АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает производства поликапролактон (PCL) накаливания с встроенных полимолочной кислоты (НОАК) микросферы, которые содержат decellularized матрицы (DM) для 3D печати структурные ткани, инженерные конструкции.

Аннотация

3D подложке стремится создавать пользовательские леса, которые являются биологически активных и разместить желаемого размера и геометрии. Термопластичные позвоночника может обеспечить механическую стабильность похож на родной ткани, хотя биологические агенты предлагают композиционные подсказки для клеток-предшественников, привело к их миграции, пролиферации и дифференцирования для воссоздания оригинального тканей / 1,органов2. К сожалению многие 3D печати совместимый, салфетка полимеры (например полимолочной кислоты, PLA) печатных при температуре 210 ° C или выше - температуры, наносят ущерб биопрепаратов. С другой стороны является поликапролактон (PCL), другой тип полиэстер, салфетка, 3D печати материал, который мягче печати Температура 65 ° C. Таким образом, он был предположили, что decellularized внеклеточная матрица (DM), содержащихся в термически защитный барьер PLA могут быть напечатаны в PCL накаливания и остаются в его функциональных конформации. В этой работе ремонт остеохондральные был приложение, для которого был испытан гипотеза. Таким образом свинину хрящ был decellularized и инкапсулируются в полимолочной кислоты (НОАК) микросферы, которые были затем экструдированного с поликапролактон (PCL) в накаливания производить 3D конструкций через плавленый моделирование осаждения. Конструкции с или без микросферы (PLA-DM/PCL и PCL(-), соответственно) были оценены для различий в особенности поверхности.

Введение

Текущий тканей инженерные методы клинических приложений, таких как кости, хрящи, сухожилия и связки реконструкции использовать авто - и аллотрансплантантов для восстановления поврежденных тканей. Каждый из этих методов осуществляется регулярно как «золотой стандарт» в клинической практике сначала заготовка донорской ткани из больного или трупной матч и затем помещая тканей донора в дефект сайта2. Однако эти стратегии ограничены доноров сайте заболеваемости, нехватка сайт доноров для крупных дефектов, риск инфекции и трудности в поиске имплантатов, которые соответствуют требуемой геометрии. Кроме того исследования показали, что аллотрансплантация тканей, используемых для реконструкции сократили механические и биологические свойства по сравнению с родной ткань3. С учетом этих соображений ткани инженеры недавно обратились к три трехмерные (3D) подложке производить пользовательские, сложные геометрии, которые являются биологически активных и предназначены для размещения дефект размер и форму, обеспечивая достаточную механические свойства до тех пор, пока биологических ремоделирования является завершения.

В идеале леску 3D-печати будет состоять из полимерной основой, которая может сохранить требуется механическая стабильность родной ткани, пока включены biologics предлагают биохимических подсказки для окружающих клеток, приводит к их миграции, распространение, дифференциация и ткани производства2,5. К сожалению большинство конструкций, содержащие биологические компоненты изготавливаются с гели или полимеров, которые слишком слабы, чтобы выдерживать в vivo силы сталкиваются целевых тканей для авто/аллотрансплантата реконструкции. Другие полимеры, такие как полимолочной кислоты (НОАК), салфетка, 3D печати и структурно звук, но печатаются при температурах или выше 210 ° C - что делает невозможным для биопрепаратов будет совместно печатных во время изготовления. Поликапролактон (PCL) является другой FDA-очищены, салфетка полимер, который может быть 3D печати при низкой температуре (65 ° C), которая становится все более популярным в изготовлении имплантатов пациенту конкретных с сложных морфологии5,6 ,,78,9. Однако большинство bioprinters пневматические технологии делают невозможным печати PCL при более низких температурах, где биологическая деятельность может остаться целым и невредимым. На сегодняшний день, интеграции этих полимеров с auto/аллотрансплантация тканей в романе биоматериала для печати еще предстоит сделать. В отсутствие такого материала вряд ли правда ткани инженерии подход к восстановлению тканей. Таким образом мы стремились объединить НОАК, PCL и decellularized аллотрансплантата матрицы (DM), чтобы использовать преимущества каждого материала для изготовления жизнеспособной конструкции, способные реконструкции комплекса тканей. Этот процесс предоставит первоначальные механическую прочность, необходимо противостоять в vivo силы и термической стабильностью для размещения аддитивного производства в конструкцию, которая стимулирует формирование желаемого ткани.

