Этикетка-бесплатная изображений из одного белки выделяется из живущих клеток через iSCAT микроскопии

Резюме

Мы представляем протокол реального времени оптического обнаружения одного немеченого белков, как они сделаны секретным от живых клеток. Это основано на микроскопии интерферометрических рассеяния (iSCAT), который может быть применен к целый ряд различных биологических систем и конфигураций.

Аннотация

Мы демонстрируем микроскопии интерферометрических рассеяния (iSCAT), метод, способный обнаруживать одного немеченого белки, выделяется из отдельных живых клеток в режиме реального времени. В этом протоколе мы покрываем основные шаги для реализации iSCAT микроскопа и дополнить его с дополнительных изображений каналов для мониторинга жизнеспособность клеток под исследование. После этого мы используем метод для реального времени обнаружения одного белков, как они сделаны секретным от живой клетки, которые мы показываем увековечен линия B-клетки (Laz388). Обсуждаются необходимые шаги по подготовке микроскоп и образца, а также анализ записанных данных. Видео-протокол показывает микроскопии что iSCAT предлагает простой метод для изучения секрецию на уровне одной молекулы.

Введение

Секретируемые белки играют значительную роль в различных физиологических процессов¹. Из-за этого они регулярно изучаются как коллективного ансамбль (протеомики) или как отдельные подразделения^2,3. Протеомика традиционно исследует весь набор белков, присутствующих в конкретной системе биологических например, иммуноферментного анализа (ИФА), проточной цитометрии или масс-спектрометрии^{4,5, 6}. Один белков, с другой стороны, обычно обнаруживаются с помощью различных методов, которые основаны на флуоресценции^7,8, плазмоники^9,10или криогенных электрона¹¹ microscopies. Все эти методы используют сложные инструменты, маркировки или оба и часто не хватает динамики информацию, как только они доставить долгосрочные информацию о системе в рамках исследования.

Здесь мы используем iSCAT^12,13 микроскопии смысл отдельных секреторной белки с секунды временное разрешение¹⁴. Важно отметить, что метод обнаруживает слабые рассеянного сигнала, присущих каждой белков^12,14. Количество света, которое рассеивает небольшой bioparticle весы с его поляризуемость. Предполагая, что форма белка могут быть аппроксимированы эффективного рассеивания сфере^14,,1516и что различные белки имеют очень похожие преломления, измеряемого сигнала может быть непосредственно подключен к молекулярной массой (МВт) белка. Эмпирические калибровки iSCAT контраст по сравнению с молекулярной массой измерениями ссылка позволяет отличить белков различных размеров. эксперименты iSCAT легко могут быть дополнены флуоресцентной микроскопии^17,18, иммуносорбента реагентов, а также флуоресцентных или рассеивании этикетки для конкретного обнаружения любого белка интерес^{14 , 17 , 19}.

В принципе iSCAT функции путем усиления белка слабый рассеянный свет через интерферометрических смешивания с волной Вторичный эталон. Обнаруженные интенсивность () в iSCAT описывается микроскопа

где -падающего света, — коэффициент для вклада ссылка волны, означает прочность рассеяния нано-объекта исследования, и является сдвиг фазы между рассеянного и ссылки волны¹⁴. Либо переданы или обратно отражение падающего света обычно используется как ссылка волна, где в каждом случае счета для пропускания или отражательной палаты образца, соответственно. Термин пропорциональна белка рассеяния крест секции и можно пренебречь по сравнению с крест термин. Таким образом, установка для полной разрушительного вмешательства, обнаруженных свет дается где ссылке интенсивность и является интенсивность помех.

iSCAT микроскопии предлагает превосходный метод для изучения биологических процессов на уровне одной молекулы. В качестве примера, мы изучаем Laz388 клетки — превратил вирус Эпштейна по - Барр (EBV) лимфоцитов ячейки строки^20,21 — как они выделяют белки, например IgG антитела¹⁶. Однако метод является общим и может применяться к целому ряду других биологических систем. iSCAT по сути неспецифических и может обнаружить любой белок или наночастиц, или он может быть продлен с общими методами Функционализация поверхности для обнаружения конкретных или мультиплексированных. Его простота и возможность быть объединены с другими оптическими методами, например микроскопии флуоресцирования, делают iSCAT ценный дополнительный инструмент в клеточной биологии.

протокол

Предупреждение: Пожалуйста, прочитайте все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием любых химических веществ, соблюдать все соответствующие безопасности практики и носить средства индивидуальной защиты (лазерный защитные очки, защита глаз, перчатки, лаборатории пальто) по мере необходимости.

1. Построение iSCAT Микроскоп^16,18

Примечание: Микроскоп iSCAT обычно состоит из установки модифицированных инвертированным микроскопом. В краткой лазер ориентирован на обратно фокальной плоскости высокая числовая апертура (NA) цели и изображения объектив используется для сосредоточиться обратно рассеянном свете частицы в микросхему камеры. В общем этот Микроскоп поля можно построен с нуля или на основе существующих инвертированным микроскопом. Этот протокол охватывает основные шаги для реализации установки, хотя возможны изменения в используемых аппаратных средств. Более подробное описание Ассамблеи iSCAT микроскопа можно найти в работе Арройо и др. ¹⁸.

