Nouveau procédé d’impression 3D Decellularise Matrices

Résumé

Ce protocole décrit la production du filament polycaprolactone (PCL) avec des microsphères de (PLA) d’acide polylactique embarqués qui contiennent decellularise matrices (DM) pour l’impression 3D de tissus structuraux des constructions de génie.

Résumé

Bioprinting 3D vise à créer des échafaudages personnalisés qui sont biologiquement actives et adaptées à la taille désirée et la géométrie. Une dorsale thermoplastique peut fournir une stabilité mécanique semblable au tissu natif tandis que les agents biologiques offrent compositions repères à des cellules progénitrices, menant à leur migration, la prolifération et la différenciation pour reconstituer les tissus originales / organes de^1,2. Malheureusement, nombreux compatible d’impression 3D, polymères biorésorbables (tels que l’acide polylactique PLA) sont imprimées à une température de 210 ° C ou supérieur - températures qui nuisent aux produits biologiques. En revanche, polycaprolactone (PCL), un autre type de polyester, est un biorésorbable, 3D matériel imprimable qui a une température plus douce impression de 65 ° C. Par conséquent, il a émis l’hypothèse que matrice extracellulaire decellularise (DM) contenue dans une barrière thermique protectrice de PLA a pu être imprimé dans les filaments PCL et rester dans sa conformation fonctionnelle. Dans cet ouvrage, cartilagineuses réparation était l’application pour laquelle l’hypothèse a été vérifiée. Par conséquent, cartilages porcins a été decellularise et encapsulé dans des microsphères de (PLA) acides polylactique, qui étaient ensuite extrudés avec polycaprolactone (PCL) en filament pour produire des constructions 3D via fusionnés avec modélisation dépôts. Les constructions avec ou sans les microsphères (PLA-DM/PCL et PCL(-), respectivement) ont été évalués pour les différences dans les caractéristiques de la surface.

Introduction

Cours techniques d’ingénierie tissulaire pour applications cliniques telles que des os, du cartilage, tendons et ligament reconstruction utilisent auto - et allogreffes à réparer le tissu endommagé. Chacune de ces techniques est effectuée systématiquement comme un « gold standard » dans la pratique clinique par récolte tout d’abord le tissu du donneur par le patient ou un match cadavérique et puis en plaçant le tissu du donneur dans le défaut site². Toutefois, ces stratégies sont limitées par la morbidité site donneur, rareté de site donneur pour les gros défauts, risque d’infection et la difficulté à trouver des greffes qui correspondent à la géométrie souhaitée. En outre, des études ont montré qu’allogreffes utilisés pour la reconstruction ont réduit les propriétés mécaniques et biologiques par rapport aux tissus natifs³. Avec ces considérations à l’esprit, ingénieurs de tissus ont récemment tourné à trois dimensions bioprinting (3D) pour produire des géométries personnalisées et complexes qui sont biologiquement actives et conçu pour défaut de taille et la forme tout en offrant suffisamment propriétés mécaniques jusqu'à ce que le remodelage biologique est complet.

Idéalement, un échafaudage imprimés 3D consisterait en une épine dorsale polymère qui peut retenir la nécessaire stabilité mécanique du tissu native, tandis que le produits biologiques constitué offrent des indices biochimiques qui entoure les cellules, menant à leur migration, prolifération, différenciation et tissus production^2,5. Malheureusement, la plupart des constructions qui contiennent des composants biologiques sont faites avec des gels ou des polymères qui sont trop faibles pour résister aux forces d’en vivo vécues par les tissus ciblés pour la reconstruction automatique/allogreffe. Autres polymères tels que l’acide polylactique (PLA) sont biorésorbable, 3D imprimable et structure solide, mais sont imprimés à des températures égales ou supérieures à 210 ° C - il est impossible pour les produits biologiques être co imprimé pendant la fabrication. Polycaprolactone (PCL) est un autre polymère biorésorbable FDA affranchis, qui peut être imprimé à une température plus basse (65 ° C), qui est devenu de plus en plus populaire dans la fabrication d’implants spécifiques à un patient avec des morphologies complexes^{5,6 en 3D ,7,8,9}. Cependant, la plupart des bioprinters à l’aide de la technologie pneumatique rendent impossible d’impression PCL à des températures inférieures, où les activités biologiques peuvent rester sain et saufs. A ce jour, l’intégration de ces polymères avec auto/allogreffes dans un nouveau biomatériau imprimable doit encore être accompli. En l’absence d’un tel matériau, une approche de vrai tissu conçu pour la reconstruction des tissus est peu probable. Par conséquent, nous avons cherché à combiner PLA, PCL et decellularise matrices allogreffe (DM) d’utiliser les avantages de chaque matière pour fabriquer une construction viable capable de reconstruire les tissus complexes. Ce processus permettrait à la résistance mécanique initiale nécessaire pour résister aux forces de in vivo et la stabilité thermique pour accueillir la fabrication additive à une construction qui induit la formation du tissu désiré.

