3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬

요약

이 프로토콜의 구조 조직 구조 엔지니어링 3D 인쇄를 decellularized 행렬 (DM)를 포함 하는 임베디드 polylactic 산 (PLA) 스피어와 polycaprolactone (PCL) 필 라 멘 트의 생산을 설명 합니다.

초록

3D bioprinting 사용자 정의 건설 기계는 생물학적으로 활성화 되며 원하는 크기 및 형상을 만드는 것을 목표로. 생물 학적 요원 원래 조직 reconstitute 그들의 이동, 확산, 그리고 차별화 선도 조상 세포, 작곡 단서 제공 열가 소성 백본 기본 조직에 유사한 기계적 안정성을 제공할 수 있습니다 / 장기^1,2. 불행히도, 많은 3D 인쇄 호환, bioresorbable 고분자 (polylactic 산, PLA) 등 210 ° C의 온도에서 인쇄 또는 높은-온도 인터 루 킨에 해로운. 다른 한편으로, polycaprolactone (PCL), 폴 리 에스테 르의 다른 종류는 bioresorbable, gentler 인쇄 온도 65 ° c.의 3D 인쇄 자료 따라서, 가상 했다 decellularized 세포 외 매트릭스 (DM) 열 보호벽 PLA에 포함 된 PCL 필 라 멘 트 내에서 인쇄할 수 및 그것의 기능 형태에 남아. 이 작품에서는, osteochondral 복구 가설을 테스트 하는 응용 프로그램을 했다. 이와 같이, 돼지 연골 decellularized 고 3D 구문을 통해 됐 증 착 모델링 생산 하 필 라 멘 트로 polycaprolactone (PCL)와 다음 압출 했다 polylactic 산 (PLA) 스피어에 캡슐화. 구조는 스피어의 유무에 관계 없이 (PLA-DM/PCL와 PCL(-), 각각) 표면 기능에서 차이 대 한 평가 했다.

서문

뼈, 연골, 힘 줄, 인 대 재건 등 임상 응용 프로그램에 대 한 현재 조직 공학 기술을 사용 하 여 자동-이식 손상 된 조직을 복구 하. 이러한 기술 각각을에서 수행 됩니다 정기적으로 "금 표준"으로 임상 연습으로 먼저 기증자 조직 환자 또는 일치 하는 시체에서 수확 후 기증자 조직 결함 사이트²에. 그러나, 이러한 전략은 기증자 사이트 사망률, 기증자 사이트 부족 큰 결함, 감염, 그리고 어려움 원하는 형상을 일치 하는 이식의 위험에 의해 제한 됩니다. 또한, 연구 재건을 위해 사용 하는 이식 기계 및 생물 학적 속성 기본 조직³에 비해 감소 했다 나타났습니다. 염두에 두고 이러한 고려 하 여 조직 엔지니어 최근을 아닙니다 생산을 생물학적으로 활성 결함 크기와 모양 제공 하면서 충분 한 수용 하도록 설계 된 사용자 지정, 복잡 한 형상의 3 차원 (3D) bioprinting 기계적 생물 학적 개장 완료 될 때까지 속성입니다.

이상적으로, 3D 인쇄 비 계 이루어져 있을 것입니다 통합된 biologics 세포, 그들의 이동, 확산에 지도 주변에 생 화 확 적인 신호를 제공 하는 동안 네이티브 조직의 필요한 기계적 안정성을 유지할 수 있는 고분자 백본 차별화, 그리고 조직 생산^2,5. 불행 하 게도, 생물 학적 구성 요소를 포함 하는 대부분의 구문 젤 또는 vivo에서 세력 자동/이식 재건에 대 한 대상된 조직에 의해 경험을 견딜 수 있도록 너무 약한 폴리머로 만들어집니다. Polylactic 산 (PLA) 등 다른 고분자 bioresorbable, 3D 인쇄 및 구조적으로 소리, 하지만 그건 불가능 biologics 되어야 공동 제작 중-210 ° C 이상 온도에서 인쇄 됩니다. Polycaprolactone (PCL)는 다른 FDA 허가 bioresorbable 폴리머 3D 복잡 한 형태학^{5,6 환자 특정 이식 조작에 점점 더 인기 끌고있다는 낮은 온도 (65 ° C)에서 인쇄 될 수 있는 ,7,,89}. 그러나, 대부분 bioprinters 공 압 기술을 사용 하 여 낮은 온도 생물 학적 활동 무사 히 보관에서 PCL 인쇄 불가능 한 만들. 날짜 하려면, 새로운 인쇄 소재 자동/이식으로 이러한 고분자의 통합 아직 수행할 수 있다. 이러한 자료의 부재, 조직 재건에 대 한 진정한 조직 설계 접근 가능성이 크다. 따라서, 우리 PCL, PLA를 결합 하고자 하 고 이식 행렬 (DM) 복잡 한 조직 재구성의 가능한 구조를 제조 하기 위해서는 각 재료의 장점을 활용 하는 것을 decellularized. 이 프로세스는 vivo에서 힘 및 첨가제 제조 원하는 조직의 형성을 유도 하는 구문에 맞게 열 안정성에 저항 하는 데 필요한 초기 기계적 강도 제공할 것 이다.

