Processo innovativo per la stampa 3D Decellularized matrici

Riepilogo

Questo protocollo descrive la produzione di filamenti di policaprolattone (PCL) con microsfere di acido (PLA) incorporato polilattico che contengono matrici decellularizzate (DM) per la stampa 3D del tessuto strutturale ingegneria costrutti.

Abstract

3D multimateriali mira a creare personalizzate impalcature che sono biologicamente attivi e ospitare la dimensione desiderata e la geometria. Un backbone termoplastico in grado di fornire stabilità meccanica simile a tessuto nativo mentre agenti biologici offrono spunti compositivi di cellule progenitrici, che conduce alla loro migrazione, proliferazione e differenziazione di ricostituire i tessuti originali / organi^1,2. Purtroppo, molti compatibile di stampa 3D, polimeri bioriassorbibili (come l'acido polilattico, PLA) sono stampati a temperature di 210 ° C o superiore - temperature che sono dannose per farmaci biologici. D'altra parte, policaprolattone (PCL), un diverso tipo di poliestere, è un bioriassorbibili, 3D materiale stampabile che ha una temperatura di stampa più delicata di 65 ° C. Di conseguenza, è stato supposto quello tabella extracellulare decellularizzato (DM) contenuto all'interno di una barriera PLA termicamente protettiva potrebbe essere stampato all'interno del filamento PCL e rimangono nella sua conformazione funzionale. In questo lavoro, osteocondrali riparazione era l'applicazione per cui l'ipotesi è stata provata. Come tale, cartilagine suina era decellularized e incapsulata in acido polilattico (PLA) le microsfere che poi sono state estruse con policaprolattone (PCL) nel filamento per produrre costrutti 3D tramite fusa modellazione a deposizione. I costrutti con o senza le microsfere (PLA-DM/PCL e PCL(-), rispettivamente) sono stati valutati per le differenze nelle caratteristiche della superficie.

Introduzione

Attuali tecniche di ingegneria tessutale per applicazioni cliniche come la ricostruzione dell'osso, della cartilagine, tendineo e legamentoso utilizzano auto - e allotrapianti per riparare il tessuto danneggiato. Ognuna di queste tecniche viene eseguita ordinariamente come "gold standard" nella pratica clinica di prima raccolta del tessuto donatore dal paziente o una corrispondenza cadaverica e poi mettendo il tessuto del donatore nel difetto sito². Tuttavia, queste strategie sono limitate dalla morbilità del sito donatore, scarsità di sito donatore per grandi difetti, rischio di infezione e di difficoltà a trovare gli innesti che corrispondono la geometria desiderata. Inoltre, gli studi hanno indicato che allotrapianti utilizzati per la ricostruzione hanno ridotto proprietà meccaniche e biologiche quando confrontate con tessuto nativo³. Con queste considerazioni in mente, gli ingegneri del tessuto recentemente sono rivolti a tre dimensionale multimateriali (3D) per produrre geometrie personalizzate, complessi che sono biologicamente attivi e progettato per ospitare difetto dimensione e forma, fornendo sufficiente Proprietà meccaniche fino al completamento rimodellamento biologico.

Idealmente, un'impalcatura 3D-stampato consisterebbe in una catena polimerica che può mantenere la necessaria stabilità meccanica del tessuto nativo mentre il biologics incorporato offrono segnali biochimici circostanti cellule, conducente alla loro migrazione, proliferazione, differenziazione e tessuto produzione^2,5. Purtroppo, maggior parte dei costrutti contenenti componenti biologici sono fatti con gel o polimeri che sono troppo deboli per resistere alle forze in vivo sperimentati dai tessuti mirati per la ricostruzione di auto/del documento non autografo. Altri polimeri quali acido polilattico (PLA) sono bioriassorbibili, 3D stampabili e strutturalmente suono, ma vengono stampati a temperature pari o superiore a 210 ° C - rendendo impossibile per biologics di essere co-stampato durante la fabbricazione. Policaprolattone (PCL) è un altro polimero bioresorbable autorizzato dal FDA, che può essere stampato ad una temperatura più bassa (65 ° C), che è diventato sempre più popolare nel fabbricare paziente-specifici impianti con morfologie complesse^{5,6 3D ,7,8,9}. Tuttavia, la maggior parte bioprinters utilizzando la tecnologia pneumatica rendono impossibile per la stampa PCL a temperature più basse dove attività biologiche può rimanere illeso. Ad oggi, l'integrazione di questi polimeri con auto/allotrapianti in un romanzo biomateriale stampabile deve ancora essere realizzato. In assenza di tale materiale, è improbabile un approccio vero tessutale per la ricostruzione dei tessuti. Pertanto, abbiamo cercato di combinare PLA, PCL e decellularized matrici dell'allotrapianto (DM) di utilizzare i vantaggi di ogni materiale per produrre un costrutto vitale capace di ricostruire tessuti complessi. Questo processo avrebbe fornito l'iniziale resistenza meccanica necessaria per resistere a forze in vivo e la stabilità termica per ospitare la produzione di additivi in un costrutto che induce la formazione del tessuto desiderato.

