Novedoso proceso para la impresión 3D Decellularized Matrices

Resumen

Este protocolo describe la producción de filamento de policaprolactona (PCL) con microesferas de ácido (PLA) de poliláctico incrustados que contienen matrices decellularized (DM) para la impresión 3D de ingeniería construcciones de tejidos estructurales.

Resumen

Bioprinting 3D pretende crear andamios personalizados que son biológicamente activos y acomodar el tamaño y la geometría. Una red troncal de termoplástica puede proporcionar estabilidad mecánica similar al tejido nativo mientras que agentes biológicos ofrecen composición señales a las células progenitoras, llevando a su migración, proliferación y diferenciación para reconstituir los tejidos originales / órganos^1,2. Desafortunadamente, muchos compatible con impresión 3D, polímeros bioabsorbibles (como el ácido poliláctico, PLA) son impresos en las temperaturas de 210 ° C o superior - temperaturas que son perjudiciales para los productos biológicos. Por otro lado, la policaprolactona (PCL), un tipo diferente de poliester, es un biorreabsorbibles, 3D material imprimible que tiene una temperatura más suave de impresión de 65 ° C. Por lo tanto, se planteó la hipótesis eso matriz extracelular decellularized (DM) contenida dentro de una barrera térmica protectora del PLA puede ser impreso en filamento PCL y permanecer en su conformación funcional. En este trabajo, osteocondrales reparación fue la aplicación para que la hipótesis fue probada. Como tal, cartílago porcino era decellularized y encapsulado en microesferas ácidas sobre poliláctico (PLA) que luego fueron sacadas con policaprolactona (PCL) en filamento para producir construcciones 3D mediante fundido deposición modelado. Las construcciones con o sin las microesferas (PLA-DM/PCL y PCL(-), respectivamente) se evaluaron las diferencias en características superficiales.

Introducción

Actuales técnicas de ingeniería de tejidos para aplicaciones clínicas como la reconstrucción de hueso, cartílago, tendón y ligamento usan auto y aloinjertos para reparar el tejido dañado. Cada una de estas técnicas se realiza habitualmente como un "gold standard" en la práctica clínica primera cosecha el tejido donante de la paciente o de un partido cadavérico, y luego colocando el tejido del donante en el sitio de defecto². Sin embargo, estas estrategias están limitadas por la morbosidad del sitio donante, escasez de sitio donante para defectos grandes, riesgo de infección y dificultad para encontrar los injertos que coincidan con la geometría deseada. Además, estudios han demostrado que los aloinjertos utilizados para la reconstrucción han reducido propiedades mecánicas y biológicas cuando se compara con tejido propio³. Con estas consideraciones en mente, los ingenieros de tejidos recientemente han recurrido a tres dimensiones (3D) bioprinting para producir geometrías personalizadas y complejas que son biológicamente activos y diseñados para acomodar el tamaño del defecto y la forma mientras que proporciona suficiente propiedades mecánicas hasta remodelación biológica es completa.

Idealmente, un andamio 3D impreso consistiría en una estructura polimérica que puede conservar la estabilidad mecánica necesaria del tejido nativo mientras que los productos biológicos incorporados ofrecen señales bioquímicas para que rodea las células, conduciendo a su migración, proliferación, la diferenciación y producción de tejido^2,5. Por desgracia, más construcciones que contienen componentes biológicos se hacen con geles o polímeros que son demasiado débiles para resistir en vivo las fuerzas experimentadas por los tejidos específicos para la reconstrucción de auto/del allograft. Otros polímeros como el ácido poliláctico (PLA) son biorreabsorbibles, 3D imprimibles y estructuralmente sano, pero se imprimen en las temperaturas en o por encima de 210 ° C - lo que hace imposible para productos biológicos que co impresos durante la fabricación. Policaprolactona (PCL) es otro polímero biorreabsorbibles aprobados por la FDA, que puede ser impreso a baja temperatura (65 ° C), que se ha vuelto cada vez más popular en la fabricación de implantes específico para cada paciente con morfologías complejas^{5,6 3D ,7,8,9}. Sin embargo, la mayoría bioprinters con tecnología neumática impiden impresión PCL a temperaturas más bajas, donde las actividades biológicas pueden permanecer ilesos. Hasta la fecha, la integración de estos polímeros con auto/allografts en un nuevo biomaterial para imprimir tiene que lograrse. En ausencia de tal material, un enfoque de ingeniería tisular verdadera reconstrucción de tejido es poco probable. Por lo tanto, hemos intentado combinar PLA, PCL y decellularized matrices de aloinjerto (DM) para utilizar las ventajas de cada material para la fabricación de una construcción viable capaces de reconstruir tejidos complejos. Este proceso daría la fuerza mecánica inicial necesaria para resistir las fuerzas de en vivo y la estabilidad térmica para fabricación aditiva en un constructo que induce la formación del tejido deseado.