전술한 장애물을 해결 하기 위해 최근 시도, 우리 보여주 가능한 내 열 PLA 보호벽 PCL 필 라 멘 트, 내 돌출 될 수 있는 decellularized 연골 세포 외 매트릭스를 캡슐화 하는 것의 능력을 유지 하 주변의 호스트에 영향을 DM²세포. 이 우리 조직 재건에 대 한 임상적으로 효과적인 접근을 추구 하는 영감 하고있다. 현재 연구에서 우리는 PLA, DM, 및 PCL (PLA-DM/PCL)를 포함 하는 모든-에-하나의 공중 발판을 구축 하는 플랫폼 기술을 활용 합니다.

우리의 목표는 개선 효능과 궁극적으로 다양 한 응용 프로그램에서 그들을 사용 하 여 기본 조직, 더 정확 하 게 정리를 제안 된 새로운 biofabrication 기술을 사용 하 여 이식의 유틸리티입니다.

프로토콜

1. 고 스피어 전처리

1. 원하는 매트릭스와 생산 스피어 캡슐화 (PLA-DM)².
   참고: 균일 한 크기의는 스피어는 필수적 이다. 이러한 이유로, 체질 스피어 이전 사용에 필수적 이다. 매트릭스 decellularization 및 캡슐화 이전 간행물²상세한 되었습니다 있지만 프로세스의 간략 한 요약 다음과 같습니다.
   1. 첫째, 돼지 뒷 다리 사지에서 연골 플러그 수확. 0.05 %trypsin / 0.5 m m tetrasodium ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 세척의 시리즈에서 연골을 decellularize, Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 그리고 1.5% 초 산 2.0 %4 h 각 증류수 세척에 대 한 Triton X-100 ²각 단계 전후.
   2. Decellularized 매트릭스, 동결, lyophilize, 갈기, 배수와 펩 신 솔루션으로 해산. 해산, 다음 dichloromethane에 해산 되었습니다 PLA 펩 신 솔루션 믹스.
   3. 물 솔루션에서 3% 폴 리 비닐 알코올에 dropwise 혼합물을 추가 합니다. Centrifuge 결과 스피어, 린스, 드레인, 그리고 다시 lyophilize.
      참고: 상세 과정에 대 한 이전 게시 프로토콜²를 참조 하십시오.
2. 체질은 스피어.
   1. 모든 체 접시 철저 하 게 청소 하 고 사용 하기 전에 건조를 확인 합니다. 필요한 경우 깨끗 한 체를 사용 하 여 초음파 청소기 모든 분야는 체에서 제거 됩니다.
   2. 상단, 하단에 팬, 그리고 체 후 53 µ m 트레이 106 µ m 체 트레이와 체 통을 조립.
   3. 맨 체 트레이에 건조 스피어를 놓고 상단 용지함에 뚜껑을 배치 합니다. 8 ~ 10 분 반복 8 ~ 10 분에 대 한 벌금에 대 한 거친 체질 켭니다.
      참고: 체 시간 증가 하거나 일괄 처리에 따라 감소 해야 합니다.
   4. 조심 스럽게 체 접시 하나 하나 제거 하 고 거꾸로 큰 무게 종이에 그들을 배치. 분야의 대부분은 체 그리고 종이에 졌 되도록 부드럽게 양쪽을 누릅니다.
   5. 대형된 분야를 취소 (> 106 µ m)와 소형 분야 (< 53 µ m). 영역 유형 및 일괄 처리 번호 레이블이 지정 된 원심 분리기 튜브를 53 106 µ m 크기 범위에 있는 다음 추가 사용까지-20 ° C 냉동 고에 장소를 추가 합니다.

2. 스피어 품질 관리 평가

참고: 그림 1을 참조 하십시오.

1. 거시적인/시각적 평가 스피어는 균일 하 고 구형, 아니 집계 존재 확인을 수행 합니다.
2. 스캐닝 전자 현미경 사진 (SEM)을 사용 하 여 스피어를 평가 합니다.
   1. 이 위해, 장소 스피어는 SEM에 척 하 고 코트 4의 두께를 스퍼터 coater를 사용 하 여 아르곤 분위기에서 금-팔라듐을 스퍼터 nm.
   2. 표면 기능, 형태, 및 10를 사용 하 여 스피어의 직경을 관찰 kV 가속 전압 및 10 m m 작동 거리 그 생산 고는 스피어의 체질은 성공적 이었다.

