Investigação de bio-energética de Candida albicans usando real-time extracelular fluxo análise

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo gradual para investigar a respiração mitocondrial e função glicolítico em Candida Albicans usando um analisador de fluxo extra.

Resumo

As mitocôndrias são organelas essenciais para o metabolismo celular e a sobrevivência. Uma variedade de eventos chaves ocorrem nas mitocôndrias, tais como a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose. Por conseguinte, disfunção mitocondrial é relatada para desempenhar um papel importante na tolerância de droga antifúngica e virulência de fungos patogênicos. Dados recentes também levaram ao reconhecimento da importância das mitocôndrias como um contribuinte importante para a patogênese fúngica. Apesar da importância das mitocôndrias em biologia de fungosa, métodos padronizados para entender sua função estão pouco desenvolvidos. Aqui, apresentamos um procedimento para estudar a taxa de consumo de oxigênio basal (OCR), uma medida da respiração mitocondrial e taxas de acidificação do extracelular (ECAR), uma medida da função glicolítico em cepas de c. albicans . O método aqui descrito pode ser aplicado a qualquer Candidaspp. tensões sem a necessidade de purificar a mitocôndria das células fúngicas intactas. Além disso, esse protocolo também pode ser personalizado para triagem de inibidores da função mitocondrial em cepas de c. albicans .

Introdução

Infecções fúngicas invasivas matam mais 1,5 milhões de pessoas por ano em todo o mundo. Este número está a aumentar devido ao aumento do número de pessoas que vivem com imunidade comprometida, incluindo os idosos, prematuros bebês, transplantados e pacientes de câncer¹. C. albicans é um patógeno oportunista de fungo humano que faz parte da microflora humana. Habita também superfícies mucosas e do trato gastrointestinal como um organismo comensal. C. albicans produz doença sistêmica grave em pessoas que têm deficiências imunitárias, que se submeteram à cirurgia, ou que tenham sido tratados com longos cursos de antibióticos. A classificação de espécies de Candida entre as causas de topo três ou quatro das doenças infecciosas nosocomiais (NID) em seres humanos,^2,3,4,5,6,7. O número global anual de infecções da corrente sanguínea por Candida é estimado em ~ 400.000 casos, com mortalidade associada de 46-75%¹. A mortalidade anual por causa da candidíase é aproximadamente 10.000 nos Estados Unidos sozinho. A extensão do NID causada por fungos também se reflete em gastos astronômicos de paciente⁵. Nos Estados Unidos, a despesa anual para o tratamento de infecções fúngicas invasivas supera US $ 2 bilhões, adicionando um esforço enorme para o sistema de saúde já sobrecarregado. Atualmente, terapias antifúngicas padrão disponíveis são limitadas por causa da resistência a drogas cada vez mais prevalente, toxicidade e interações medicamentosas. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar novos alvos de drogas antifúngicas que resultarão em melhores opções de tratamento para pacientes de alto risco. No entanto, a descoberta de novas drogas atuando em alvos fúngicos é complicada, porque os fungos são eucariontes. Isto grandemente limita o número de alvos de drogas de fungos específicos.

Estudos recentes têm indicado que as mitocôndrias são um contribuinte crítico para a virulência de fungo e tolerância às drogas antifúngicas, desde que as mitocôndrias são importantes para a respiração celular, metabolismo oxidativo, transdução de sinal e apoptose^{8 ,9,10,11}. Metabolismo glicolítico e não-glicolíticas são essenciais para a sobrevivência de c. albicans no hospedeiro mamífero^{12,13,14,15,16}. Além disso, vários mutantes de c. albicans , falta de proteínas mitocondriais, tais como Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc foram mostrados para ser defeituoso em filamentação, um factor de virulência importante de c. albicans^{17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22}. Além disso, esses mutantes também foram mostrados para ser atenuado para virulência em um modelo do rato disseminada candidíase^{17,18,19,20,21 ,22}. Assim, fungosas mitocôndrias representam um alvo atraente para a descoberta da droga. No entanto, o estudo da função mitocondrial em c. albicans é um desafio porque c. albicans é petite negativo²³, que significa que não pode sobreviver sem o genoma mitocondrial.

Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para investigar a função mitocondrial e glicolítico em c. albicans , sem a necessidade de purificar as mitocôndrias. Esse método também pode ser otimizado para investigar o efeito da manipulação genética ou moduladores químicos sobre vias mitocondriais e glicolíticas em c. albicans.

Protocolo

Nota: O protocolo detalhado passo a passo do ensaio é descrito abaixo, e o protocolo esquemático é mostrado na Figura 1.

