一种新的三维打印解光矩阵处理方法

摘要

该协议描述了用于结构组织工程结构三维打印的嵌入聚乳酸 (pla) 微球的聚己内酯 (pcl) 长丝的生产。

摘要

3d 生物冲洗的目的是创建自定义脚手架, 生物活动, 并适应所需的大小和几何形状。热塑性主干可以提供类似于原生组织的机械稳定性, 而生物制剂则为祖细胞提供合成线索, 导致其迁移、增殖和分化, 从而重建原始组织/器官^1,2。不幸的是, 许多3d 打印兼容的生物可吸收聚合物 (如聚乳酸, pla) 打印在210°c 或更高的温度-不利于生物制剂的温度。另一方面, 聚己内酯 (pcl) 是一种不同类型的聚酯, 是一种可生物吸收的3d 打印材料, 打印温度较温和, 为65°c。因此, 假设热保护 pla 屏障中的脱光细胞外基质 (dm) 可以在 pcl 长丝中打印并保留在其功能构象中。在这项工作中, 骨软骨修复是测试该假设的应用。因此, 猪软骨被去细胞化并封装在聚乳酸 (pla) 微球中, 然后用聚己内酯 (porcine) 挤压成长丝,通过熔融沉积建模产生三维结构。对具有或不具有微球 (pla-dmcl 和 pcl (-)) 的结构进行了表面特征差异的评估。

引言

目前用于临床应用的组织工程技术, 如骨骼、软骨、肌腱和韧带重建, 使用自体和同种异体移植修复受损组织。在临床实践中, 每种技术都是作为 "黄金标准" 进行常规的, 首先从患者或尸体匹配中采集供体组织, 然后将供体组织放入缺陷部位²。然而, 这些策略受到捐献者部位发病率、供者部位因缺陷严重、感染风险以及难以找到符合所需几何形状的移植物的限制。此外, 研究表明, 与原生组织3相比, 用于重建的同种异体移植降低了机械和生物特性.考虑到这些因素, 组织工程师最近转向三维 (3d) 生物冲洗, 以产生自定义的, 复杂的几何形状, 生物活性和设计, 以适应缺陷的大小和形状, 同时提供足够的机械性能, 直到生物重塑完成。

理想情况下, 3d 打印的支架将由一个聚合物主干组成, 可以保留原生组织所需的机械稳定性, 而整合的生物制剂则为周围的细胞提供生化线索, 从而导致细胞的迁移、增殖、分化和组织生产^2,5。不幸的是, 大多数含有生物成分的结构都是用凝胶或聚合物制成的, 这些凝胶或聚合物太弱, 无法承受目标组织在自体同种异体移植重建中所经历的体内力量。其他聚合物, 如聚乳酸 (pla) 是生物可吸收的, 3d 可打印和结构健全, 但在210°c 或以上的温度下印刷, 使生物制剂在制造过程中不可能共印。聚己内酯 (pcl) 是另一种 fda 清除、生物可吸收的聚合物, 可在较低的温度 (65°c) 下进行3d 打印, 在制造具有复杂形态的复杂形态^{5, 6 的}患者专用植入物方面越来越受欢迎 ^,7,8,9。然而, 大多数使用气动技术的生物打印机使得在生物活动不会受到损害的较低温度下打印 pcl 是不可能的。到目前为止, 这些聚合物与自体同种异体移植的整合到一种新的可打印生物材料中的工作尚未完成。在没有这种材料的情况下, 不可能采用真正的组织工程方法进行组织重建。因此, 我们试图将 pla、pcl 和脱核同种异体移植基质 (dm) 结合起来, 利用每种材料的优势, 以制造出能够重建复杂组织的可行结构。这一过程将提供抵抗体内力所需的初始机械强度和热稳定性, 以适应在诱导所需组织形成的结构中的添加剂制造。

在最近的一次尝试中, 我们表明, 将脱细胞化的软骨细胞外基质封装在一个热保护的 pla 屏障中是可行的, 可以在 pcl 细丝中挤出, 从而保持dm 影响周围宿主细胞²。这激励我们寻求临床上有效的组织重建方法。在目前的研究中, 我们利用平台技术构建了包括 pla、dm 和 pcl (pla-dmcl) 在内的一体机支架。