В последней попыткой решить вышеупомянутые препятствия мы показали, что это возможно для инкапсуляции decellularized хряща внеклеточного матрикса в термически защитный барьер НОАК, который может быть экструдированный в PCL нитей, сохранение способности DM повлиять окружающие клетки узла2. Это вдохновило нас искать клинически эффективные подходы для восстановления тканей. В текущем исследовании мы используем технологию платформы для построения все-в-одном леса, которые включают НОАК, DM и PCL (PLA-DM/PCL).

Наша цель – улучшить эффективность и полезность аллотрансплантантов, используя предлагаемые Роман biofabrication технику, чтобы более точно охарактеризовать родной ткани, в конечном счете использовать их в различных приложениях.

протокол

1. получение и обработка микросферы

  1. Производят микросфер с желаемой матрица инкапсулируются (PLA-DM)2.
    Примечание: Важно, что микросфер, одинакового размера. По этой причине важно просеивание микросферы до использования. Хотя в предыдущих публикаций2были подробные матрицы decellularization и инкапсуляции, следует краткое изложение этого процесса.
    1. Во-первых урожай хряща вилки из свиных задних конечностей. Decellularize хряща в серии автомойки с 0,05% трипсина/0.5 мм пирофосфат Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), модифицированная Дульбекко орла среднего (DMEM) и 1,5% надуксусной кислоты и 2,0% Тритон X-100 для 4 h с дистиллированной воды автомойки до и после каждого шага2.
    2. Слива decellularized матрица, заморозить его, lyophilize, шлифуют и растворяются в раствора пепсина. После распада mix пепсин решение с пла, который был распущен в дихлорметаном.
    3. Добавьте смесь каплям в 3% поливинилового спирта в водном растворе. Центрифуга результате микросферы, полоскание, слив и lyophilize снова.
      Примечание: Для получения подробной информации о процессе увидеть ранее опубликованные протокол2.
  2. Сито микросфер.
    1. Убедитесь, что все сито пластины были тщательно очищены и сухой перед использованием. При необходимости, чистый сита с помощью ультразвуковой очиститель для обеспечения удаления всех сферах из сита.
    2. Соберите просеивающая машина с 106 лоток сито мкм в верхней, 53 мкм лоток после того, как это и сито Пан в нижней.
    3. Поместите сухие микросфер в верхнее сито лоток и поместите крышку на верхний лоток. Включите грубый рассев на 8-10 мин повторить на штраф за 8-10 мин.
      Примечание: Время сито может потребоваться быть увеличена или уменьшена в зависимости от пакета.
    4. Осторожно удалите сито пластины по одному и место их вниз на бумаге большой вес. Постучите по стенкам осторожно, чтобы обеспечить, что большинство сфер упали из сита и на бумаге.
    5. Отбросить негабаритных сферах (> 106 мкм) и низкорослые сферах (< 53 мкм). Добавьте сферы, которые находятся в диапазоне размер 53-106 мкм до помечены пластиковых пробирок с тип и номер серии, то место в холодильнике-20 ° C до дальнейшего использования.

2. Микросфера контроля качества оценок

Примечание: Смотрите Рисунок 1.

  1. Выполните макроскопических/визуальной оценки для проверки, что микросфер единообразных и сферических, с не агрегатов настоящего.
  2. Оцените микросфер с помощью сканирования электронная микрофотография (SEM).
    1. Для этого, место микросфер на SEM Чак и распыления пальто с золото палладия в атмосфере аргона с помощью распыления нанесения покрытий толщиной 4 Нм.
    2. Наблюдать за особенности поверхности, морфология и диаметром микросфер с помощью 10 кв ускорения напряжения и рабочее расстояние 10 мм для обеспечения производства и просеивания микросфер был успешным.