Предупреждение: Микроскоп iSCAT включает класса IIIB до класса IV лазерный источник света. Соответствующие глаз защита необходима в тех случаях, когда монтаж и приведение оптики микроскопа. Во время Ассамблеи Микроскоп убедитесь, что путь луча лазера остается прямой и не отражается как добавляются новые оптические компоненты.

1. Настройка освещения пути микроскопа.
   1. Использование затухающих таблицы оптики и жесткий металлический блок, построить этап микроскопа в образец¹⁸ , включает цель высокая числовая апертура (NA) (100 X / 1,46 NA) и единицы измерения перевода, что позволяет для боковых пробный перевод, а также изменение фокуса позиция для достижения цели.
      Примечание: Операция iSCAT микроскопа на пределе обнаружения одного белки очень восприимчивы к внешних вибраций. Этап Центросимметричная пьезо, поддерживающий образец со всех сторон рекомендуется ограничить акустическая возбуждений образца, в противном случае нанесет фокуса и боковую устойчивость. Рисунок 1 показывает подходящий образец стадии, включая единицы измерения перевода piezo и цель. Кроме того рекомендуется, что массовые и стабильного крепления используются для всех оптических компонентов, обсуждаются в следующих шагов. Такие компоненты легко доступны от поставщиков коммерческих оптика.
   2. Используйте 50 сантиметров фокусного расстояния синглетно объектив (-поля) и 45° (по вертикали) муфта зеркало, чтобы сфокусировать свет Диод лазера длина волны 445 Нм на обратно фокальной плоскости цели. Это создает коллимированном пучке в цель вперед фокус и станет источником освещения iSCAT. При необходимости, фильтр лазер пространственно до 50 см объектив через 30 мкм точечным или одномодового волокна.
   3. Применить капельки нефти погружения к цели и coverslip стекла в плоскости образца микроскопа. Это приведет к Луч, который отражает обратно вниз через изображения цели.
      Примечание: Отражение возникает из воздуха стекла интерфейс на верхней поверхности образца coverslip и будет служить основой для iSCAT опорный пучок. Остаточные грязь или пыль на поверхности coverslip вызовет рассеяния точечных источников, которые помогают в правильную фокусировку изображения цели на следующие шаги.
      ВНИМАНИЕ: Большинство из лазерного света передает через coverslip и едет прямо вверх от цели. Место непрозрачной зеркальные диффузор (например., бумажной карты) выше coverslip, чтобы свести к минимуму риск получения травмы от лазерного света.

Рисунок 1: этап образца iSCAT. На снимке Массивный алюминиевый блок, на котором монтируется пьезо единицы (черный) а также центру 100 x цели. Этап 3-оси пьезо позволяет для точного позиционирования образца в фокальной плоскости цели. Грубой фокусировки осуществляется поворотом резьбовой трубки, на котором монтируется цель (не показано). Блок позиционируется на оптических таблицу с четырьмя стали тумбы над зеркалом соединение 45°. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Настройка визуализации пути микроскопа.
   1. Ввести просветляющие (AR)-покрытием splitter луча (70% отражения, 30% передачи) под углом 45° по отношению к падающего луча и примерно 10 см после объектив поля. Точка Просветляющее покрытие к лазерного источника. Это передает падающего луча и отражает ссылку и разбросанных балки под углом 90° к падающего луча.
      Примечание: AR-покрытием или клиновидные пучка сплиттер рекомендуются как значительные ореолы и бахрома эффектов может возникнуть при использовании луч расщепления, кубов или немелованной Вселенский пучка сплиттер. Смотрите обсуждение для получения более подробной информации. При необходимости, любые нежелательные отраженного луча, вытекающих из задней стороне splitter луча может быть заблокирован использования ирисовой диафрагмой.
   2. Толстые пучка сплиттер представит смещение значительные луча, так что лазер не может вводить цель прямо больше. При необходимости, перестроить лазерного луча перед splitter луча, чтобы обеспечить правильное распространение через объектив.
      Примечание: Splitter луча также могут быть добавлены до широкоугольный объектив поле и микроскопа позиционируется (на шаге 1.1.2.), так что луч не быть перемещены позже.
   3. В этот момент фокус изображения руки интерферометра и обеспечить образец самолета и камеры парфокальному. Место вогнутой f =-45 см объектив позиции 5 см после объектив поля падающего луча. Это приведет в коллимированном пучке, ввод спине диафрагмы цели.
   4. С экраном, помещены в отражение руке интерферометра переместите цель в вертикальном направлении, чтобы найти грубый фокусом. Цель находится в фокусе, когда коллимированного пучка, нажимая на экран.
      Примечание: На рисунке 2 показана схема этого процесса.
   5. Удалите оба f =-45 см объектив и на экране при завершении грубой фокусировки.
      Примечание: Вместо отрицательный фокусным расстоянием,-поля объектив сам может быть помещен на подвижных горе и смещается из луча для этого шага. Однако чтобы добиться наиболее стабильной конфигурации Микроскоп, рекомендуется провести объектив поля в фиксированном положении.
   6. Добавьте второй f = 50 см синглетно объектив сосредоточиться рассеянный свет и collimate отраженный свет на датчик CMOS камеры. Убедитесь, что объектив установлен 50 см от обратно фокальной плоскости цели, с тем чтобы вновь collimate опорного луча и сосредоточиться рассеянный свет.
   7. Место CMOS чипа 50 см от f = 50 см объектив и поместите луч прямо на середину чипа.
      Примечание: Следующие параметры обычно используются для обработки изображений. Выходная мощность лазера (волны 445 Нм) установлено равным 100 МВт. Обскуры и пучка сплиттер смягчить пропускаемого света, так что эффективная мощность, ввод цели составляет около 9 МВт. Диаметр пучка на положении образца составляет 6 мкм. С используемые изображения объектива эффективное увеличение системы — около 300 x. Размер изображения на микросхеме CMOS имеет значение 128 × 128 пикселей в освещенной области, в результате в поле зрения приблизительно 5 × 5 мкм². На рисунке 3 показана схема полностью собранный iSCAT микроскопа.