我们的目标是提高同种异体移植的有效性和效用, 使用提出的新生物制备技术, 更准确地重述原生组织, 最终将其用于各种应用。

研究方案

1. 微球的获取和预处理

1. 生产具有所需矩阵封装 (pla-dm)²的微球。
   注: 微球必须是均匀的大小。因此, 在使用前筛过微球是必不可少的。虽然在以前的出版物²中详细介绍了矩阵去电磁化和封装, 但下文对这一过程作了简要总结。
   1. 首先, 从猪后肢收获软骨塞。用0.05% 的胰蛋白酶 0.5 mm 乙二胺四乙酸 (edta)、dulbecco 改性老鹰培养基 (dmem)、1.5% 过氧乙酸和 2.0% triton x-100, 每次4个用蒸馏水清洗, 对软骨进行解码之前和之后的每个步骤²。
   2. 排出去细胞化的基质, 冷冻它, 冻干, 研磨, 并溶解成胃蛋白酶溶液。溶解后, 将胃蛋白酶溶液与已溶解在二氯甲烷中的聚乳酸混合。
   3. 将混合物滴入水溶液中3% 的聚乙烯醇中。将产生的微球再次离心、冲洗、排水和冻干。
      注: 有关该过程的详细信息, 请参阅以前发布的协议²。
2. 筛微球。
   1. 确保所有筛板在使用前都已彻底清洁并干燥。如有必要, 使用超声波清洗机清洁筛子, 以确保从筛子中取出所有球体。
   2. 将筛面振动台与顶部的106微米筛盘、后的53μm 托盘和底部的筛盘组装。
   3. 将干燥的微球放在最上面的筛盘上, 并将盖子放在顶部的托盘上。将粗筛分打开 8 ~ 10分钟, 在精细上重复 8 ~ 10分钟。
      注: 根据批次的不同, 可能需要增加或减少筛子时间。
   4. 小心地将筛板一个接一个地取出, 并将其倒置在一张大称重纸上。轻轻轻触两侧, 以确保大部分球体已从筛子中掉落并落在纸上。
   5. 丢弃超大球体 (& gt;106 微米) 和超小球体 (& lt;53)。将大小在53至106微米范围内的球体添加到带有类型和批号的标记离心管中, 然后放置在-20°c 的冰柜中, 直到进一步使用。

2. 微球质量控制评估

注意: 请参见图 1。

1. 进行宏观视觉评估, 以检查微球是否均匀、球形, 且不存在聚集体。
2. 使用扫描电子显微镜 (sem) 评估微球。
   1. 为此, 使用厚度为4纳米的溅射涂布机, 将微球放置在 sem 卡盘和溅射涂层上, 并在氩大气中使用金钯。
   2. 使用10kv 加速电压和 10 mm 工作距离观察微球的表面特征、形态和直径, 以确保微球的生产和筛分成功。

3. 3d 打印的长丝创建

1. 测量和记录从步骤2和3获得的微球的质量;至少需要25克。
2. 在微球中加入聚己内酯 (pcl) 粉末, 微球的重量比为 1:4, 与 pcl 的重量。
3. 在20分钟的时间里将粉末混合物混合在微型滚动搅拌机上 5分钟, 然后翻转容器, 在20转/分混合 5分钟 (见图 2)。
4. 许多市售挤出机 (见材料表) 都有绝缘护套, 因为它们的预期工作温度适用于传统的熔融沉积造型 (fdm) 细丝。通过拆卸绝缘材料 (如有必要) 并与台式机风扇 (将周围空气吹到挤出机上和挤出长丝) 结合使用, 对挤出机进行修改 (如有必要), 以便在较低的温度下使用挤出机。
   注: 台式机风扇吹周围空气冷却挤出机和灯丝是有用的这一过程。
5. 设置挤出设备的设置。请参见图 3。
   1. 设置挤出机, 使其出口从入口到后台处理器的出口约60厘米, 从挤出口到后台处理器入口的直接路径。
      注: 如果发现灯丝下垂到接触工作台的程度, 可以选择将后台处理器从工作台抬起3-4 英寸。
   2. 将台式机风扇放置在距离加热护套约15厘米的位置, 并将其定向到加热护套, 以便在整个灯丝生产过程中提供环境空气冷却。将第二个冷却风扇放置在挤出机和线轴之间的中间, 并将其定向到挤出体, 以帮助用环境空气冷却灯丝。
   3. 在整个过程中根据需要调整定位。
6. 将改进后的挤出机加热元件设置为 52°c, 打开台式机冷却风扇, 使仪器达到平衡 20至30分钟. 确保将适当的喷嘴连接到挤出机上。
7. 就在开始之前, 用步骤3.3 中的微喷/pcl 混合物填充挤出机料斗。打开线轴和挤出机, 开始挤压长丝。
8. 当最初的长丝被挤压时, 用钳子手动将挤出物从挤出出口拉出, 并将其送入灯丝后台处理器。
9. 所需的灯丝需要一些时间才能从后台处理器中出来。使用单独的线轴或胶带, 清楚地标记时, 灯丝成分视觉上显示均匀。
10. 密切监控流程, 并根据需要修改参数。调整挤出机温度、挤出螺旋速度和螺柱转速, 以获得由卡钳测量的 1.75 mm 直径长丝。根据需要调整风扇, 使灯丝适当冷却, 以避免非圆灯丝横截面。必要时混合和灌装料斗。
    注: 在此过程中需要密切关注, 以获得足够的灯丝, 用于后续的3d 打印。上述参数将根据环境条件、料斗中混合物的填充水平和均匀性以及 pcl 和微球特定批次的热力学和流动动力学而变化。
11. 继续挤压, 直到所有的粉末都已使用, 料斗几乎是空的。在料斗中加入 pcl 粉末 (不含微球), 以冲洗出目前在挤出机中的微球混合物。继续将 pcl 粉末添加到料斗中, 直到挤出物中看不到更多的微球。
12. 一定要在所需浓度的浓度下标记和分离含有微球的灯丝, 因为在灯丝冷却后, 很难区分均匀的长丝和不均匀的长丝。
13. 继续挤出, 直到料斗中留下最小的粉末, 然后关闭后台处理器、挤出机螺旋、挤出机加热元件和风扇。