3. накаливания создание для 3D печати

  1. Измерьте и запишите массы микросферы, полученные из шагов 2 и 3; необходима по крайней мере 25 g.
  2. Добавьте порошок поликапролактон (PCL) микросферы для 1:4 соотношение веса микросфер для PCL.
  3. Смешать смесь порошка на миниатюрные подвижного смеситель на 20 об/мин за 5 мин затем flip контейнер и смешать в 20 об/мин для дополнительных 5 мин (см. Рисунок 2).
  4. Многие коммерчески доступных экструдеров, (см. Таблицу материалов) имеют теплоизоляционные жакеты, потому что их предполагаемого рабочих температур для традиционных плавленый осаждения моделирования (FDM) нитей. Измените экструдера (при необходимости) путем удаления изоляционного материала и использовать его в сочетании с Настольные вентиляторы (которые удар окружающего воздуха на экструдер и экструдированные нити) для использования экструдера при более низких температурах.
    Примечание: Настольные вентиляторы, которые дуют окружающего воздуха для охлаждения экструдера и накаливания являются полезными для выполнения этой процедуры.
  5. Настройка установки оборудования для экструзии. Смотрите Рисунок 3.
    1. Установка экструдера, таким образом, что ее выход ~ 60 см от входа к очереди печати, с прямой путь от розетки экструзии на входе в очереди.
      Примечание: Диспетчер очереди печати может при необходимости быть поднят 3-4 дюймов от скамьи если обнаруживается, что нить накала свисающих до точки прикосновения benchtop.
    2. Место Настольный вентилятор ~ 15 см от нагревательной рубашкой и направить его к нагревательной рубашкой предложить охлаждения с окружающим воздухом всей накаливания производства. Разместите второй Вентилятор охлаждения примерно на полпути между экструдера и очереди и направить его к extrudate для оказания помощи в охлаждения накаливания с окружающим воздухом.
    3. Настройте расположение при необходимости на протяжении всего процесса.
  6. Задать изменение экструдер, нагревательный элемент для 52 ° C, повернуть на рабочем столе, вентиляторы и позволяют инструмент прийти к равновесию на 20-30 мин убедитесь, что правильной насадке прилагается к экструдера.
  7. Перед началом, заполните экструдер Хоппер смесью Микросфера/PCL от шагу 3.3. Включите очереди и шнек экструдера инициировать экструзии нити накала.
  8. Когда первоначальный накаливания выдавливается, вручную вытащить extrudate из розетки экструзии с щипцами и кормить его накаливания очереди.
  9. Желаемого накаливания займет некоторое время, чтобы выйти из диспетчера очереди печати. С помощью отдельных катушек или ленты, пометив когда состав накаливания визуально отображается форма.
  10. Внимательно следить за процессом и при необходимости измените параметры. Отрегулируйте Экструдер температуры, скорость шнека экструзии и скорость очереди для получения 1,75 мм диаметр нити как измеряется суппортов. Отрегулируйте вентиляторы для охлаждения накаливания правильно, чтобы избежать некруговых накаливания сечений. Смешать и пополнить бункера при необходимости.
    Примечание: Пристальное внимание во время этого процесса для получения адекватного накаливания для последующего 3D печати не требуется. Перечисленных выше параметров будет меняться в зависимости от условий окружающей среды, уровень заполнения и однородности смеси в бункер и термодинамика и потока динамику конкретных партий PCL и микросферы.
  11. Продолжают прессовать до тех пор, пока все порошка был использован и бункера почти пуст. Добавьте порошок PCL (без микросферы) в бункер для промывки Микросфера смесь, которая в настоящее время в экструдере. Продолжайте добавлять PCL порошок бункера до тех пор, пока не более микросферы видны в extrudate.
  12. Убедитесь, что ярлык и отдельные нити, которая содержит микросфер в нужной концентрации, как после накала охлаждается это труднее отличить единообразных накаливания от неоднородной накаливания.
  13. Экструзии до тех пор, пока существует минимальный порошок оставил в бункере, а затем выключить очереди, шнек экструдера, Экструдер нагревательный элемент и болельщиков.

4. печать с нити накаливания

  1. Дизайн геометрии нужную форму и форму, с помощью компьютера автоматизированного проектирования программного обеспечения. Затем нарежьте модель и диктовать траектории с помощью нарезки программного обеспечения, который совместим с 3D печатной машине используется.
  2. Загрузите накаливания из шага 3 на любой стандартной FDM принтер оснащен стандартной форсунки желаемого диаметра (обычно 0.4 мм). Начало печати (обычно на 65-70 ° C и 300 мм/мин линейной скорости) как пользовательские накаливания наплавленного слоя на машине.
  3. Убедитесь в том обратить особое внимание на первый слой и настройте параметры, как необходимо получить хорошее качество печати.
    Примечание: Корректировки могут производиться скорость печати, печати температуры, температуры платформы, экструзии множитель и другие параметры. Обратитесь к принтеру и нарезки производителя руководство по устранению неполадок для дальнейшей помощи.

5. контроль качества оценки

  1. Напечатанные конструкции на SEM патроны и распыления пальто с золото палладия в атмосфере аргона с помощью распыления нанесения покрытий толщиной 4 Нм.
  2. Наблюдать под микроскопом с помощью 10 кв, ускорения напряжения и 10 мм Рабочее расстояние, чтобы проверить особенности поверхности и наличие или отсутствие микросферы, если применимо.