In un recente tentativo di affrontare gli ostacoli di cui sopra, abbiamo dimostrato che è fattibile per incapsulare matrice extracellulare della cartilagine decellularizzati all'interno di una barriera PLA termicamente protettiva che può essere estruso all'interno di filamenti PCL, mantenendo la capacità di DM di influenzare circostante host celle². Questo ci ha ispirato a cercare approcci clinicamente efficaci per la ricostruzione dei tessuti. Nello studio corrente, utilizziamo la tecnologia di piattaforma per costruire impalcature di all-in-one che includono PLA, DM e PCL (PLA-DM/PCL).

Il nostro obiettivo è di migliorare l'efficacia e l'utilità dei documenti non autografo utilizzando la tecnica proposta biofabrication romanzo di ricapitolare più accuratamente tessuto nativo, per poterli utilizzare in definitiva in varie applicazioni.

Protocollo

1. ottenere e microsfere di pre-elaborazione

1. Microsfere di produrre con la matrice desiderata incapsulato (PLA-DM)².
   Nota: È fondamentale che le microsfere sono di dimensione uniforme. Per questo motivo, la setacciatura di microsfere prima dell'uso è indispensabile. Anche se l'incapsulamento e decellularizzazione di matrice sono stati dettagliati in precedenti pubblicazioni², segue un breve riassunto del processo.
   1. In primo luogo, raccogliere tappi di cartilagine da porcini arti posteriori. Decellularize la cartilagine in una serie di lavaggi con 0.05% tripsina/0,5 mm tetrasodio l'acido etilendiamminotetracetico (EDTA), Dulbecco modificato dell'Aquila acido peracetico medium (DMEM) e l'1,5% e 2,0% Triton X-100 per 4 h ogni con lavaggi di acqua distillata prima e dopo ogni passaggio².
   2. Drenare la matrice decellularizzata, congelarlo, lyophilize, macinare e sciogliere in soluzione di pepsina. Dopo dissoluzione, miscelare la soluzione di pepsina con PLA, che è stato sciolto in diclorometano.
   3. Aggiungere goccia a goccia la miscela in un 3% di alcol polivinilico in soluzione acquosa. Centrifugare le microsfere risultante, risciacquo, scarico e lyophilize nuovamente.
      Nota: Per maggiori dettagli sul processo di vedere il protocollo precedentemente pubblicato².
2. Passare al setaccio le microsfere.
   1. Assicurarsi che tutte le piastre da setaccio sono stati accuratamente pulite e asciutti prima dell'uso. Se necessario, pulite setacci utilizzando ultrasuoni pulitore per garantire che tutte le sfere vengono rimossi dal setaccio.
   2. Assemblare l'agitatore del setaccio con il vassoio di setaccio 106 µm nella parte superiore, il vassoio di µm 53 dopo che e il setaccio pan nella parte inferiore.
   3. Posizionare le microsfere asciutte nel cassetto del setaccio più in alto e posizionate il coperchio sul vassoio superiore. Accendere di vagliatura grossolana per un minimo di 8 a 10 Ripetere il bene per 8 a 10 min.
      Nota: I tempi di setaccio potrebbero essere necessario essere aumentato o diminuito a seconda del batch.
   4. Con attenzione rimuovere le piastre di setaccio uno e posizionarli capovolti su una carta di grande peso. Toccare i lati delicatamente per garantire che la maggior parte delle sfere sono caduti fuori il setaccio e sulla carta.
   5. Gettare le sfere di grandi dimensioni (> 106 µm) e sfere sottodimensionati (< 53 µm). Aggiungere sfere che sono nell'intervallo di dimensioni di 53 a 106 µm in una provetta da centrifuga con etichetta con il numero di batch e tipo poi posto in un congelatore a-20 ° C fino al successivo utilizzo.

2. controllo di qualità microsfere valutazioni

Nota: Vedere la Figura 1.

