşılamak için önerilir.

Bir odağın istikrar düzeni de uzun vadeli ölçülerini düşünülebilir. Bu yaklaşım, ikinci bir lazer bir toplam iç yansıma (tır) düzenlemesi mikroskop dahil ve daha sonra bir çeyreği fotodiyot yansıması. Değişiklikler sistemin odak tır lazer sonra etkin bir geribesleme piezo sahne²⁶z ekseni kontrol için kullanılan çeyrekte diyot, spot yanal talebiyle çevirmek. Uzun vadeli dikey drift etkileri böylece ortadan kalkar.

Birkaç değişiklik ve uzantılarını adresi ihtiyaçlarınıza deneysel sunulan tekniği uygulanır. Örneğin, ticari mikroskop sahne İnkübatörler kullanılabilir Bu kolayca dahil iSCAT mikroskop için uzun vadeli düşsel hücre içine. Diğer teknikleri de iSCAT gibi görüntüleme tamamlayacak uygulanabilir confocal veya tır floresan microscopies¹⁷. Lazer ışığı emme nedeniyle deneme rahatsız edemez altında eğitim, iSCAT salgılanması ölçümleri DMEM veya DPBS, gibi diğer hücre ortamlarda yürütülen olabilir sistemdeki adapte ancak, pH göstergesi fenol red kaçınılmalıdır. Ek olarak, fetal buzağı serum (FCS) veya insan trombosit lysate (hPL) gibi takviyeleri iSCAT algılama ile girişime neden olabilir proteinler bulunur. Deneme istenen duyarlılık bağlı olarak, bu takviyeleri mikroskobu ortamından dışlanmaları gerekir.

iSCAT dağılım ışık bir analit'ın yeteneğini kullanır — tüm proteinler için içsel bir özellik — ve bu nedenle doğal olarak belirsiz. Yine de, özgüllük bir dereceye iSCAT sinyalleri ölçek protein kitle^14,27,28ile doğrusal olarak mümkündür. Bu standart protein örnekleri, Sığır serum albumin (BSA) ve fibrinojen^14,27,28gibi kullanarak bir iSCAT sisteminin kalibrasyon için sağlar. Gerçek şu ki, çok yakın zamanda, Genç vd. ²⁸ Piliarik & Sandoghdar¹⁴ çalışmalarına genişletmiştir ve o iSCAT proteinler streptavidin (53 kDa) küçük molekül ağırlığı kitle çözünürlüğe sahip 19 kDa ve doğru olarak yaklaşık 5 kDa ile belirlemek için kullanılan göstermiştir. Birkaç geleneksel yaklaşım daha fazla özgüllük fazladan bir düzey sağlayarak iSCAT tamamlayıcı olabilir. Bir örnek, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) ve/veya diğer yüzey değişiklikleri kısıtlamak gibi olaylar böylece sadece hedef protein bağlayıcı protein¹⁶algıladı.

Bu protokol için nasıl iSCAT mikroskobu ile subsecond zamansal çözünürlük¹⁶tek protein düzeyinde hücresel salgıları araştırmak için kullanılabilir nitelendirdi. Teknik genel ve herhangi bir ticari veya ev yapımı mikroskobunun uygulanabilir. Tek molekül floresans yaklaşımlar, aksine yöntemi photobleaching acı değil veya etkiler, ancak bu yanıp sönen hala tek-protein hassasiyet elde eder. Bu özellikler iSCAT biosensing ve mikroskopi alanında güçlü bir araç olun. Gelecekteki uygulamalar uyarıcı veya hücresel iletişim immünolojik yanıt gibi karmaşık hücresel etkileşimlerin elucidating üzerinde durulacak.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item/Device
100x / 1.46 NA objective	Zeiss	420792-9800-000	alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objective	Leica	566049	N Plan
Piezo Stage	PI	P-517k020	3-axis stage with 100x100x10µm range
Diode laser (445 nm)	Lasertack	PD-01236
Optics/Optomechanics	Thorlabs/Newport	-	lenses, mirrors, posts, mounts
Pinhole	Thorlabs	P30H
LED light source	Thorlabs	MCWHL5
Shortpass filter (580 nm)	Omega Optical	580SP	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
Longpass filter (500 nm)	Thorlabs	FEL0500	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
70R/30T beam splitter	Newport	20Q20BS.1
Economy beam splitter	Thorlabs	EBS1	used for the comparison of fringe effects
Wedged plate beam splitter	Thorlabs	BSW26	used for the comparison of fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm)	Edmund Optics	66249
8R/92T beam splitter	Thorlabs	BP108
CMOS camera	Photonfocus	MV1-D1024E-160-CL	for iSCAT aquisition
CMOS cameras	Mightex	SCE-B013-U	for bright field / fluorescence aquisition
Longpass filter (600 nm)	Thorlabs	FELH0600
Computer	Fujitsu Siemens	-	Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD
Acquisition Software	LabVIEW	-	LabVIEW 2016 Suite
Analysis Software	Matlab	-	Matlab 2014 Suite
Plasma Cleaner	Diener	Diener pico
Incubator	Binder	Model CB
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Reagent/Material
RPMI 1640 medium	Gibco	11835063	without phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Sigma Aldrich	59205C
Cover slides	Marienfeld	107052
Glass bottom culture dishes	ibidi	81158
Fluorescent Microspheres	Invitrogen	F8821	used for calibration
Immersol immersion oil	Zeiss	444960
Propidium iodide stain	Invitrogen	R37108
Small pipette tips	Eppendorf	30075005
Flexible pipette tips	Eppendorf	5242956003
Ethanol, 99.8%	Fisher Scientific	E/0650DF/15
Sodium hydroxide, pellets	Sigma Aldrich	221465	for preparing 0.2M NaOH solution