Dans une récente tentative d’aborder les obstacles susmentionnés, nous avons montré qu’il est possible d’encapsuler la matrice extracellulaire du cartilage decellularise dans un écran PLA thermiquement protecteur qui peut être expulsé dans les filaments de PCL, conservant la capacité de DM pour influencer les cellules environnantes du hôte². Cela a inspiré nous cherchions des approches efficaces sur le plan clinique pour la reconstruction des tissus. Dans la présente étude, nous utilisons la technologie de la plate-forme pour construire les échafaudages tout-en-un qui incluent PLA, DM et PCL (PLA-DM/PCL).

Notre objectif est d’améliorer l’efficacité et l’utilité des allogreffes utilisant la technique de la biofabrication roman proposé de récapituler avec plus de précision le tissu natif, pour finalement utiliser dans diverses applications.

Protocole

1. obtention et microsphères de prétraitement

1. Produire des microsphères avec la matrice souhaitée encapsulé (PLA-DM)².
   Remarque : Il est impératif que les microsphères sont de taille uniforme. Pour cette raison, il est essentiel de tamisage des microsphères avant toute utilisation. Bien que l’encapsulation et décellularisation matrice ont été détaillés dans les précédentes publications², fait suite à un bref résumé du processus.
   1. Tout d’abord, récolter des bouchons de cartilage de porc des membres postérieurs. Decellularize le cartilage dans une série de lavages avec acide 0.05 % trypsine/0,5 mm tetrasodium EDTA (EDTA), Dulbecco modifiée de l’aigle l’acide peracétique moyen (DMEM) et 1,5 % et 2,0 % Triton X-100 pendant 4 heures chacun avec eau distillée lavages avant et après chaque étape².
   2. Égoutter la matrice decellularise, congeler, lyophiliser, moudre et se dissoudre dans la solution de pepsine. Après dissolution, mélanger la solution de pepsine avec PLA, qui a été dissoute dans du dichlorométhane.
   3. Ajouter quelques gouttes du mélange dans un polyalcool de 3 % en solution aqueuse. Centrifuger les microsphères qui en résulte, la rincer, la vidange et lyophiliser à nouveau.
      Remarque : Pour plus de détails sur le processus voir le publiées antérieurement protocole n°².
2. Tamisez les microsphères.
   1. S’assurer que toutes les plaques de tamis ont été nettoyés à fond et sont secs avant utilisation. Si nécessaire, nettoyer tamis par ultrasons nettoyeur à assurer que toutes les sphères sont écartés de la passoire.
   2. Assembler le shaker passoire avec le plateau de tamis 106 µm en haut, le plateau de µm 53 après que cela et le tamis pan en bas.
   3. Placez les microsphères secs dans le bac de tamis plus haut et placez le couvercle sur le plateau supérieur. Vous allumez un tamisage grossier pour 8 à 10 min. Repeat sur amende pour 8 à 10 min.
      NOTE : Les temps de tamis devrez peut-être être augmenté ou diminué selon le lot.
   4. Soigneusement, enlever les plaques de tamis un et placez-les à l’envers sur un papier de grand poids. Appuyez sur les côtés doucement pour faire en sorte que la plupart des sphères est tombés sur le tamis et sur le papier.
   5. Jetez les sphères surdimensionnés (> 106 µm) et sphères sous-dimensionné (< 53 µm). Ajouter les sphères qui sont dans la gamme de taille de 53 à 106 µm dans un tube à centrifuger étiquetées avec le type et numéro de lot, puis placer dans un congélateur à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.

2. microsphères contrôle de la qualité des évaluations

Remarque : Voir la Figure 1.

1. Effectuer analyse macroscopique/visuel pour vérifier que les microsphères sont harmonisés et sphérique, avec aucun agrégat présent.
2. Évaluer les microsphères en utilisant une micrographie électronique à balayage (SEM).
   1. Pour ce faire, des microsphères de lieu sur un SEM chuck et bredouiller manteau avec or-palladium dans une atmosphère d’argon à l’aide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique pour une épaisseur de 4 nm.
   2. Observer les caractéristiques de la surface, la morphologie et diamètres des microsphères en utilisant un 10 kV, accélération de la tension et une distance de travail de 10 mm pour s’assurer que la production et le tamisage des microsphères a réussi.

3. filament création pour l’impression 3D

1. Mesurer et noter la masse des microsphères obtenues aux étapes 2 et 3 ; Il faut au moins 25 g.
2. Ajouter la poudre de polycaprolactone (PCL) pour les microsphères pour un rapport de 1:4 poids de microsphères à PCL.
3. Mélanger le mélange de poudre dans un mélangeur roulement miniature à 20 tr/min pendant 5 min puis retourner le récipient et mélanger à 20 tr/min pour un 5 min supplémentaire (voir Figure 2).
4. Beaucoup des extrudeuses disponibles dans le commerce (voir la Table des matières) ont vestes isolantes étant leur température de travail prévue pour les filaments de modeling (FDM) de dépôts fondue traditionnelle. L’extrudeuse de modifier (si nécessaire) en supprimant l’isolant et l’utiliser en combinaison avec des ventilateurs de bureau (qui soufflent de l’air ambiant sur l’extrudeuse et filament extrudé) d’utiliser de l’extrudeuse à basse température.
   NOTE : Ventilateurs de bureau qui soufflent de l’air ambiant pour refroidir l’extrudeuse et filament sont utiles pour cette procédure.
5. Programme d’installation l’installation de l’équipement pour l’extrusion. Voir la Figure 3.
   1. Configurer l’extrudeuse pour que sa sortie soit ~ 60 cm de l’entrée et le spouleur, avec une voie directe de la prise d’extrusion à l’entrée du spouleur.
      Remarque : Le spouleur peut éventuellement être déclenché 3-4 pouces sur le banc s’il est constaté que le filament est tombante jusqu’au point de toucher la paillasse.
   2. Placer un ventilateur de bureau ~ 15 cm de la gaine de chauffage et de l’orienter vers la gaine de chauffage offre de refroidissement à l’air ambiant dans l’ensemble de la production de filament. Placez un deuxième ventilateur de refroidissement environ à mi-chemin entre l’extrudeuse et spouleur et dirigez-la vers l’extrudat pour aider au refroidissement du filament avec l’air ambiant.
   3. Ajuster le positionnement selon les besoins tout au long du processus.
6. Définir l’extrudeuse mis à jour le chauffe à 52 ° C, se tourner vers le bureau de ventilateurs de refroidissement et laissez l’instrument à venir à l’équilibre pour 20 à 30 min. veiller à ce que la buse adéquate est attachée à l’extrudeuse.
7. Juste avant de commencer, remplir la trémie de l’extrudeuse avec le mélange de microsphères/PCL à l’étape 3.3. Allumez le spouleur et la vis d’extrudeuse pour initier l’extrusion du filament.
8. Lorsque le filament initial est extrudé, tirez l’extrudat de la prise de l’extrusion avec une pince et le nourrir et le spouleur de filament manuellement.
9. Le filament désiré prendra du temps à sortir le spouleur. À l’aide de bobines séparées ou ruban, marquer clairement quand la composition de filament visuellement semble uniforme.
10. Suivre de près le processus et de modifier les paramètres si nécessaire. Ajuster la température de l’extrudeuse, extrusion auger vitesse et vitesse de spouleur pour obtenir un filament de diamètre de 1,75 mm mesurée par des étriers à. Ajustez les fans comme nécessaire pour refroidir le filament correctement pour éviter les coupes non circulaire à incandescence. Mélanger et remplir la trémie si nécessaire.
    Remarque : Une attention particulière est nécessaire au cours de ce processus pour obtenir le filament adéquat pour ultérieure impression 3D. Les paramètres ci-dessus vont changer en fonction des conditions ambiantes, le niveau de remplissage et l’homogénéité du mélange dans la trémie et la dynamique de thermodynamique et d’écoulement des lots spécifiques de PCL et microsphères.
11. Continuer jusqu'à ce que toute la poudre a été utilisée et la trémie est presque vide d’extrusion. Ajouter la poudre PCL (sans les microsphères) dans la trémie pour rincer le mélange de microsphères qui est actuellement dans l’extrudeuse. Continuez à ajouter la poudre PCL à la trémie jusqu'à ce qu’aucuns plus de microsphères ne sont visibles dans l’extrudat.
12. N’oubliez pas d’étiqueter et distincte le filament qui contient des microsphères dans la concentration désirée, comme lorsque le filament est refroidi, il est plus difficile de distinguer le filament uniform des filaments non uniforme.
13. Continuer jusqu'à ce qu’il n’y a poudre minime à gauche dans la trémie d’extrusion, puis éteignez le spouleur, extrudeuse auger, élément chauffant extrudeuse et les fans.

4. impression avec le Filament

1. Concevoir une géométrie de la forme désirée et la forme à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur. Puis couper le modèle et dicter la trajectoire d’outil à l’aide de tranchage de logiciel qui est compatible avec la machine d’impression 3D utilisée.
2. Charger le filament de l’étape 3 sur n’importe quelle imprimante standard de FDM, équipé de buses standard du diamètre désiré (en général 0. 4 mm). Commencer l’impression (généralement à 65-70 ° C et 300 mm/min vitesse linéaire) que le filament personnalisé est couche par couche déposée par la machine.
3. Veillez à accorder une attention particulière à la première couche et ajuster les paramètres nécessaires pour obtenir une bonne qualité impression.
   Remarque : Modifications peuvent être apportées à la vitesse d’impression, impression température, température de plate-forme, multiplicateur d’extrusion et d’autres paramètres. Se référer à l’imprimante et guide de dépannage du tranchage fabricant pour obtenir de l’aide.

5. contrôle de la qualité évaluation

1. Placez les constructions imprimées sur des mandrins de SEM et bredouiller manteau avec or-palladium dans une atmosphère d’argon à l’aide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique pour une épaisseur de 4 nm.
2. Observer au microscope à l’aide d’un 10 kV, accélération de la tension et une distance de travail de 10 mm pour vérifier les caractéristiques de la surface et la présence ou l’absence de microsphères le cas échéant.

6. test fonctionnel des constructions de l’imprimé

Remarque : La phosphatase alcaline (ALP) peut servir comme un substitut pour la matrice decellularise pour déterminer si les protéines encapsulées sont biologiquement actifs après le processus de production de filament. ALP est utilisé parce qu’il catalyse une réaction d’un substrat, p-nitrophényl phosphate, de changer d’incolore à jaunes sous-produits, p-nitrophénol et phosphate inorganique, mais seulement si l’ALP est dans la conformation fonctionnelle.

1. Imprimer une géométrie (n = 3) qui a une masse de fin d’au moins 400 mg avec le filament de microsphères ALP (PLA-ALP/PCL) à l’aide de paramètres d’impression identiques comme les échafaudages de PLA-DM/PCL. Aussi d’impression PCL-seule (PCL(-)) échafaudages de la même géométrie que les échafaudages de PLA-ALP/PCL. Les plonger dans un tampon Tris-HCl 1 mL et incuber pendant 24 h à 37 ° C et 110 tr/min rotation pour permettre la diffusion de l’enzyme.
2. Ajouter 1 mL de 1 mg/mL p-nitrophényl phosphate, disodique hexahydrate dans Tris-HCl. incuber à 37 ° C, 110 tr/min pour une supplémentaire 10 h. lire l’absorbance surnageante à 415 nm.

Résultats

Après tamisage, microsphères devraient apparaître uniformes et être exempt de granulats. En vertu de la SEM, les microsphères tamisées peuvent avoir des petits pores sur leur surface, mais seront autrement sphériques et lisses, comme illustré à la Figure 1. Tous les filaments extrudés devraient être de diamètre uniforme et de section circulaire. Un filament qui contient des microsphères (PLA-DM/PCL) aura un peu plus mat finish tout en un PCL uniq...

Discussion

Decellularise les deux matrices et 3D impression PCL échafaudages indépendamment auraient dû être divulgués afin de permettre l’adhésion et la prolifération des cellules, valider leur utilisation pour cartilagineuses réparer^10,11,12. L’utilisation de la matrice decellularise de génie d’approches à la réparation des tissus a été un sujet de grand intérêt et le succès dans le passé récent,^...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sieve machine	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Pure
Sieve 90 um	Fisherbrand	170328156	No. 170
Sieve 53 um	Fisherbrand	162513588	No. 270
Sieve 106 um	Fisherbrand	162018121	No. 140
Sputter coater	Leica	n/a
Scanning Electron Microscope	Hitachi, USA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot Spooler	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010023
6" Fan	Comfort Zone, Amazon	n/a
Ultrasonic Water Bath	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	n/a
Drum Mixer	Custom made	n/a	Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
Micro Balance	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	n/a
SolidWorks	SolidWorks	n/a
Microspheres	Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission
p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate	Millipore	4876-5GM
Phosphatase, alkaline	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
Absorbance Reader	Tecan	Sunrise
Tris-HCl Buffer	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
Heated shaker	New Brunswick Scientific	Excella E24