Рисунок 2: грубой фокусировки микроскопа iSCAT. Схема показывает расположение Оптика помочь привести систему в фокус. AR-покрытием обратной стороне splitter луча (70/30 BS) помечен красным. В зеленых предоставляются важные расстояния. (F) фокусные объективы используются обозначаются. Компоненты в поле синяя пунктирная добавляются в шагах 1.2.6 - 1.2.7. Вогнутая линза (используется для повторного collimate сходящийся пучок iSCAT) и на экране будут удалены позже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Микроскоп iSCAT. Схема показывает полностью собран iSCAT микроскопа. AR-покрытием обратной стороне splitter луча (70/30 BS) помечен красным. В зеленых предоставляются важные расстояния. (F) фокусные объективы используются обозначаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. Настройка дополнительных изображений каналов.
   Примечание: Этот раздел добавляет еще один изображений путь к микроскопу, что позволяет для наблюдения за большой окрестности iSCAT лазера через микроскопии светлые области и следить за жизнеспособность клеток через микроскопии флуоресцирования.
   1. Соедините выход источника света LED (примерно 500 Нм < < 580 Нм λ) в длинный работает цель NA расстояние 20 X / 0,4 и установить механические компоненты выше пример камеры, которые позволяют для фокусировки и боковых позиционирования вывода LED на Пример.
      1. Убедитесь, что индикатор выходной спектра возбуждения спектр маркер смерть клетки (пропидий йодидом (PI)) и не мешать его флуоресценции (λ > 600 Нм). При необходимости используйте светофильтры.
   2. Перемещение верхней цель боково, так, что верхняя (wide поле) и Нижняя (iSCAT) цели лежат. Это определяется размещение экрана под нижней цель и максимальной интенсивности Светодиодные света на экране. Место λ = 550 Нм короткий перевал дихроичное зеркало (манипулятор) для разделения передаваемых светодиодный свет от лазерного пути iSCAT.
   3. Разбить этот луч на два канала с 8% reflective/92% пропускающий пучка сплиттер (BS). 92% путь флуоресценции канала и 8% путь используется для светлые области изображения.
   4. Изображение ярко поле канал на КМОП камеры с помощью f = 5 см Дуплет ахроматические линзы.
   5. Изображение флуоресценции канал на отдельные камеры CMOS с помощью f = 5 см Дуплет ахроматические линзы и λ = 600 Нм Лонг-фильтр для блокирования возбуждения свет. На рисунке 4a показана схема полностью собранный микроскопа, включая все каналы изображения.