6. функциональное тестирование печатных конструкций

Примечание: Щелочной фосфатазы (ALP) может использоваться как суррогат для decellularized матрицы для определения, если инкапсулированное белки являются биологически активными после накаливания производственного процесса. ALP используется потому, что она катализирует реакцию от субстрата, p нитрофенил фосфат, чтобы изменить от бесцветного желтый субпродуктов, p нитрофенола и неорганического фосфата, но только если отель ALP находится в функциональной конформации.

  1. Печатать геометрии (n = 3), имеет массу конца по крайней мере 400 мг с ALP Микросфера накаливания (PLA-ALP/PCL) с использованием одинаковых параметров печати как подмости пла-DM/PCL. Также печати PCL-только (подмости PCL(-)) той же геометрии, как подмости пла-ALP/PCL. Погружать их в 1 мл трис-HCl буфере и инкубировать в течение 24 ч при 37 ° C и 110 rpm вращения позволяет фермента диффузии.
  2. Добавьте 1 mL 1 мг/мл p нитрофенил фосфат, натрия гексагидрат в Tris-HCl. инкубировать при 37 ° C, 110 rpm для дополнительных 10 h. читать супернатанта поглощения в 415 Нм.

Результаты

После просеивания, микросферы должны появиться единообразных и быть свободным от агрегатов. В SEM фильтруют микросферы могут иметь небольшие поры на их поверхности, но в противном случае будет сферических и гладкой, как показано на рисунке 1. Все экструд...

Обсуждение

Оба decellularized матрицы и 3D печати PCL подмостей независимо было показано, чтобы позволить адгезии и пролиферацию клеток, проверка их использования для остеохондральные ремонт10,,1112. Использование decellularized матрицы в технических подходах к тк...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Этот проект частично финансировался грант от детской ортопедической общества Северной Америки (ПОСНА) и национальных институтов здравоохранения предоставляют NIBIB R21EB025378-01 (произвольное биоинженерии исследовательский грант).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Sieve machineHaver & Boecker TylerRo-Tap RX 29-E Pure
Sieve 90 umFisherbrand170328156No. 170
Sieve 53 umFisherbrand162513588No. 270
Sieve 106 umFisherbrand162018121No. 140
Sputter coaterLeican/a
Scanning Electron MicroscopeHitachi, USAn/a
Filabot EX2Filabot.comFB00061
Filabot SpoolerFilabot.comFB00073
CAPA 6506Perstorp24980-41-4
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010023
6" FanComfort Zone, Amazonn/a
Ultrasonic Water BathCole ParmerSK-08895-13
DreamerFlashForgen/a
Drum MixerCustom maden/aSimilar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip=
no&gclid=CjwKCAjw-
dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0
dTjsraEsBGfhMEH7ytx
LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_
ixoC9GwQAvD_BwE
Micro BalanceMettler Toledo, Fisher Scientific01-913-851
Simplify3DSimplify3Dn/a
SolidWorksSolidWorksn/a
MicrospheresProduced in-house, see concurrently submitted JoVE submission
p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrateMillipore4876-5GM
Phosphatase, alkalineRoche Diagnostics GmbH10 713 023 001
Absorbance ReaderTecanSunrise
Tris-HCl BufferSigma-AldrichT6455-100ML
Heated shakerNew Brunswick ScientificExcella E24

Ссылки

  1. Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -. T., Leahy, J. C. Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone. Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).
  2. Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -. Y., Whitlock, P. Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold. Biofabrication. , (2018).
  3. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  4. Hutmacher, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).
  5. Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -. Y. Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering. Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).
  6. Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).
  7. Lin, C. -. Y., et al. Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).
  8. Lin, C. -. Y., Hsiao, C. -. C., Chen, P. -. Q., Hollister, S. J. Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization. Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).
  9. Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer. New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).
  10. Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration. Biomaterials. 37, 230-241 (2015).
  11. Zhang, W., et al. The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing. Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).
  12. Williams, J. M., et al. tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering. Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).
  13. Monibi, F. A., Cook, J. L. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).
  14. Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).
  15. Sutherland, A. J., Detamore, M. S. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromolecular Bioscience. , (2015).
  16. Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration. Biomaterials. , (2007).
  17. Whitlock, P. W., et al. Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression. Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).
  18. Whitlock, P. W., et al. A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration. Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).
  19. Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment. Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).
  20. Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
  21. Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  22. Guan, Y., et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).
  23. Dean, R. L. Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143Biofabrication3DDecellularized

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены