Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Polycaprolactons (PCL) Filament mit eingebetteten Polymilchsäure (PLA) Säure Mikrosphären die decellularized Matrizen (DM) für den 3D-Druck von strukturellen Gewebetechnik Konstrukte enthalten.

Zusammenfassung

3D Bioprinting zielt darauf ab, eigene Gerüste zu schaffen, die sind biologisch aktiv und Platz für die gewünschte Größe und Geometrie. Ein thermoplastischer Backbone kann mechanischen Stabilität ähnlich wie bei nativen Gewebe bereitzustellen, während biologische Agenten kompositorischen Signale zu Vorläuferzellen, bieten ihre Migration, Proliferation und Differenzierung, das ursprüngliche Gewebe wiederherzustellen / Organe,^1,2. Leider sind viele 3D Druck kompatibel, resorbierbaren Polymeren (z. B. Polymilchsäure PLA) gedruckten bei einer Temperatur von 210 ° C oder höher - Temperaturen, sind schädlich für Biologics. Auf der anderen Seite ist Polycaprolactons (PCL), eine andere Art von Polyester, eine bioresorbierbare, 3D druckbare Material, das eine sanftere Druck Temperatur von 65 ° C. Es wurde daher vermutet, dass decellularized extrazelluläre Matrix (DM) enthaltenen thermisch Schutzwall PLA konnte innerhalb von PCL Filament gedruckt werden und bleiben in seine funktionelle Konformation. In dieser Arbeit war osteochondrale Reparatur der Anwendung, für die die Hypothese getestet wurde. Als solche war porcinen Knorpel decellularized und gekapselt in sauren Polymilchsäure (PLA) Mikrosphären, die dann mit Polycaprolactons (PCL) extrudiert wurden in Filament, 3D Konstrukte über fused Deposition Modellierung zu produzieren. Die Konstrukte mit oder ohne die Mikrosphären (PLA-DM/PCL und PCL(-), beziehungsweise) wurden für unterschiedliche Oberflächeneigenschaften ausgewertet.

Einleitung

Aktuelle Gewebe-engineering-Techniken für klinische Anwendungen wie Knochen, Knorpel, Sehnen und Bänder Wiederaufbau verwenden Sie Auto und Allografts, um geschädigtes Gewebe zu reparieren. Jede dieser Techniken wird routinemäßig als "Goldstandard" in der klinischen Praxis durchgeführt, indem zuerst Ernte Spendergewebe entweder der Patient oder ein cadaveric Spiel, und dann das Spendergewebe in den defekt Seite². Allerdings sind diese Strategien durch Spender Website Morbidität, Spender Website Knappheit für große Mängel, Risiko von Infektionen und Schwierigkeiten, die Transplantate, die die gewünschte Geometrie entsprechen begrenzt. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass Allografts verwendet für den Wiederaufbau mechanische und biologische Eigenschaften im Vergleich zu nativen Gewebe³reduziert haben. Mit diesen Überlegungen im Auge Gewebe-Ingenieure vor kurzem wandte sich an drei dreidimensionale (3D) Bioprinting, kundenspezifische, komplexe Geometrien herzustellen, die sind biologisch aktiv und entwickelt, um die Defekt-Größe und Form und bietet ausreichend Platz für mechanischen Eigenschaften bis biologischen Umbau abgeschlossen ist.

Im Idealfall bestünde ein 3D-gedruckten Gerüst aus Polymeren Rückgrat, die die erforderliche mechanische Stabilität des nativen Gewebe behalten können, während die eingearbeiteten Biologics biochemische Signale bieten zu umgebenden Zellen, was zu ihrer Migration, Verbreitung, Differenzierung und Gewebe Produktion^2,5. Leider sind die meisten Konstrukte, die biologische Komponenten enthalten gemacht mit Gels oder Polymeren zu schwach, um in Vivo erlebt durch die gezielte Gewebe für Auto/Allograft Wiederaufbau standhalten. Andere Polymere wie Polymilchsäure (PLA) sind bioresorbierbare, 3D druckbare und strukturell klingen, aber sind bei Temperaturen bei oder über 210 ° C - so dass es unmöglich für Biologics Co gedruckten während der Fertigung werden gedruckt. Polycaprolactons (PCL) ist eine andere-FDA-Zulassung, bioresorbierbare Polymer, das 3D bei einer niedrigeren Temperatur (65 ° C), die in der Herstellung von patientenspezifischen Implantaten mit komplexer Morphologien^{5,6 immer beliebter geworden ist gedruckt werden kann ,7,8,9}. Aber machen die meisten Bioprinters, die mit pneumatischer Technologie es unmöglich, PCL bei niedrigeren Temperaturen zu drucken, wo biologische Aktivitäten unverletzt bleiben kann. Bisher hat die Integration dieser Polymere mit Auto/Allografts in neuartigen druckbare Biomaterial noch erreicht werden. In Ermangelung eines solchen Materials ist eine wahre Gewebezüchtungen Herangehensweise an Gewebe Wiederaufbau unwahrscheinlich. Deshalb haben wir versucht, PLA, PCL, kombinieren und decellularized Allograft Matrizen (DM), die Vorteile der einzelnen Materialien zu verwenden, um eine tragfähige Konstruktion in der Lage, komplexe Gewebe zu rekonstruieren herzustellen. Dabei böte die erste mechanische Festigkeit muß widerstehen in Vivo Kräfte und der thermischen Stabilität, additiven Fertigung in einem Konstrukt unterzubringen, die Bildung der gewünschten Gewebe induziert.

In einem letzten Versuch an die oben genannten Hürden haben wir gezeigt, dass ist es möglich, decellularized Knorpel extrazelluläre Matrix innerhalb einer thermisch Schutzbarriere PLA Kapseln, die in PCL Fäden extrudiert werden können Aufrechterhaltung der Fähigkeit des DM, umliegenden Host Zellen²zu beeinflussen. Dies inspirierte uns klinisch wirksame Konzepte für den Wiederaufbau der Gewebe zu suchen. In der aktuellen Studie nutzen wir die Plattformtechnologie zur all-in-One-Gerüste bauen, die PLA, DM und PCL (PLA-DM/PCL) enthalten.

Unser Ziel ist es zur Verbesserung der Wirksamkeit und Nützlichkeit von Allografts mit der vorgeschlagenen Roman Biofabrication Technik, genauer rekapitulieren nativen Gewebe, um sie letztendlich in verschiedenen Anwendungen zu verwenden.

Protokoll

1. Erhalt und Vorverarbeitung Mikrosphären

1. Mikrosphären mit dem gewünschten Matrix gekapselt (PLA-DM)²zu produzieren.
   Hinweis: Es ist unerlässlich, dass die Mikrosphären einheitlicher Größe. Aus diesem Grund ist es unerlässlich, Siebung der Mikrosphären vor dem Gebrauch. Obwohl in früheren Publikationen²Matrix Decellularization und Kapselung detaillierte worden, folgt eine kurze Zusammenfassung des Prozesses.
   1. Erstens ernten Sie Knorpel Stecker von porcinen Hinterbeine. Decellularize des Knorpels in einer Reihe von Waschungen mit 0,05 % Trypsin/0,5 mm Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA), Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM) und 1,5 % Peressigsäure und 2,0 % Triton x-100 für 4 h mit destilliertem Wasser wäscht vor und nach jedem Schritt².
   2. Ablassen der decellularized Matrix, Einfrieren, lyophilize, Schleifen und lösen sich in Pepsin Lösung. Mischen Sie nach Auflösung die Pepsin-Lösung mit PLA die in Dichlormethan aufgelöst worden ist.
   3. Die Mischung in eine 3 % Polyvinylalkohol in Wasserlösung tropfenweise hinzufügen. Zentrifugieren Sie die resultierende Mikrosphären, spülen, abtropfen lassen und wieder lyophilize.
      Hinweis: Ausführliche Informationen über den Prozess finden Sie unter den zuvor veröffentlichten Protokoll Nr.².
2. Sieb die Mikrosphären.
   1. Stellen Sie sicher, dass alle Sieb Platten gründlich gereinigt wurden und sind vor der Verwendung trocken. Wenn nötig, saubere Siebe mit Ultraschall Reiniger um sicherzustellen, dass alle Kugeln vom Sieb entfernt werden.
   2. Montieren Sie den Sieb Shaker mit 106 µm-Sieb-Fach an der Spitze, das 53 µm Fach nach, und das Sieb unten schwenken.
   3. Legen Sie trockenere Mikrosphären in das oberste Sieb-Fach und legen Sie den Deckel auf das obere Fach. Schalten Sie groben Siebung für 8 bis 10 min. wiederholen auf Geldstrafe für 8 bis 10 Minuten.
      Hinweis: Die Sieb-Zeiten müssen je nach Charge verringert oder erhöht werden.
   4. Vorsichtig entfernen Sie die Sieb-Platten einzeln und legen Sie sie auf dem Kopf stehend auf einem großen wiegen Papier. Tippen Sie auf den Seiten vorsichtig, um sicherzustellen, dass die meisten der Kugeln aus dem Sieb und auf das Papier gefallen haben.
   5. Die überdimensionalen Sphären zu verwerfen (> 106 µm) und untermaßige Sphären (< 53 µm). Fügen Sie die Kugeln, die im Bereich von 53 bis 106 µm Größe zu einem beschrifteten Zentrifugenröhrchen mit der Art und Batch dann Platz im Gefrierschrank-20 ° C bis zur weiteren Verwendung.

(2) Mikrosphären Qualitätskontrolle Bewertungen

Hinweis: Siehe Abbildung 1.

1. Führen Sie makroskopische/visuelle Bewertung zu überprüfen, dass die Mikrosphären einheitlich und kugelförmig, mit keine Aggregate vorhanden sind.
2. Die Mikrosphären mit einem scanning Electron Schliffbild (SEM) zu beurteilen.
   1. Dazu Platz Mikrosphären auf ein SEM chuck und sputter-Mantel mit Gold-Palladium in Argon-Atmosphäre mit einem Sputter Coater auf eine Dicke von 4 nm.
   2. Beobachten, Oberflächeneigenschaften, Morphologie und Durchmessern von den Mikrosphären mit einer 10 kV Spannung und einem 10 mm Arbeitsabstand zu beschleunigen, um sicherzustellen, dass die Produktion und Siebung von den Mikrosphären erfolgreich war.

3. Filament Kreation für den 3D-Druck

1. Messung und Aufzeichnung der Mass die Mikrosphären aus Schritt 2 und 3 erhalten; mindestens 25 g ist erforderlich.
2. Die Mikrosphären für eine 1:4-Gewichts-Verhältnis von Mikrosphären zu PCL Polycaprolactons (PCL) Pulver hinzufügen.
3. Mischen Sie die Pulvermischung auf eine Miniatur rollenden Mischer bei 20 u/min für 5 min dann drehen Sie den Behälter und mischen bei 20 u/min für eine zusätzliche 5 min (siehe Abbildung 2).
4. Viele im Handel erhältlichen Extruder (siehe die Tabelle der Materialien) haben isolierende Jacken, weil ihre beabsichtigten Arbeitstemperaturen für traditionelle fused Deposition modeling (FDM) Filamente sind. Ändern Sie den Extruder durch das isolierende Material entfernen (falls erforderlich) zu und verwenden Sie es in Kombination mit Tischventilatoren (die Umgebungsluft auf den Extruder und extrudierten Filament wehen), des Extruders bei niedrigeren Temperaturen zu verwenden.
   Hinweis: Desktop-Lüfter die Luft zur Kühlung der Extruder und Filament wehen eignen sich für dieses Verfahren.
5. Richten Sie das Geräte-Setup für die Extrusion. Siehe Abbildung 3.
   1. Richten Sie den Extruder, so dass dessen Ausgang ~ 60 cm vom Einlass an den Spooler mit einen direkten Weg aus der Extrusion-Steckdose mit dem Spooler-Einlass ist.
      Hinweis: Der Spooler kann optional 3-4 Zoll von der Bank ausgelöst werden wenn feststeht, dass der Faden bis zu dem Punkt der Berührung der Benchtop herabhängenden ist.
   2. Legen Sie eine Desktop-Fan ~ 15 cm von der Heizmantel und in Richtung Heizmantel Kühlung mit Luft während der Filament-Produktion anbieten. Legen Sie einen zweiten Lüfter etwa auf halbem Weg zwischen dem Extruder und Spooler und richten Sie es auf das Extrudat, bei der Kühlung der Glühfaden mit Umgebungsluft.
   3. Passen Sie die Positionierung bei Bedarf während des Prozesses.
6. Den modifizierte Extruder Heizelement auf 52 ° C eingestellt, auf dem Desktop Lüfter drehen und ermöglichen das Instrument zu Gleichgewicht für 20 bis 30 min. Stellen Sie sicher, dass die richtige Düse des Extruders angebracht ist.
7. Kurz vor Beginn, füllen Sie den Extruder-Trichter mit der Mikrosphären/PCL Mischung aus Schritt 3.3. Schalten Sie den Spooler und die Schnecke Extruder Extrusion von Filament zu initiieren.
8. Wenn das erste Filament extrudiert wird, manuell das Extrudat aus der Extrusion-Steckdose mit der Pinzette ziehen und an dem Glühfaden-Spooler zu ernähren.
9. Das gewünschte Filament dauert seine Zeit, aus den Spooler zu kommen. Mit getrennten Spulen oder Klebeband, eindeutig kennzeichnen Sie die Filament-Zusammensetzung optisch einheitlich erscheint.
10. Den Prozess überwachen und Parameter nach Bedarf ändern. Passen Sie die Extruder-Temperatur, Extrusion Schneckendrehzahl und Spooler Geschwindigkeit zu einem 1,75 mm Durchmesser Filament Bremssättel gemessen. Passen Sie die Fans nach Abkühlen den Faden richtig zur Vermeidung unrunde Filament Querschnitte Bedarf an. Mischen Sie und füllen Sie den Behälter nach Bedarf.
    Hinweis: Große Aufmerksamkeit wird während dieses Prozesses, angemessene Filament für nachfolgende 3D-Druck zu erhalten benötigt. Die oben genannten Parameter ändert sich abhängig von den Umgebungsbedingungen, Füllstand und Einheitlichkeit der Mischung in den Trichter und die Thermodynamik und Flow Dynamik der bestimmten Chargen von PCL und Mikrosphären.
11. Fahren Sie fort, Extrudieren, bis alle des Pulvers verwendet wurde und der Behälter fast leer ist. Den Trichter zu spülen, die Mikrosphären-Mischung, die derzeit im Extruder fügen Sie PCL-Pulver (ohne Mikrosphären hinzu). Weiter den Trichter PCL Pulver hinzu, bis keine weitere Mikrosphären in das Extrudat sichtbar sind.
12. Achten Sie darauf, beschriften und separate Heizfaden enthält die Mikrosphären in der gewünschten Konzentration, als nach dem Heizfaden Abkühlen ist schwieriger zu einheitlichere Filament von ungleichmäßigen Filament zu unterscheiden.
13. Extrudieren bis gibt es minimale Pulver in den Trichter links weiter, dann schalten Sie den Spooler, Extruder Schnecke, Extruder-Heizelement und Lüfter.

(4) Drucken mit dem Filament

1. Entwerfen Sie eine Geometrie der gewünschten Form und Form mit einem Computer-aided-Design-Software. Dann schneiden Sie das Modell und diktieren des Werkzeugwegs mit slicing-Software, die kompatibel mit der 3D Druckmaschine verwendet wird.
2. Laden Sie das Filament aus Schritt 3 auf jeden Standarddrucker FDM mit Standarddüsen mit dem gewünschten Durchmesser (in der Regel 0,4 mm) ausgestattet. Wie die benutzerdefinierte Filament abgeschiedenen Schicht für Schicht durch die Maschine ist beginnen Sie den Druck (in der Regel mit 65-70 ° C und 300 mm/min lineare Geschwindigkeit).
3. Achten Sie darauf, besonderes Augenmerk auf die erste Schicht und passen die Einstellungen wie erforderlich, um eine gute Qualität drucken.
   Hinweis: Um die Druckgeschwindigkeit, Drucktemperatur Plattform Temperatur, Extrusion Multiplikator und andere Parameter können Anpassungen vorgenommen werden. Beziehen sich auf den Drucker und slicing Hersteller Anleitung zur Fehlerbehebung für weitere Unterstützung.

5. Qualitätskontrolle Beurteilung

1. Legen Sie die gedruckten Konstrukte auf SEM Chucks und sputter-Mantel mit Gold-Palladium in Argon-Atmosphäre mit einem Sputter Coater auf eine Dicke von 4 nm.
2. Beobachten, unter dem Mikroskop mit einer 10 kV Spannung und einem 10 mm Arbeitsabstand zu beschleunigen, Oberflächeneigenschaften zu überprüfen und für das Vorhandensein oder Fehlen von Mikrosphären, falls zutreffend.

6. Funktionsprüfung der gedruckten Konstrukte

Hinweis: Alkalischer Phosphatase (ALP) kann verwendet werden als Ersatz für decellularized Matrix um festzustellen, ob gekapselte Proteine nach der Glühfaden Herstellung biologisch aktiv sind. ALP wird verwendet, weil es eine Reaktion von einem Substrat, p-Nitrophenyl Phosphat, Wechsel von farblos zu gelben Nebenprodukte, p-Nitrophenol und anorganischem Phosphat katalysiert, aber nur, wenn ALP in die funktionelle Konformation ist.

1. Drucken Sie eine Geometrie (n = 3), die hat eine Ende-Masse von mindestens 400 mg mit der ALP Mikrosphären Filament (PLA-ALP/PCL) mit identischen Druckparameter als PLA-DM/PCL-Gerüste. Auch drucken PCL-nur (PCL(-)) Gerüste die gleiche Geometrie wie der PLA-ALP/PCL-Gerüste. Tauchen sie ein in 1 mL Tris-HCl-Puffer und inkubieren Sie für 24 h bei 37 ° C und 110 u/min drehen um Enzym Verbreitung zu ermöglichen.
2. Fügen Sie 1 mL 1 mg/mL p-Nitrophenyl Phosphat, Binatrium-Hexahydrat in Tris-HCl. Inkubation bei 37 ° C, 110 u/min für eine zusätzliche 10 h. lesen überstand Extinktion bei 415 nm.

Ergebnisse

Nach Siebung, sollten Mikrosphären erscheinen einheitlich und frei von Aggregaten. Unter SEM werden die gesiebten Mikrosphären möglicherweise kleine Poren auf der Oberfläche, jedoch ansonsten sphärische und glatt, wie in Abbildung 1dargestellt. Alle extrudierten Filamente sollte der einheitlichen Durchmesser und kreisförmigen Querschnitt. Ein Filament, das Mikrokugeln (PLA-DM/PCL) enthält haben eine etwas mehr Matte während einer PCL-nur zu beenden (P...

Diskussion

Beide decellularized Matrizen und 3D gedruckte PCL Gerüste haben unabhängig voneinander gezeigt worden, um Adhäsion und Proliferation von Zellen, überprüfen ihre Verwendung für osteochondrale^10,11,12reparieren lassen. Die Verwendung von decellularized Matrix engineering Ansätze zur Gewebereparatur wurde ein viel Interesse und Erfolg in der jüngsten Vergangenheit^2,3

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sieve machine	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Pure
Sieve 90 um	Fisherbrand	170328156	No. 170
Sieve 53 um	Fisherbrand	162513588	No. 270
Sieve 106 um	Fisherbrand	162018121	No. 140
Sputter coater	Leica	n/a
Scanning Electron Microscope	Hitachi, USA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot Spooler	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010023
6" Fan	Comfort Zone, Amazon	n/a
Ultrasonic Water Bath	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	n/a
Drum Mixer	Custom made	n/a	Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
Micro Balance	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	n/a
SolidWorks	SolidWorks	n/a
Microspheres	Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission
p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate	Millipore	4876-5GM
Phosphatase, alkaline	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
Absorbance Reader	Tecan	Sunrise
Tris-HCl Buffer	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
Heated shaker	New Brunswick Scientific	Excella E24