Рисунок 4: iSCAT микроскопии белков, выделяемый одиночных клеток. (a) схема микроскопа, указанных в протоколе. В разделе 1 для получения дополнительной информации. Сокращения: LED, Светодиодные; SPF, короткие-фильтр; obj, цель; Манипулятор, короткие перевал дихроичное зеркало; BS, splitter луча; LPF, Лонг-фильтр; БФ, ярко поле; Флуор, флуоресценции; C1-C3, Камера 1-3. (b) ярко поле изображение одного Laz388 клеток около 4 мкм от iSCAT поле зрения (изображены белый квадрат). Изображение, полученное с камеры C3, шкалы бар: 10 мкм. (c) флуоресценции изображение того же региона, показано в пункте (b) с позиции ячейки отмеченные белый круг. Отсутствие флуоресценции указывает, что ячейка является жизнеспособным. Изображение, полученное с камеры C2, шкалы бар: 10 мкм. (d) Raw iSCAT камеры изображения снимок с 80 МКС времени экспозиции. Изображение, полученное с камеры C1. (e) iSCAT изображение того же региона после вычитания пространственно-временных фон, как описано в разделе обсуждения. Изображение показывает шероховатость поверхности стекла coverslip и интегрированный над 1000 последовательных сырья кадры (d) с временем последнего кадра 400 мс. (f) корреспондент дифференциальной iSCAT изображение, которое показывает события привязки 2 белков на coverslip. Образ был построен путем вычитания двух последовательных отфильтрованного изображения (e). Масштаб баров в (d), (e) и (f): 1 мкм. Эта цифра была адаптирована из Макдональдс, м.п. и др. ¹⁶. Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. Настройте компьютер и программное обеспечение.
   1. Подключите все камеры к компьютеру. Установите соответствующие пакеты и получить записи программного обеспечения для их управления.
      Примечание: Подходящего оборудования необходимого для высокоскоростных приобретений. Как минимум рекомендовано многоядерный процессор, 16 ГБ ОЗУ, карт захвата кадра и твердотельных дисков для хранения данных.
   2. Соблюдать iSCAT изображение на КМОП-камера и убедитесь, что он находится в фокусе, находя остаточных частиц пыли или грязи на стекле coverslip. Убедитесь, что изображение частиц циркулярно симметричная точка распространения функция (PSF).
      Примечание: Основная причина циркулярно симметричный ПСФ является, что лазерный луч не вводите цель прямо, но под небольшим углом относительно оптической оси. Это исправляется, регулируя угол и положение падающего пучка с зеркалом соединение 45°.
   3. Сравните изображения камеры ярко поля и флуоресценции каналов. Убедитесь, что оба находятся в центре внимания и отображения той же области. Убедитесь, что позиция iSCAT лазер находится приблизительно в центре изображения и принять к сведению его позицию для последующего использования. Смотрите Рисунок 4б – 4f для типичных камеры изображения.
      Примечание: Используйте образец клеток или флуоресцентные бусины найти в центре внимания двух каналов. Временно удалите флуоресценции Лонг-фильтр для настройки системы. Фокус на обычных изображений клеток должен быть немного выше, чем iSCAT фокальной плоскости. Чтобы компенсировать это без перемещения цели, сместить камер со своих позиций в центре внимания двух соответствующих f = 5 см линзы.
   4. Установите параметры, необходимые камеры. Использовать фиксированный частоту и отключение средства усиления и коррекции программного обеспечения.
      Примечание: Используются следующие параметры: iSCAT камера установлена на 5000 кадров в секунду (fps) с временем экспозиции 80 МКС. Как упоминалось выше, размер изображения составляет 128 × 128 пикселей. Ярко поле и флуоресценции камеры работают на размер полного кадра (1280 × 1024 пикселей). Брайт поля изображений осуществляется с 20 мс временем экспозиции. Флуоресценции камера установлена на 750 мс время экспозиции, и 5 последовательных кадров накапливаются сформировать одно окончательное изображение. Брайт поле и флуоресценции изображения приобретают интервалы 20 s время.

2. Подготовка эксперимента

1. Подготовка среднего запасов микроскопии.
   1. Добавить 25 мл буферного раствора HEPES (1 моль/Л) до 975 мл среды RPMI 1640 получить окончательный 1 Л раствора 25 ммоль/Л HEPES. Кроме того использование буферной среды с HEPES уже включены.
      Примечание: HEPES используется для поддержания рН среды во время измерения в условиях окружающей среды (например, за пределами инкубатора и без постоянного снабжения CO₂ ).
   2. Возьмите Алиготе решения, необходимые для эксперимента и пусть оно теплое до комнатной температуры. 2 мл среднего является достаточным. Держите решение оставшихся запасов при 4 ° C.
2. Подготовьте Микроскоп кювет.
   Примечание: Следующие шаги описывают процедуру для держателя заказ образца, состоящий из алюминиевая пластина и акриловые кювет блюдо, которое устраняет coverslip и пары в пьезоэлектрической 3D позиционера. Может также использоваться коммерчески доступных стерильные культуры блюда с низа стекла.
   Примечание: На рисунке 5 показывает фотографии держателя образца под заказ.
   1. Возьмите новый coverslip микроскопии и промойте деионизованной воды (ди вода) и этанола. Воздух сухой слайд с азотом или сжатым воздухом.
   2. Чистый coverslip в атмосфере кислорода плазмы (0,3 мбар давление газа) для 10 мин на мощности 500 Вт. Это удаляет все органические примеси от поверхности.
   3. Очистите блюдо акриловые кювета, погружая его в 0,2 моль/Л раствора NaOH для приблизительно 10 минут промыть водой ди.
   4. Соберите держатель образца и накрыть пластиковой Петри блюдо пока необходимости в эксперименте.

Рисунок 5: держатель образца заказного. () образец держатель компонентов: (1) акриловые кювет блюдо; (2) алюминиевая пластина; (3) проведение винта; (4) Силиконовое уплотнительное кольцо; (5) coverslip. (b) в полностью собранном держатель образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. Подготовьте Микроскоп.
   1. Включите лазер освещения iSCAT, ярко поле/флюоресценцию освещение LED, камер и приобретение компьютера/программное обеспечение. Блокировать лазерный луч на позиции до цели.
   2. Убедитесь, что 100 X / 1,46 NA цель является чистым. Если нет, используйте объектив очистки салфетки и этанола для очистки цели в соответствии с рекомендациями производителя.
   3. Примените капли масла погружения на Микроскоп цели.
   4. Возьмите держателя образца (собраны в разделе 2.2) и тщательно смонтировать его на сцене пьезо iSCAT Микроскоп, так что coverslip образец центрируется на Микроскоп цели. Будьте внимательны и осторожны, чтобы не повредить объектива. Закрепите прибор пьезоэлектрический позиционер с пальца винты при одновременном обеспечении, указанные изготовителем, что не превышен максимальный крутящий момент.
   5. Добавьте 1 mL средних запасов микроскопии (подготовлен в разделе 2.1.) в кювете.
   6. Добавьте 2 капли пропидий йодидом пятно на носитель как клетки смерти маркер^16,22.
   7. Разблокировать лазер и привести систему в фокус. Во-первых убедитесь, что цель позиционируется на правильном расстоянии от coverslip, повторив шаги 1.2.3. -1.2.5. (Рисунок 2). Затем тонкой настройки фокуса с оси z пьезо стадии.
   8. Убедитесь, что все параметры для источников света, камеры и программное обеспечение установлены правильно. Это включает параметры мощности лазера, интенсивности светодиодный, камеры-частоту, время экспозиции камеры или программного обеспечения, сохранения пути.
      Примечание: Сохранение видео с высокой частотой кадров может производить большие размеры файлов. Обеспечить достаточно свободного дискового пространства на компьютере.
   9. Блокировать лазерный луч снова. Микроскоп теперь готов для эксперимента.
4. Подготовка клетки.
   Примечание: Laz388 клетки²⁰ культивируемых в среде RPMI 1640 с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), аминокислоты, пируват и антибиотиков. Клетки инкубируют при 37 ° C и 5% CO₂ и раскол и обеспечены свежие среднего каждые 2-3 дня²³.
   1. Принимать настой культуры клеток из инкубатора и аспирационная носитель, содержащий примерно 1 х 10⁶ клеток. Чтобы определить правильный объем, количественно концентрация культуры клеток с использованием Горяева.
   2. Mix решение клеток с 10 мл RPMI 1640 среды при комнатной температуре и Центрифугуйте образцы на 300 g x 7 мин.
   3. Тщательно извлечь и удалить супернатант обеспечивая, что гранулы концентрации клеток остается нетронутой.
   4. Повторите шаги 2.4.2. -2.4.3. с концентрированной Пелле клеток.
   5. Вновь приостановить клеток в среде фондовых микроскопии 0,5 мл (подготовлен в разделе 2.1.) и немедленно использовать их в качестве эксперимента.

3. iSCAT микроскопии секретирующих клеток

1. Убедитесь, что лазерный луч заблокирован для предотвращения клетки iSCAT лазерного света непосредственно подвергается.
2. Inject клетки в кювет образца.
   1. Inject приблизительно 3 мкл ячейки выборки (подготовленные в разделе 2.4.) слегка-центр в кювет образца. Нежно коснуться наконечник пипетки для coverslip и медленно вводить раствор ячейки. Позволяют клеткам поселиться на coverslip.
      Примечание: Используйте небольшой объем наконечники (10 мкл) или длинные, гибкие гель загрузки советы.
   2. Что обеспечивает плотность клеток ниже примерно 1 клетка за 500 µm² так, что измерения одной ячейки не под влиянием нескольких ячеек в окрестностях iSCAT лазер.
   3. Если количество клеток является слишком низкой, повторите шаг 3.2.1. до тех пор, пока достаточное количество доступных.
   4. Если освещение клеток является слишком густой, используйте инъекции приблизительно 20 мкл дополнительных микроскопии средних разойтись клетки через coverslip.
3. С помощью пьезо позиционер, переместите образец боково позицию ячейки рядом (приблизительно 10 мкм) к iSCAT поля зрения. Убедитесь, что ячейка не войти iSCAT поле зрения, как прямого воздействия на 445 Нм лазерного света могут быть вредны для ячейки.
4. Используйте светлые области и флуоресценции изображения найти и проверить жизнеспособность клеток²⁵.
   Примечание: Жизнеспособных клеток имеет круглую форму в светлые области изображения и не флуоресцентные, тогда как гибель клеток обозначается сильная флуоресценция сигналов, связанных с присутствием пропидий йодидом внутри клетки²².
5. Разблокировать iSCAT лазерный луч и убедитесь, что поверхность coverslip до сих пор в центре внимания. Заключите таблицы изоляции для сведения к минимуму дрейфа и акустические муфта от внешнего окружения.
   Примечание: Последний достигается с помощью оптических тяжелые шторы или акриловые панели вокруг таблицы оптики.
6. Начало измерения путем приобретения изображений с камер iSCAT, ярко поле и флуоресценции. Автоматизировать и управлять процессом через программное обеспечение для максимизации эффективности экспериментального. Периодически проверяйте жизнеспособность клеток и в центре внимания системы.
   Примечание: В зависимости от интенсивности лазера, оптические компоненты и параметры времени экспозиции камеры, может препятствовать iSCAT лазерной флуоресцентной камеры. Если наблюдается такое поведение, рассмотрим опалубки iSCAT лазер временно во время флуоресценции изображения приобретений.