4. 用长丝印刷

1. 使用计算机辅助设计软件设计所需形状和形状的几何图形。然后使用与所使用的3d 印刷机兼容的切片软件对模型进行切片并指定刀具路径。
2. 将细丝从步骤3加载到任何标准的 fdm 打印机上, 并配有所需直径 (通常为 0.4 mm) 的标准喷嘴。开始打印 (通常以65-70°c 和300mm/min 线性速度), 因为定制的长丝是由机器逐层沉积的。
3. 请务必特别注意第一层, 并根据需要调整设置, 以获得高质量的打印。
   注: 可对打印速度、打印温度、平台温度、挤出倍增器和其他参数进行调整。有关进一步的帮助, 请参阅打印机和切片制造商的故障排除指南。

5. 质量控制评估

1. 使用厚度为 4 nm 的溅射涂布机, 将印刷结构放置在 sem 夹头和喷水层与金钯的氩大气中。
2. 在显微镜下观察使用10kv 加速电压和10毫米工作距离, 以检查表面特征, 并在适用的情况下检查微球的存在或不存在。

6. 印刷结构的功能测试

注: 碱性磷酸酶 (alp) 可作为脱病毒基质的替代品, 以确定在长丝生产过程后包封蛋白是否具有生物活性。alp 的使用是因为它催化了来自底物对硝基苯磷酸的反应, 使其从无色副产品转变为黄色副产品、对硝基苯酚和无机磷酸盐, 但前提是 alp 处于功能构象中。

1. 使用与 pla-dmp-pcl 支架相同的打印参数, 使用 alp 微球长丝 (pla-alpp/pcl) 打印端部质量至少为400毫克的几何。此外, 还打印与 pla-alpp/pcl 支架几何形状相同的仅 pcl (pcl (-) 支架。将它们浸入1毫升的 rris-hcl 缓冲液中, 在37°c 和110转分旋转时孵育 24小时, 以实现酶的扩散。
2. 在 Tris-HCl 中加入 1 mgml 对硝基苯磷酸酯、六水二钠, 在37°c 时补充 110 rpm, 再延长 10 h. 阅读415纳米的上清吸收剂。

结果

筛分后, 微球应显得均匀, 不受集料的影响。在 sem 下, 被筛过的微球表面可能有小毛孔, 但在其他方面会呈球形和光滑, 如图 1所示。所有挤压细丝应具有均匀的直径和圆形截面。含有微球 (pla-dmp) 的长丝将有一个稍微更多的哑光完成, 而只有 pcl (-) 长丝看起来更有光泽。pla-dmp-pcl 长丝也会比 pcl (-) 长丝更粗糙。脚手架应打印在所需的几何形状, 这是由?...

讨论

脱弹基质和3d 打印 pcl 支架都已独立显示, 可以允许细胞粘附和增殖, 从而验证它们在骨软骨修复^10、11、12中的用途。在最近^{的 2,}3, 14, 15, 在工程方法中使用去细胞化矩阵进行组织修复一直是一个非常感兴趣和成功的课题。我们以前?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sieve machine	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Pure
Sieve 90 um	Fisherbrand	170328156	No. 170
Sieve 53 um	Fisherbrand	162513588	No. 270
Sieve 106 um	Fisherbrand	162018121	No. 140
Sputter coater	Leica	n/a
Scanning Electron Microscope	Hitachi, USA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot Spooler	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010023
6" Fan	Comfort Zone, Amazon	n/a
Ultrasonic Water Bath	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	n/a
Drum Mixer	Custom made	n/a	Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
Micro Balance	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	n/a
SolidWorks	SolidWorks	n/a
Microspheres	Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission
p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate	Millipore	4876-5GM
Phosphatase, alkaline	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
Absorbance Reader	Tecan	Sunrise
Tris-HCl Buffer	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
Heated shaker	New Brunswick Scientific	Excella E24