1. Effettuare la valutazione macroscopica e visual per verificare che le microsfere sono uniformi e sferico, con non aggregati presenti.
2. Valutare le microsfere utilizzando un microscopio elettronico a scansione (SEM).
   1. Per questo, microsfere di posto su un SEM chuck e polverizza cappotto con oro-palladio in atmosfera di argon utilizzando una macchina a polverizzazione ad uno spessore di 4 nm.
   2. Osservare le caratteristiche della superficie, morfologia e diametri di microsfere utilizzando un 10 kV accelerando la tensione e una distanza di lavoro di 10 mm per garantire che la produzione e setacciatura delle microsfere è stata completata.

3. filamento creazione per la stampa 3D

1. Misurare e registrare la massa di microsfere ottenute da passaggi 2 e 3; è necessario almeno 25 g.
2. Aggiungere polvere di policaprolattone (PCL) alle microsfere per un rapporto di peso 1:4 di microsfere a PCL.
3. Mescolare la miscela di polveri su un mixer di rotolamento in miniatura a 20 giri/min per 5 min poi capovolgere il contenitore e mescolare a 20 giri per altri 5 minuti (Vedi Figura 2).
4. Molti estrusori disponibili in commercio (Vedi la Tabella materiali) hanno giacche isolante perché loro temperature di esercizio previsto sono per filamenti (FDM) di modellazione a deposizione fusa tradizionale. Modificare l'estrusore (se necessario) rimuovendo il materiale isolante e utilizzarlo in combinazione con ventole del computer desktop (che soffiano aria ambiente sul estrusore e filamento estruso) utilizzare dell'estrusore a temperature più basse.
   Nota: Ventole del computer Desktop che soffiano aria ambiente per raffreddare l'estrusore e il filamento sono utili per questa procedura.
5. Installazione l'installazione di attrezzature per l'estrusione. Vedere la Figura 3.
   1. Setup dell'estrusore in modo che il suo emissario è ~ 60 cm dall'ingresso allo spooler, con un percorso diretto dalla presa di estrusione per l'ingresso di spooler.
      Nota: Lo spooler può facoltativamente essere generato 3-4 pollici dalla panchina se si trova che il filamento è calata fino al punto di toccare il benchtop.
   2. Posizionare un ventilatore desktop ~ 15 cm dalla giacca riscaldamento e orientarla verso la camicia di riscaldamento da offrire raffreddamento con aria ambiente durante la produzione di filamenti. Inserire una seconda ventola di raffreddamento circa a metà strada tra l'estrusore e lo spooler e orientarla verso l'estruso per assistere in raffreddamento il filamento con aria ambiente.
   3. Regolare il posizionamento come necessario durante tutto il processo.
6. Impostare l'estrusore modificata riscaldamento elemento a 52 ° C, attiva il desktop ventole e consentire allo strumento di venire all'equilibrio per 20-30 min. Accertarsi che l'ugello corretto è collegato all'estrusore.
7. Appena prima di iniziare, è necessario riempire la tramoggia dell'estrusore con la miscela di microsfere/PCL dal punto 3.3. Attivare lo spooler e la coclea di estrusore per iniziare l'estrusione del filamento.
8. Quando il filamento iniziale viene estruso, manualmente tirare l'estruso dalla presa di estrusione con il forcipe e inserirla allo spooler di filamento.
9. Il filamento desiderato ci vorrà del tempo a venire fuori lo spooler. Utilizzando bobine separate o nastro, contrassegnare chiaramente quando la composizione di filamento visivamente appare uniforme.
10. Monitorare da vicino il processo e modificare parametri come necessario. Regolare la temperatura di estrusore, la velocità della coclea di estrusione e la velocità di spooler per ottenere un filamento di diametro di 1,75 mm come misurato da pinze. Regolare i tifosi come necessario per raffreddare il filamento correttamente per evitare di sezioni trasversali del filamento non circolare. Mescolare e riempire la tramoggia come necessario.
    Nota: Attenzione è necessario durante il processo di ottenere adeguato filamento per la successiva stampa 3D. I suddetti parametri cambiano a seconda delle condizioni ambientali, il livello di riempimento e l'uniformità della miscela nella tramoggia e le dinamiche di termodinamica e flusso dei lotti specifici di PCL e microsfere.
11. Continuare fino a quando tutta la polvere è stato utilizzato e la tramoggia è quasi vuota di estrusione. Aggiungere la polvere PCL (senza microsfere) alla tramoggia per scovare la miscela di microsfere che è attualmente nell'estrusore. Continuare ad aggiungere polvere PCL alla tramoggia, fino a quando nessun altro microsfere sono visibili nell'estruso.
12. Assicurarsi di etichettare e separato il filamento che contiene le microsfere nella concentrazione desiderata, come dopo il filamento è raffreddato è più difficile da distinguere il filamento uniforme dal filamento non uniforme.
13. Continuare fino a quando non c'è polvere minima lasciato nella tramoggia di estrusione, quindi spegnere il spooler, coclea di estrusore, elemento riscaldante dell'estrusore e tifosi.