4. анализ данных

Примечание: Экспериментальные данные по сути своей шумной, и iSCAT изображения ничем не отличаются. Существует несколько источников шума в типичной iSCAT измерения, включая искажения волнового фронта в инцидент источник света, шероховатость поверхности, coverslip, и шум камеры. В разделе ниже представлены некоторые способы, в которых будут устранены эти источники шума через пост-обработки. Кроме того боковые механические неустойчивостей установки приводят к зашумленных данных и должны решаться таким образом, как описано в разделе обсуждение ниже. Описанные анализы проводятся с помощью пользовательских сценариев MATLAB.

1. Минимизируйте шум камеры путем фильтрации исходных данных с помощью двумерных Фурье фильтра, который исключает высокой пространственной частоте. Размер фильтра необходимо скорректировать с учетом конкретных экспериментальных конфигурации (главным образом определяется числовая апертура системы).
   Примечание: Функции в изображении с высоких пространственных частот чем оптической системы из посторонних источников (таких, как шум считывания камеры) и можно пренебречь.
2. Преобразуйте изображения из камеры сырые графов iSCAT контраст.
   Примечание: Сигнал, обнаруженного камерой является . iSCAT контраст определяется как где является интенсивность света ссылку, в этом случае часть отражение coverslip, и помех между и интенсивности рассеянного ().
   1. Отдельный сигнал в и путем вычисления временной среднее особое кадры, в которых частицы интерес не присутствуют. Полученное изображение обеспечивает опорного сигнала .
      Примечание: в качестве альтернативы, активный фон вычитание шаг может выполняться как описано в описании ниже.
   2. Рассчитать контраст согласно ^12,14,16.
3. Создайте образ подвижного дифференциального путем вычитания каждого последовательных кадра от своего продолжателя.
   Примечание: Остаточные сигналы от шероховатости поверхности coverslip и искажений волнового фронта эффективно удаляются в этот шаг, как они являются постоянными в течение последовательных кадров. Прокатки дифференциальных удаляет эти остаточные сигналы, оставляя только белок привязок, которые происходят от одного кадра к другому. Этот динамический фон вычитания является полезным, как это не чувствительны к долгосрочным образца сугробы.
4. Примените пик ищет алгоритм для обнаружения и индексировать один частиц для каждого кадра и определить их конкретные контраст и позиции.
5. Используйте информацию, собранную на шаге 4.4 для создания гистограммы белка привязки событий и касаются их извлеченные контрасты массы белка через калибровочной кривой, скомпилированные из известных белков образцы^14,24.

Результаты

Схема iSCAT микроскопа показан на рисунке 4a. Представитель ярко поле, флуоресценции и сырых iSCAT изображения показаны в рисунке 4В, 4 cи 4 d, соответственно¹⁶. Рисунок 4e и 4f показывают результаты удаления фона и дифференциального пост-обработки; два адсорбированных белки являются видимыми как пятна дифракционный Рисунок 4f. На рисунке 6 показана гистограмма белков, обнаруженных в течение 125 s. Эти данные были получены путем применения алгоритма, пик ищу отснятые изображения для подсчета событий привязки и каталог их контраст¹⁶. Общее количество 503 белков были обнаружены.

Далее, секретируемые видов идентифицируются по сравнению с ссылкой измерений, произведенных на очищенный протеин решений или посредством дополнительных измерений с функционализированных стеклянных поверхностей^14,16. Таким образом, iSCAT данных, непосредственно визуализировать сотовой секрецию динамика на шкале обеспечивается¹⁶. В качестве примера мы нашли ранее IgG антитела являются крупные фракции Laz388 secretome и выпустили из клетки в размере около 100 молекул за второй¹⁶. Кроме того другие частицы, охватывающих широкий спектр 100 кДа - 1000 кДа выделяемый клетки¹⁶. Описан метод может быть далее занятых например, расследовать Пространственный градиент концентрации выделениями, окружающие клетки¹⁶, или для определения временной динамики лизис клеточных¹⁶.

Рисунок 6: количественная оценка секретируемые белки на одну ячейку Laz388. Гистограмма показывает обнаруженные белков во время периода времени 125 s. контраста, значения накапливаются в 1 x 10^-4 контраст бункеров (синие столбики). Во время этого измерения насчитали всего 503 индивидуальных белков. Эксперимент был повторен в 10 раз с аналогичными результатами. Эта цифра была адаптирована из Макдональдс, м.п. и др. ¹⁶. Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Одним из наиболее важных аспектов для получения полезных iSCAT данных является возможность найти правильное положение фокуса на coverslip поверхности и, Кроме того, удерживайте эту позицию в течение длительных периодов времени. Неспособность сделать это приведет к расширенной PSFs, слабый iSCAT сигналов и дрейф связанных артефактов в анализе динамики. Оказывается, что нахождение фокальной плоскости на чистой, голые coverslip поверхность не является непростой задачей как особенности поверхности не видно на фоне пучка большой ссылки (см. Рисунок 4 d).

Сырые iSCAT изображения часто закрывались фон сигналы, которые возникают от волнового фронта примесей в источник возбуждения и может затруднить способность найти правильный изображений плоскости. Активные волновому вычитания является полезным способом обойти эту проблему и впоследствии контролировать iSCAT фокус во время измерения¹⁶. Один из способов добиться этого — через образца пространственной модуляции. Короче говоря функции генератора применяет 50 Гц квадратные волны к порту внешнего контроля пьезо стадии, что привело в образце spatial модуляции с прикладной частотой (амплитуда 290 Нм). Синхронные камеры приобретений инициируются из того же источника и, когда комбинированные через замок в принципы, результат в^14,компенсацию волновому изображение¹⁶. Полученное изображение обычно показывает шероховатость поверхности coverslip (Рисунок 4e). Малые функции, оставаясь на стекле после очистки может использоваться для приведения микроскопом в фокус. Параметры, используемые для этого шага вычитание активных фона могут быть изменены согласно частота кадров, времени экспозиции или оборудования.

Как упоминалось выше, рекомендуется использовать высокое качество пучка сплиттер в iSCAT setup (шаг 1.2.1.), как изображений артефакты как ореолы или вмешательства, вытекающих из тонких плоских пучка сплиттер будут влиять на изображение и мешать измерения. Рисунок 7 показывает сравнение между высокого качества и низкого качества пучка сплиттер. Оба изображения raw iSCAT показывают того же района на coverslip, содержащая некоторые остаточных частиц. Те же установки iSCAT был использован для захвата изображений, обменялись только splitter луча. 7а Рисунок показывает изображение формируется на камеру с помощью толще (5 мм), AR-покрытием и клиновидные пучка сплиттер. Благодаря вклинивается дизайн отраженного луча от задней поверхности splitter луча анти параллельной к рефлексии, вытекающих из передней поверхности и не вступает в цель. Происходят без вмешательства артефактов. Рисунок 7b показывает же поле зрения на образце, но на этот раз тоньше splitter Вселенский луча (1 мм) был использован. Два отражения от передней и задней поверхностей splitter луча параллельны и распространять на камеру. Хорошо видны артефакты вмешательства.

Рисунок 7: сравнение iSCAT изображений производится с высокого и низкого качества пучка сплиттер. () результирующий сырье iSCAT образ с использованием 5 мм толщиной, AR-покрытием и клиновидные пучка сплиттер. (b) результирующий образ сырье iSCAT той же площади с использованием 1 мм толщиной Вселенский пучка сплиттер. Оба пучка сплиттер имеют же коэффициент разделения (50% отражения, передача 50%). Вмешательство артефакты, возникающие от отражения Френеля четко прослеживается в создаваемые с 1 мм толщиной Вселенский пучка сплиттер изображения. Масштаб бары: 2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В этом протоколе мы описываем схему освещения поля для iSCAT, как это быстро, легко понять и позволяет для параллельных зондирования над большой площади¹⁴. Другой распространенный подход — использовать акустооптические дефлекторы (крыльчатках) и сканирование конфокальный пучка через образец^12,17. Этот подход позволяет избежать необходимости для wavefronts высокого качества но экспериментально более сложным, чем обычные-поля изображений. Кроме того, что крыльчатках ограничивается скорость конфокальный освещения. В зависимости от желаемого экспериментальные параметры либо конфокальный или поля освещение схемы можно в принципе, использовать для определения единого белков, выделяется из живых клеток.

Как обсуждалось на протяжении протокол, важно свести к минимуму боковое механические колебания в стадии образца микроскопа. Даже нанометра отклонения в положении образца может привести к вариации в рамках последовательных камеры и вызвать значительные посторонний шум в изображении дифференциальной. Поэтому рекомендуется использовать механически стабильной микроскопа и затуханием таблицы оптики (шаг 1.1.1.) и для покрытия установки с оптическим шторы или панелей во время эксперимента (шаг 3.5.).

Схемы стабилизации активный фокус может также рассматриваться для долгосрочных измерений. В этом подходе второй лазер включены в Микроскоп в механизме полного внутреннего отражения (МДП) и впоследствии образы на фотодиод квадранта. Изменения в системе в фокусе перевести на боковые смещения МДП лазерного пятна на квадранте диод, который затем может использоваться в цикле активной обратной связи для управления z-axis пьезо этап²⁶. Таким образом устраняются долгосрочные эффекты вертикальное смещение.

В представленных технику для удовлетворения конкретных потребностей экспериментальный может применяться несколько модификаций и расширений. Например, доступны коммерческие микроскоп этапа инкубаторы, легко могут быть включены в iSCAT микроскоп для долгосрочное изображений клеток. Другие методы также могут осуществляться в дополнение к iSCAT визуализации, такие как конфокальный или МДП флуоресценции microscopies¹⁷. Для адаптации системы под исследование, iSCAT секреции, что измерения может осуществляться в других средствах массовой информации клетки например DMEM или DPBS, однако, фенола красный индикатор рН следует избегать как это может нарушить эксперимент вследствие поглощения лазерного света. Кроме того добавки, как плода телячьей сыворотки (FCS) или человека тромбоцитов lysate (hPL) содержат белки, которые могут помешать iSCAT обнаружения. В зависимости от желаемого чувствительность эксперимента эти добавки должны быть исключены из среднего микроскопии.

iSCAT опирается на способность аналита рассеивают свет — свойство, которое является неотъемлемым элементом всех белков — и таким образом по сути неспецифические. Тем не менее некоторые степень конкретности возможен как шкала сигналов iSCAT линейно с белком массового^14,27,28. Это позволяет для калибровки iSCAT системы, используя образцы стандартных протеина, например бычьим сывороточным альбумином (БСА) и фибриногена^14,27,28. В самом деле, совсем недавно, молодых и др. ²⁸ распространились по работе Piliarik и Sandoghdar¹⁴ и показали, что iSCAT может использоваться для определения низкомолекулярных белков, как малые, как стрептавидина (53 кДа) с разрешением массового 19 кДа и с точностью около 5 кДа. Далее несколько обычных подходов может дополнять iSCAT, обеспечивая дополнительный уровень конкретности. Как пример, энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА), и/или других поверхностных модификаций, ограничить события привязки, так что только целевой белок является белок обнаружен¹⁶.

В этом протоколе мы описали, как iSCAT микроскопии могут быть использованы расследовать сотовой выделениями на уровне одного белка с обеспечивается временное разрешение¹⁶. Техника является общим и могут быть реализованы для любой коммерческой или построил дом микроскопа. В отличие от одной молекулы флуоресценции подходы метод не страдают от Фотообесцвечивание или мигает эффекты, но она по-прежнему достигает одного белка чувствительность. Эти особенности делают iSCAT мощный инструмент в области biosensing и микроскопии. Будущих приложений будет сосредоточена на разъяснение сложных сотовой взаимодействиями, такими как иммунологический ответ на раздражитель или сотовой связи.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item/Device
100x / 1.46 NA objective	Zeiss	420792-9800-000	alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objective	Leica	566049	N Plan
Piezo Stage	PI	P-517k020	3-axis stage with 100x100x10µm range
Diode laser (445 nm)	Lasertack	PD-01236
Optics/Optomechanics	Thorlabs/Newport	-	lenses, mirrors, posts, mounts
Pinhole	Thorlabs	P30H
LED light source	Thorlabs	MCWHL5
Shortpass filter (580 nm)	Omega Optical	580SP	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
Longpass filter (500 nm)	Thorlabs	FEL0500	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
70R/30T beam splitter	Newport	20Q20BS.1
Economy beam splitter	Thorlabs	EBS1	used for the comparison of fringe effects
Wedged plate beam splitter	Thorlabs	BSW26	used for the comparison of fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm)	Edmund Optics	66249
8R/92T beam splitter	Thorlabs	BP108
CMOS camera	Photonfocus	MV1-D1024E-160-CL	for iSCAT aquisition
CMOS cameras	Mightex	SCE-B013-U	for bright field / fluorescence aquisition
Longpass filter (600 nm)	Thorlabs	FELH0600
Computer	Fujitsu Siemens	-	Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD
Acquisition Software	LabVIEW	-	LabVIEW 2016 Suite
Analysis Software	Matlab	-	Matlab 2014 Suite
Plasma Cleaner	Diener	Diener pico
Incubator	Binder	Model CB
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Reagent/Material
RPMI 1640 medium	Gibco	11835063	without phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Sigma Aldrich	59205C
Cover slides	Marienfeld	107052
Glass bottom culture dishes	ibidi	81158
Fluorescent Microspheres	Invitrogen	F8821	used for calibration
Immersol immersion oil	Zeiss	444960
Propidium iodide stain	Invitrogen	R37108
Small pipette tips	Eppendorf	30075005
Flexible pipette tips	Eppendorf	5242956003
Ethanol, 99.8%	Fisher Scientific	E/0650DF/15
Sodium hydroxide, pellets	Sigma Aldrich	221465	for preparing 0.2M NaOH solution