En un reciente intento de abordar los obstáculos antes mencionados, nos demostró que es posible encapsular la matriz extracelular del cartílago decellularized dentro de una barrera térmica protectora de PLA que se puede sacar en filamentos PCL, mantener la capacidad de DM para influir en entorno host células². Esto nos ha inspirado a buscar enfoques eficaces clínicamente para la reconstrucción del tejido. En el estudio actual, utilizamos la tecnología de plataforma para construir andamios de all-in-one que incluyen PLA, DM y PCL (PLA-DM/PCL).

Nuestro objetivo es mejorar la eficacia y la utilidad de aloinjertos mediante la técnica propuesta biofabrication novela recapitular con mayor precisión del tejido nativo, para finalmente usarlos en diferentes aplicaciones.

Protocolo

1. obtención y procesamiento de microesferas

1. Producir microesferas con la matriz deseada encapsulado (PLA-DM)².
   Nota: Es imperativo que las microesferas son de tamaño uniforme. Por esta razón, el tamizado previo utilizar microesferas es esencial. Aunque encapsulado y descelularización de matriz han sido detallados en anteriores publicaciones², sigue un breve resumen del proceso.
   1. En primer lugar, la cosecha cartílago enchufes de porcinos extremidades traseras. Decellularize del cartílago en una serie de lavados con 0.05% tripsina/0,5 mm tetrasodium dihidratada del ácido (EDTA), Dulbecco de modificado de águila ácido peracético medio (DMEM) y 1.5% y 2.0% Tritón X-100 durante 4 h con lavados de agua destilada antes y después de cada paso².
   2. Vaciar la matriz decellularized, congelarlo, liofilizar, triturar y disolver en solución de pepsina. Tras la disolución, mezclar la solución de pepsina con PLA que ha sido disuelta en diclorometano.
   3. Añadir gota a gota la mezcla en un alcohol de polivinilo de 3% en solución de agua. Centrífuga de la microesferas resultantes, enjuague, desagüe y liofilizar otra vez.
      Nota: Para más detalles sobre el proceso de ver el protocolo publicado anteriormente².
2. Tamiz de las microesferas.
   1. Asegúrese de que todas las placas de tamiz ha limpiado completamente y estén secas antes de usar. Si es necesario, limpiar los tamices utilizando ultrasonidos limpiador para Asegúrese que todas las esferas del tamiz.
   2. Montar el tamiz vibratorio con la bandeja del tamiz μm 106 en la tapa, la bandeja de μm 53 después de y el tamiz de la bandeja en la parte inferior.
   3. Lugar seco microesferas en la bandeja del tamiz superior y coloque la tapa sobre la bandeja superior. Encienda el tamizado grueso de 8 a 10 minutos repetir a multa de 8 a 10 min.
      Nota: Los tiempos de tamiz deba aumentar o disminuir dependiendo el lote.
   4. Retire las placas de tamiz uno por uno con cuidado y colocarlos boca abajo sobre un papel de gran peso. Golpee los lados con cuidado para asegurarse de que la mayoría de las esferas ha caído fuera del tamiz y en el papel.
   5. Descartar las esferas de gran tamaño (> 106 μm) y esferas de tamaño insuficientes (< 53 μm). Agregar esferas que están en el rango de tamaño de 53 a 106 μm a un tubo de centrífuga etiquetados con el tipo y número de hornada y luego colocar en un congelador de-20 ° C hasta su uso posterior.

2. las evaluaciones de Control de calidad de la microesfera de

Nota: Vea la figura 1.

1. Realizar evaluación macroscópica o visual para comprobar que las microesferas son uniforme y esférico, con los no agregados presentes.
2. Evaluar las microesferas usando un micrográfo de electrón de barrido (SEM).
   1. Para ello, lugar de microesferas en un SEM chuck y sputter coat con oro paladio en atmósfera de argón con un recubridor sputter a un grosor de 4 nm.
   2. Observar características de superficies, morfología y diámetros de las microesferas con un 10 kV aceleración de voltaje y una distancia de trabajo de 10 mm para asegurar que la producción y el cribado de las microesferas fue exitosa.

3. filamento creación para impresión 3D

1. Mida y anote la masa de las microesferas obtenidas de los pasos 2 y 3; se necesita al menos 25 g.
2. Añadir polvo de policaprolactona (PCL) a las microesferas para una relación de 1:4 peso de microesferas a PCL.
3. Mezclar la mezcla del polvo en un mezclador de balanceo de miniatura a 20 rpm por 5 min luego voltear el recipiente y mezclar en 20 rpm para un adicional 5 min (ver figura 2).
4. Muchos extrusoras disponibles comercialmente (véase la Tabla de materiales) tienen chaquetas de aislamiento dado que sus temperaturas de trabajo previstas son filamentos de tradicional deposición fundida (FDM) de modelado. Modificar la extrusora (si es necesario) quitando el material aislante y utilizar en combinación con ventiladores de escritorio (que soplan el aire ambiente a la extrusión y extrusión filamento) para el uso de la extrusora a temperaturas más bajas.
   Nota: Escritorio ventiladores que soplan aire ambiente para enfriar el estirador y el filamento son útiles para este procedimiento.
5. Configuración la configuración de equipos para extrusión. Vea la figura 3.
   1. Configuración de la extrusora para que su salida es ~ 60 cm de la entrada a la cola, con un camino directo desde la salida de la protuberancia a la entrada de cola de impresión.
      Nota: La cola de impresión se puede opcionalmente levantar 3 a 4 pulgadas desde el banquillo si se encuentra que el filamento está cayendo hasta el punto de tocar la mesa.
   2. Coloque un ventilador de escritorio ~ 15 cm de la camisa de calefacción y directo hacia la chaqueta de calentamiento para ofrecer refrigeración con aire ambiente a través de la producción del filamento. Colocar un segundo ventilador aproximadamente a medio camino entre la extrusora y la cola de impresión y dirigirlo hacia la extrusión para ayudar en el filamento con aire ambiente de enfriamiento.
   3. Ajuste la posición según sea necesario durante todo el proceso.
6. Establecer la extrusora modificada calefactor a 52 ° C, gire en el escritorio, ventiladores de refrigeración y que el instrumento llegar a equilibrio durante 20 a 30 minutos Asegúrese que la boquilla apropiada se une a la extrusora.
7. Justo antes de empezar, llene la tolva de la extrusora con la mezcla de microesferas/PCL de paso 3.3. Abra la cola de impresión y el sinfín de extrusión para iniciar la extrusión de filamentos.
8. Cuando se saca el filamento inicial, manualmente tire la extrusión de la toma de extrusión con pinzas y alimentar a la cola del filamento.
9. El filamento deseado tomará algún tiempo para salir de la cola de impresión. Con bobinas separadas o cinta, marque claramente cuando la composición del filamento visualmente aparece uniforme.
10. Seguir de cerca el proceso y modificar parámetros según sea necesario. Ajustar la temperatura de extrusión, extrusión taladro velocidad y velocidad de cola de impresión para obtener un filamento de diámetro 1,75 mm medida por pinzas. Ajustar los ventiladores según sea necesario para que se enfríe el filamento adecuadamente para evitar cortes transversales no circulares del filamento. Mezclar y rellenar la tolva según sea necesario.
    Nota: La atención es necesaria durante este proceso para obtener el filamento adecuado para la posterior impresión 3D. Los parámetros anteriores cambiará dependiendo de las condiciones ambientales, el nivel de llenado y la uniformidad de la mezcla en la tolva y la dinámica termodinámica y flujo de lotes concretos de PCL y microesferas.
11. Siguen sacando hasta que todo el polvo se ha utilizado y la tolva está casi vacía. Añadir polvo PCL (sin microesferas) a la tolva para eliminar la mezcla de microesferas que se encuentra actualmente en la extrusora. Seguir añadiendo polvo PCL a la tolva de hasta no más microesferas son visibles en la extrusión.
12. Asegúrese de etiquetar y separado el filamento que contiene microesferas en la concentración deseada, como después de que el filamento se enfría lo es más difícil distinguir el filamento uniforme de filamento no uniforme.
13. Siguen sacando hasta que haya un mínimo polvo en la tolva a la izquierda, girar a la cola de impresión, barrena de extrusora, elemento de calefacción del estirador y fans.

4. impresión con el filamento

1. Diseño de una geometría de la forma deseada y utilizando un software de diseño asistido por ordenador. Luego cortar el modelo y dictar la trayectoria utilizando el software de corte que es compatible con la impresora 3D que utiliza.
2. Cargar el filamento del paso 3 en cualquier impresora estándar de la FDM, equipado con boquillas estándar del diámetro deseado (normalmente 0,4 mm). Comenzar la impresión (por lo general en los 65-70 ° C y 300 mm/min velocidad lineal) como el filamento personalizado es depositado capa por capa por la máquina.
3. Asegúrese de prestar especial atención a la primera capa y ajustar la configuración según sea necesario para obtener una buena calidad de impresión.
   Nota: Pueden hacerse ajustes a la velocidad de impresión, impresión temperatura, temperatura de plataforma, multiplicador de extrusión y otros parámetros. Consulte la impresora y guía de corte fabricante para obtener asistencia.

5. Control de calidad evaluación

1. Coloque las construcciones impresas en tiradas de SEM y sputter coat con oro paladio en atmósfera de argón con un recubridor sputter a un grosor de 4 nm.
2. Observar al microscopio utilizando un 10 kV aceleración de voltaje y una distancia de trabajo de 10 mm para verificar características de superficie y la presencia o ausencia de las microesferas si corresponde.

6. prueba funcional de las construcciones impresas

Nota: Fosfatasa alcalina (ALP) puede utilizarse como un sustituto para la matriz de decellularized para determinar si las proteínas encapsuladas son biológicamente activas tras el proceso de producción de filamentos. Fosfatasa alcalina se utiliza porque cataliza una reacción de un sustrato p-nitrofenil fosfato, que cambia de incoloro a amarillo subproductos, p-nitrofenol y fosfato inorgánico, pero sólo si es de ALP en la conformación funcional.

1. Imprimir una geometría (n = 3) que tiene una masa final de al menos 400 mg con el filamento de la microesfera de la ALP (PLA-ALP/PCL) con idénticos parámetros de impresión como los andamios de PLA-DM/PCL. También impresión PCL-único (andamios PCL(-)) de la misma geometría como los andamios de PLA-ALP/PCL. Sumerja en 1 mL de tampón de Tris-HCl e incubar durante 24 h a 37 ° C y 110 rpm rotación para permitir la difusión de la enzima.
2. Añadir 1 mL de 1 mg/mL p-nitrofenil fosfato, hexahidrato disódico en Tris-HCl. incubar a 37 ° C, 110 rpm para un adicional 10 h. leer la absorbancia del sobrenadante a 415 nm.

Resultados

Después de tamizado, microesferas deben aparecer uniforme y estar libre de agregados. Bajo SEM, las microesferas tamizadas pueden tener pequeños poros en su superficie, pero de lo contrario será esférica y lisa, como se muestra en la figura 1. Todos los filamentos extruidos deben ser de diámetro uniforme y de sección circular. Un filamento que contiene microesferas (PLA-DM/PCL) tendrá un poco más mate acabado mientras que sólo un PCL (filamento PCL(-...

Discusión

Ambos decellularized matrices y 3D impreso PCL andamios han demostrado independientemente para permitir adherencia y proliferación de las células, validar su uso para osteocondral reparacion^10,11,12. El uso de decellularized matriz de enfoques de ingeniería para la reparación de los tejidos ha sido un tema de gran interés y éxito en los últimos años^2,3,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sieve machine	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Pure
Sieve 90 um	Fisherbrand	170328156	No. 170
Sieve 53 um	Fisherbrand	162513588	No. 270
Sieve 106 um	Fisherbrand	162018121	No. 140
Sputter coater	Leica	n/a
Scanning Electron Microscope	Hitachi, USA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot Spooler	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010023
6" Fan	Comfort Zone, Amazon	n/a
Ultrasonic Water Bath	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	n/a
Drum Mixer	Custom made	n/a	Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
Micro Balance	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	n/a
SolidWorks	SolidWorks	n/a
Microspheres	Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission
p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate	Millipore	4876-5GM
Phosphatase, alkaline	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
Absorbance Reader	Tecan	Sunrise
Tris-HCl Buffer	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
Heated shaker	New Brunswick Scientific	Excella E24