4. stampa con il filamento

1. Progettare una geometria della forma desiderata e forma utilizzando un software di progettazione assistita da elaboratore. Sezionare il modello, quindi dettare il percorso utensile utilizzando software per affettare che è compatibile con la macchina da stampa 3D utilizzata.
2. Caricare il filamento dal passaggio 3 su qualsiasi stampante standard di FDM, dotato di ugelli standard del diametro desiderato (in genere 0,4 mm). Iniziare la stampa (in genere a 65-70 ° C e 300 mm/min velocità lineare) come il filamento personalizzato è strato-da-strato depositato dalla macchina.
3. Assicurati di prestare particolare attenzione al primo strato e regolare le impostazioni come necessario per ottenere una buona qualità di stampa.
   Nota: Si possono effettuare regolazioni per la velocità di stampa, stampa temperatura, temperatura di piattaforma, moltiplicatore di estrusione e altri parametri. Fare riferimento alla stampante e guida alla risoluzione dei problemi del produttore per affettare per ulteriore assistenza.

5. controllo qualita ' valutazione

1. Posizionare i costrutti stampati sul SEM mandrini e polverizza cappotto con oro-palladio in atmosfera di argon utilizzando una macchina a polverizzazione ad uno spessore di 4 nm.
2. Osservare al microscopio usando un 10 kV accelerando la tensione e una distanza di lavoro di 10 mm per controllare le caratteristiche della superficie e per la presenza o l'assenza di microsfere se applicabile.

6. collaudo dei costrutti stampati

Nota: Fosfatasi alcalina (ALP) utilizzabile come un surrogato per la matrice decellularizzati per determinare se le proteine incapsulate sono biologicamente attive dopo il processo di produzione del filamento. ALP è utilizzato perché esso catalizza una reazione da un substrato p-nitrofenil fosfato, per cambiare da incolore a gialli sottoprodotti, p-nitrofenolo e fosfato inorganico, ma solo se ALP è nella conformazione funzionale.

1. Stampare una geometria (n = 3) che ha una massa di fine di almeno 400 mg con il filamento di microsfere ALP (PLA-ALP/PCL) utilizzando parametri di stampa identici come i ponteggi di PLA-DM/PCL. Inoltre stampa PCL-unico (PCL(-)) ponteggi della stessa geometria come le impalcature di PLA-ALP/PCL. Li immergere in 1 mL di tampone Tris-HCl e incubare per 24 h a 37 ° C e 110 giri/min rotazione per consentire la diffusione di enzima.
2. Aggiungere 1 mL di 1 mg/mL p-nitrofenil fosfato, disodio esaidrato in Tris-HCl. Incubare a 37 ° C, 110 giri/min per un ulteriore 10 h. leggere l'assorbanza surnatante a 415 nm.

Risultati

Dopo setacciatura, microsfere dovrebbero apparire uniforme e liberi da aggregati. In SEM, le microsfere setacciate possono avere piccoli pori sulla loro superficie, ma in caso contrario sarà sferica e liscia, come mostrato nella Figura 1. Tutti i filamenti estrusi devono essere di diametro uniforme e di sezione circolare. Un filamento contenente microsfere (PLA-DM/PCL) avrà un leggermente più opaco a finire, mentre un solo PCL (PCL(-)) filamento apparirebb...

Discussione

Entrambi decellularized matrici e 3D stampato scaffold PCL sono stati indicati in modo indipendente per permettere l'adesione e la proliferazione delle cellule, convalidando il loro uso per osteocondrali riparazione^10,11,12. L'uso della matrice decellularizzati in ingegneria approcci alla riparazione tissutale è stato oggetto di molto interesse e successo nel recente passato^2,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sieve machine	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Pure
Sieve 90 um	Fisherbrand	170328156	No. 170
Sieve 53 um	Fisherbrand	162513588	No. 270
Sieve 106 um	Fisherbrand	162018121	No. 140
Sputter coater	Leica	n/a
Scanning Electron Microscope	Hitachi, USA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot Spooler	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010023
6" Fan	Comfort Zone, Amazon	n/a
Ultrasonic Water Bath	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	n/a
Drum Mixer	Custom made	n/a	Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
Micro Balance	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	n/a
SolidWorks	SolidWorks	n/a
Microspheres	Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission
p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate	Millipore	4876-5GM
Phosphatase, alkaline	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
Absorbance Reader	Tecan	Sunrise
Tris-HCl Buffer	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
Heated shaker	New Brunswick Scientific	Excella E24