白念珠菌实时细胞外通量实时分析的生物能量学研究

摘要

在这里, 我们提出了一个逐步的协议, 以研究线粒体呼吸和糖酵解功能在白色念珠菌使用一个额外的通量分析仪。

摘要

线粒体是细胞代谢和生存所必需的细胞器。线粒体中发生了多种关键事件, 如细胞呼吸、氧化代谢、信号转导和凋亡。因此, 线粒体功能障碍被报道在病原真菌的抗真菌药物耐受性和毒力中起着重要作用。最近的数据也使人们认识到线粒体作为真菌发病机制的重要因素的重要性。尽管线粒体在真菌生物学中的重要性, 但了解其功能的标准化方法还是很不发达。在这里, 我们提出了一个程序来研究基础耗氧率 (OCR), 线粒体呼吸的测量, 和细胞外酸化率 (ECAR), 一个测量糖酵解功能的 c. 白色念珠菌菌株。本文描述的方法可应用于任何念珠菌菌株, 而无需纯化完整的真菌细胞中的线粒体。此外, 该协议还可以定制, 以筛选线粒体功能抑制剂在白色念珠菌菌株。

引言

侵袭性真菌感染每年在全球造成150多万人死亡。这一数字正在上升, 原因是免疫受损的人数增加, 包括老年人、早产儿、移植接受者和癌症患者¹。白色念珠菌是一种机会性的人类真菌病原体, 是人类微生物群的一部分。它也居住黏膜表面和胃肠道作为一个共同的有机体。白色念珠菌在有免疫缺陷、接受过手术或接受过长期抗生素治疗的人身上会产生严重的全身性疾病。在人类^{2、3、4、5、6、7的}医院传染病 (nid) 中,念珠菌物种名列前三到四个。每年全球念珠菌血液感染的数量估计约为 400, 000 例, 相关死亡率为 46-75¹。仅在美国, 因念珠菌病而导致的年死亡率就约为 10, 000 人。真菌引起的 NID 的范围也反映在天文数字的病人费用⁵中。在美国, 治疗侵袭性真菌感染的年度费用超过20亿美元, 给已经不堪重负的医疗系统增加了巨大的压力。目前, 由于毒性、耐药性日益普遍和药物相互作用, 现有的标准抗真菌疗法有限。因此, 迫切需要确定新的抗真菌药物靶点, 从而为高危患者提供更好的治疗选择。然而, 发现新的药物作用于真菌目标是复杂的, 因为真菌是真核生物。这极大地限制了特定于真菌的药物靶标的数量。

最近的研究表明, 线粒体是真菌毒力和抗真菌药物耐受性的关键因素, 因为线粒体对细胞呼吸、氧化代谢、信号转导和凋亡都很重要^{。 , 9,10,11}。糖酵解代谢和非糖酵解代谢对哺乳动物宿主 ^{12、13、14、15、16的生存}至关重要。此外, 一些缺乏线粒体蛋白的白色念珠菌突变体, 如 goa1、Srr1、Gem1、sam37 等, 在丝状化方面也有缺陷, 这是白色念珠菌^17的一个重要毒力因子,^{18,19,20,21,22}. 此外, 在17、^{18、19、20、21的}小鼠模型中, 这些突变体也因毒力^而减弱 ^,22。因此, 真菌线粒体是药物发现的一个有吸引力的靶点。然而,白色念珠菌线粒体功能的研究具有挑战性, 因为白色念珠菌是小阴性 23, 这意味着它不能生存没有线粒体基因组。

在这里, 我们描述了一个协议, 可以用来研究线粒体和糖酵解功能在c.白色, 而无需净化线粒体。该方法也可以进行优化, 以研究遗传操作或化学调节剂对白色念珠菌线粒体和糖酵解途径的影响。

研究方案

注: 分析的详细逐步协议如下所述, 原理图协议如图 1所示。

1.白色念珠菌菌株和生长条件

1. 在30°c的孵化器振动台中, 在液体酵母提取物-苯并酮-右旋 (ypd) 中培养白色念珠菌菌株。
   注: 保持念珠菌菌株作为冷冻库存和生长在 ypd 琼脂 (1% 酵母提取物, 2% 肽, 2% 葡萄糖, 和2% 琼脂)。

2. 试剂的制备

1. 准备检测介质, 如下所示:
   1. 对于线粒体功能检测, 溶解1.04 克罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640 粉末和2克葡萄糖 (2%)在90毫升无菌水中, 将介质加热至37°c。使用 5M NaOH 将 pH 值调整到 7.4, 并用无菌水将体积调节到100毫升。
   2. 对于糖酵解应力检测, 将 1.04 g RPMI 1640 粉末单独溶解在90毫升无菌水中, 将介质加热到 37°c, 并将 pH 值调整为7.4。用无菌水将体积增加到100毫升。RPMI 1640 粉末没有碳酸氢盐, 这对于监测 pH 值的变化至关重要, 因为在测定过程中, 它是糖酵解的一种测量指标。
2. 注射化合物。
   1. 在无菌水中准备 1 M 葡萄糖, 并储存在-20°c。
   2. 准备 100 mM 的低霉素库存, 以二甲基亚硫醚 (DMSO), 小容量的脂肪, 并存储在-20°c。
   3. 在 DMSO 中准备 100 mM 抗霉素 A 库存, 小批量的脂肪, 并储存在-20°c。
   4. 在测定当天用乙醇制备 100 mM sam (水杨酸)。
   5. 在检测当天在无菌水中制备 1m KCN。