3. 필 라 멘 트 창조 3D 인쇄

1. 측정 및 기록 2, 3; 단계에서 얻은 스피어의 질량 적어도 25 g이 필요 합니다.
2. PCL에 스피어의 1:4 무게 비율에 대 한 스피어를 polycaprolactone (PCL) 분말을 추가 합니다.
3. 5 분 동안 20 rpm에서 소형 회전 믹서에 분말 혼합을 혼합 그리고 플립 컨테이너 추가 5 분 20 rpm에서 혼합 ( 그림 2참조).
4. 많은 상용 압출 기 ( 재료의 표참조) 그들의 의도 된 작업 온도 전통적인 융합된 증 착 모델링 (FDM) 필 라 멘 트 때문에 보 온 자 켓 있다. 단 열 재료를 제거 하 여 압출 기 (필요한 경우)를 수정 하 고 사용 하 게 데스크탑 팬 (이 압출 기 및 압출 된 필 라 멘 트에 주변 공기를 날 려)와 낮은 온도에서 압출 기의 사용을.
   참고: 압출 기 및 필 라 멘 트를 냉각 주위 공기는 데스크탑 팬은이 절차에 대 한 유용 합니다.
5. 돌출에 대 한 장비 설치 설치. 그림 3을 참조 하십시오.
   1. 그 출구는 ~ 60 cm 입구에서 스풀러, 스풀러 인렛에 압출 콘센트에서 직접 경로와 압출 기를 설치.
      참고: 스풀러 올려질 수 있다 선택적으로 벤치에서 3-4 인치는 필 라 멘 트 벤치탑 감동의 지점에 지는 경우.
   2. 데스크톱 팬 난방 재킷에서 ~ 15 cm 놓고 난방 재킷 제공 하는 필 라 멘 트 생산을 통해 주변 공기 냉각을 향해 직접 합니다. 두 번째 냉각 팬 약 압출 기 및 스풀러를 짝수가 놓고 한다 필 라 멘 트 주위 공기를 냉각에 도움을 향해 직접 합니다.
   3. 과정에서 필요에 따라 위치를 조정 합니다.
6. 수정 된 압출 기 52 ° C에가 열을 설정 하 고 냉각 팬, 바탕 화면 설정 20 ~ 30 분 적절 한 노즐에서 압출 기에 연결 되어 있는지 확인에 대 한 균형에와 서 악기를 허용.
7. 그냥 시작 하기 전에, 단계 3.3에서에서 스피어/PCL 혼합물으로 압출 기의 호퍼를 채우십시오. 필 라 멘 트 압출을 시작 하는 스풀러 및 압출 기 도래 켭니다.
8. 초기 필 라 멘 트 압출 수동으로 집게 압출 출구에서 한다 내 고 필 라 멘 트 스풀러에 피드.
9. 원하는 필 라 멘 트 스풀러에서와 서 시간이 걸릴 것입니다. 필 라 멘 트 구성 시각적으로 나타나면 유니폼 마크 명확 하 게 별도 스풀 또는 테이프 using.
10. 프로세스를 자세히 모니터링 하 고 필요에 따라 매개 변수를 수정 합니다. 압출 기 온도, 압출 auger 속도, 및 스풀러를 1.75 m m 직경 멘 캘리퍼스로 측정 된 속도 조정 합니다. 제대로 비 원형 필 라 멘 트 횡단면을 피하려고 필 라 멘 트를 냉각 필요에 따라 팬 들을 조정 합니다. 혼합 하 고 필요에 따라 호퍼 리필.
    참고: 주의 이후 3D 인쇄에 대 한 적절 한 필 라 멘 트를 얻으려면이 과정으로 필요 합니다. 위의 매개 변수는 주위 조건, 채우기 수준 및 호퍼에 혼합의 균일성 및 PCL와 스피어의 특정 배치의 열역학 및 흐름 역학에 따라 변경 됩니다.
11. 계속 모든 파우더는 사용 하 고 호퍼는 거의 비어 때까지 압출 한다. 스피어 혼합물을 압출 기에 현재는 살아 가기 위해 호퍼를 PCL (스피어) 없이 파우더를 추가 합니다. 계속 더 더 스피어는 한다에 표시 될 때까지 호퍼에 PCL 파우더를 추가 합니다.
12. 레이블을 고 별도 필 라 멘 트 후에 필 라 멘 트 그것 냉각으로 원하는 농도에 스피어를 포함 하는 균일 하지 않은 필 라 멘 트에서 균일 한 필 라 멘 트를 구별 하기 어렵게 합니다.
13. 압출 최소한의 파우더는 호퍼에 남아 있을 때까지 계속 다음 스풀러, 압출 기 도래, 압출 기 난방 요소, 그리고 팬 들을 해제 합니다.

4입니다. 인쇄는 필 라 멘 트와 함께

1. 원하는 모양 및 컴퓨터 원조 설계 소프트웨어를 사용 하 여 폼의 형상을 디자인. 다음 모델 슬라이스와 슬라이스 호환 소프트웨어는 사용 중인 3D 인쇄 기계와를 사용 하 여 공구 경로 지시.
2. 로드는 필 라 멘 트 어떤 표준 FDM 프린터에 3 단계에서 원하는 직경 (일반적으로 0.4 m m)의 표준 노즐 장착. 사용자 정의 필 라 멘 트는 예금 된 레이어-의해-레이어 기계에 의해 (65-70 ° C, 300 mm/min 선형 속도)에서 일반적으로 인쇄를 시작 합니다.
3. 첫 번째 계층에 특별 한 관심을 지불 하 고 좋은 품질 인쇄 필요에 따라 설정을 조정 해야 합니다.
   참고: 조정 인쇄 속도, 인쇄 온도, 플랫폼 온도, 압출 배율 및 기타 매개 변수를 만들 수 있습니다. 프린터 및 추가 지원에 대 한 조각화 제조업체의 문제 해결 가이드를 참조 하십시오.

5. 품질 관리 평가

1. Sem의 물림 쇠에 인쇄 된 구조를 놓고 코트 4의 두께를 스퍼터 coater를 사용 하 여 아르곤 분위기에서 금-팔라듐을 스퍼터 nm.
2. 10을 사용 하 여 현미경 관찰 kV 가속 전압 및 거리는 10 m m 표면 기능을 확인 하 고 스피어 경우의 유무에 대 한.

6. 기능 테스트의 인쇄 된 구문

참고: 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 사용할 수 있습니다 decellularized 매트릭스에 대 한 대리로 캡슐화 된 단백질 필 라 멘 트 생산 과정 후 생물학적으로 활성 인지 확인 하. ALP는 기판, p-nitrophenyl 인산 염, 무색에서 노란색 부산물, p-nitrophenol와 무기 인산 염, 변경에서 반응 catalyzes 하지만 ALP 기능 구조에 있는 경우에 사용 됩니다.

1. 인쇄는 형상 (n = 3) PLA-DM/PCL 공중 발판으로 동일한 인쇄 매개 변수를 사용 하 여 높은 산 스피어 멘 (PLA-알프/PCL)와 적어도 400 밀리 그램의 최종 질량 있다. PCL 인쇄-유일한 (PCL(-)) 건설 기계 PLA-알프/PCL 공중 발판으로 동일한 기하학의. 1 mL Tris HCl 버퍼에 잠수함 하 고 37 ° C, 110 rpm 회전 효소 보급 수 있도록 24 h에 대 한 품 어.
2. 1 mg/mL p-nitrophenyl 인산, 트리 스에 disodium hexahydrate의 1 mL을 추가-37 ° C, 추가 10 h. 415에서 표면에 뜨는 흡 광도 읽고에 대 한 110 rpm에서 HCl. 품 nm.

결과

체질, 후 스피어 유니폼 표시 하 고 집계에서 무료로 해야 합니다. SEM, 아래 체질된 스피어 그들의 표면에 작은 숨 구멍을 있을 수 있습니다 하지만 그렇지 않으면 되며 구형 부드러운, 그림 1에서 보듯이. 모든 압출 된 필 라 멘 트 균일 한 직경의 원형 단면 이어야 한다. 필 라 멘 트 스피어 (PLA-DM/PCL)를 포함 하는 약간 더 매트는 PCL 전용 동안 마무리 ?...

토론

두 행렬을 decellularized 하 고 3D 인쇄 PCL 건설 기계는 독립적으로 접착 및 osteochondral에 대 한 그들의 사용의 유효성을 검사 하는 셀의 확산 복구^10,,1112수 있도록 하지 표시 되었습니다. 조직 복구 엔지니어링 접근에서 decellularized 매트릭스를 사용 하 여 많은 관심과 최근^2,3,,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sieve machine	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Pure
Sieve 90 um	Fisherbrand	170328156	No. 170
Sieve 53 um	Fisherbrand	162513588	No. 270
Sieve 106 um	Fisherbrand	162018121	No. 140
Sputter coater	Leica	n/a
Scanning Electron Microscope	Hitachi, USA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot Spooler	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
Phosphate buffered saline, PBS	Gibco	10010023
6" Fan	Comfort Zone, Amazon	n/a
Ultrasonic Water Bath	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	n/a
Drum Mixer	Custom made	n/a	Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
Micro Balance	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	n/a
SolidWorks	SolidWorks	n/a
Microspheres	Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission
p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate	Millipore	4876-5GM
Phosphatase, alkaline	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
Absorbance Reader	Tecan	Sunrise
Tris-HCl Buffer	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
Heated shaker	New Brunswick Scientific	Excella E24