3. 用多 d-赖氨酸 (PDL) 涂装检测板

注: 在层流罩中执行以下所有步骤。

1. 将聚 d 赖氨酸溶解在组织培养等级的水中, 使其最终浓缩50μgml。将其很好地混合到 1.5 mL 的微离心管中, 并长期存放在-20°c。
   注: 每口井需要 50μl, 24 口井需要 1.2 mL 升。因此, 每管至少1.3 毫升。
2. 每口井加入 50μl, 在室温下孵育, 盖上盖子1-2小时。
3. 吸入溶液, 用500μl 无菌组织培养等级的水冲洗一次。
4. 打开盖子, 让水井风干。在同一天使用该板材或在4°c 下存放, 最长为2-3天。

4. 传感器墨盒的水合作用

注: 在实验前一天执行此步骤。

1. 打开额外的通量检测套件并删除内容物。将传感器墨盒倒置到公用板旁边 (图 2)。
2. 用1毫升的校准器填充公用板的每口井, 然后将传感器墨盒放回原处。确保含有荧光的传感器 (用于测量氧气和 pH 值) 被淹没在校准器中。
3. 在37°c 的非 co2 孵化器中孵育传感器墨盒一夜。

5. 在 pdl 涂层板中生长和播种细胞

1. 在 YPD 肉汤中接种白色念珠菌,在30分钟的振动台中长出, 每分钟200转。
   注: 根据分析设计和兴趣,白色念珠菌也可以在 ypg 或最小介质中生长。
2. 在检测当天, 稀释检测介质中适当数量的细胞, 以产生每 100μl 100, 000 细胞的最终浓度。
3. 在检测板的每一口井中加入100Μl 的稀释细胞, 但井 A1、B4、C3 和 D6 除外, 在这些井中, 只添加100Μl 的检测介质进行背景校正 (图 3)。
4. 将板材转移到37°c 的非二氧化碳孵化器, 孵育 60分钟, 使细胞粘附在板表面。

6. 检测协议

注: 此处概述的协议适用于24孔格式的仪器。如果使用另一种格式, 则需要调整卷。

1. 线粒体功能检测
   1. 化合物的制备
      1. 为线粒体功能检测准备10倍浓度的化合物: 在相应的检测介质中制备 20 mM sham、100Μm Oligomycin、100μm KCN 和20μm 安蒂霉素 A。
      2. 在端口 A 中加入 50μl SHAM, 将 55Μl Oligomycin 添加到端口 B, 将 62Μl KCN 添加到端口 c 中, 将68Μl 反痛 A 添加到端口 D (图 4)。
2. 糖酵解应力分析
   1. 化合物的制备
      1. 以10倍浓度的浓度制备化合物用于糖酵解应力测定。在相应的检测介质中制备 100 mM 葡萄糖、100μm 低霉素、500 mM 2-脱氧葡萄糖 (2DG) 和20μm 安提霉素 A。
      2. 将50Μl 葡萄糖添加到端口 A, 55μl Oligomycin 入端口 b, 62μl 2-DG 加入端口 c, 68Μl 反痛 A 添加到端口 D。
3. 采用额外的流量分析仪, 以24孔板的形式测量活细胞的耗氧率 (OCR) 和细胞外酸化率 (ECAR)。提前建立检测方案。
4. 打开额外的流量分析仪, 并使用分析向导选项卡设置分析模板, 并按照一步一步的指令填写设置过程中弹出的所有信息。生成类似于图 5所示的组布局。设置协议, 如表 1所示。在检测之前, 请提前设置这些布局, 并将其保存在计算机中。在检测时, 通过在检测向导选项卡中的打开文件选项中打开相应的文件来恢复保存的协议 (图 5)。
5. 将10倍化合物装入包含校准器的水合传感器墨盒的相应端口, 并将其加载到额外流量分析仪的托架托架中。按屏幕上的"开始" 按钮开始校准。
6. 在井边的电池板上轻轻加入350μl 的检测介质, 以最大限度地减少细胞干扰, 使最终体积达到450μl。
7. 将装有校准器的实用板更换为检测板, 然后继续。
8. 检测完成后, 取出传感器墨盒和板。将文件保存在相应的目标文件夹中。

7. 数据分析

1. 使用软件中的曲线方差分析 (AUC-ANOVA) 分析选项卡下的区域, 通过选择相应的参数 (OCR 或 ECAR) 来计算组之间的显著差异, 如图 6所示。
2. 选择需要比较的组。
3. 添加到方差分析的分析组, 然后单击 "确定"。
   注: 此 AUC 方差分析将向计算每个组的 AUC 的文件中添加一个新工作表, 并由 ANOVA 对它们进行比较。这将给出一个 p 值表, 以显示其重要性。

结果

本协议的重点是确定由额外通量分析仪评估的白色念珠菌的生物能量功能。缺乏线粒体蛋白 Mam33 的白色念珠菌突变体也随补体株一起被包括在内 , mam33 : mam33研究线粒体蛋白的缺失对 OCR 和 ecar 的影响。Sam33编码了假定的线粒体酸性基质蛋白及其在念珠菌中的功能尚不清楚。

用于额外通量...

讨论

生物能学的额外助焊剂分析是通过实时测量氧化磷酸化 (OXPHOS) 依赖氧消耗来读出线粒体功能的一个很好的工具。此外, 还可以同时在实时分析中研究以细胞外酸化率 (细胞外 pH 值的变化) 来测量的糖酵解功能。

在检测板中成功电镀白色念珠菌是检测过程中的关键步骤之一, 因为 PDL 涂层板中细胞的培养使细胞能够粘附在检测板上。粘附白色念珠菌细胞的可视化是?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025