1. cepas de c. albicans e condições de crescimento

1. Crescem as cepas de c. albicans em meio de levedura extrato-peptona-Dextrose (YPD) líquido a 30 °C em um shaker incubadora durante a noite.
   Nota: Manter cepas de Candida como estoques congelados e crescem em ágar YPD (extrato de levedura 1%, 2% de peptona, glicose 2% e 2% de ágar).

2. preparação dos reagentes

1. Prepare o doseamento da seguinte forma:
   1. Para o ensaio da função mitocondrial, dissolver o pó de 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g e 2G glicose (2%) em 90 mL de água estéril e morna a mídia a 37 ° C. Ajustar o pH para 7,4 usando 5 M de NaOH e perfazer o volume a 100 mL com água estéril.
   2. Para o ensaio do stress glicolítico, dissolver 1,04 g RPMI 1640 pó sozinho em 90 mL de água estéril, aquecer a mídia a 37 ° C e ajustar o pH para 7,4. Perfazer o volume a 100 mL com água estéril. RPMI 1640 pó tem sem bicarbonato de sódio, que é fundamental para acompanhar a mudança de pH como uma medida da glicólise durante o ensaio.
2. Compostos de injeção.
   1. Preparar o estoque de glicose 1m em água estéril e loja a-20 ° C.
   2. Preparar 100 mM oligomicina estoque em dimetilsulfóxido (DMSO), alíquota em pequenos volumes e armazenar a-20 ° C.
   3. Preparar 100 mM antimycin A stock em DMSO, alíquota em pequenos volumes e armazenar a-20 ° C.
   4. Prepare 100 mM estoque SHAM (ácido salicylhydroxamic) em etanol no dia do ensaio.
   5. Prepare 1 M KCN em água estéril no dia do ensaio.

3. revestimento da placa de ensaio com poli-lisina-D (PDL)

Nota: Executar todas as etapas em uma capa laminar abaixo.

1. D poli lisina em água de grau de cultura de tecido para fazer a concentração final de 50 µ g/mL, dissolva. Misturar bem e a alíquota para um tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e armazenar a-20 ° C para o longo prazo.
   Nota: 50 µ l por alvéolo é necessária, e para 24 poços, 1,2 mL é necessária. Portanto, alíquota pelo menos 1,3 mL por tubo de microcentrifugadora.
2. Adicionar 50 µ l por bem e incubar a temperatura ambiente, com a tampa coberta por 1-2 h.
3. Aspirar a solução e lave uma vez com 500 µ l cultura de tecido estéril grau de água.
4. Abra a tampa e permitir que os poços ao ar seco. Use a placa no mesmo dia ou loja a 4 ° C por um período máximo de 2-3 dias.

4. hidratação do cartucho de sensor

Nota: Execute esta etapa um dia antes do experimento.

1. Abra o fluxo extra Kit de ensaio e remover o conteúdo. Coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo ao lado da placa de utilitário (Figura 2).
2. Encha cada um bem da placa utilitário com 1 mL de calibrant e coloque o cartucho de sensor de volta. Assegure-se de que os sensores que contêm fluorophores (para medir o oxigênio e pH) estão submersos no calibrant.
3. Incubar o cartucho do sensor durante a noite em uma incubadora não-CO₂ a 37 ° C.

5. crescimento e propagação de células nas placas de PDL-revestido

1. Inocular a c. albicans no caldo YPD e crescer durante a noite a 30 ° C, em uma coqueteleira a 200 rpm.
   Nota: Com base no design do ensaio e o interesse, c. albicans também pode ser cultivada em YPG ou meio mínimo.
2. No dia do ensaio, dilua um número adequado de células no meio de ensaio para produzir uma concentração final de 100.000 células por 100 µ l.
3. Adicione 100 µ l de células diluídas em cada poço da placa de ensaio, exceto poços A1, B4, C3 e D6, na qual adicionar apenas 100 µ l do meio de ensaio para correcção de fundo (Figura 3).
4. Transferir a placa para uma incubadora não-CO₂ a 37 ° C e incubar por 60 min, que vai deixar as células aderem à superfície da placa.

6. protocolo do ensaio

Nota: O protocolo descrito aqui é para o formato de 24-poço do instrumento. Volumes precisará ser ajustada se outro formato for usado.

1. Ensaio de função mitocondrial
   1. Preparação de compostos
      1. Preparar compostos na concentração de x 10 para o ensaio da função mitocondrial: preparar 20 mM SHAM, 100 µM oligomicina, KCN, de 100 mM e 20 µM Antimycin no meio de ensaio correspondente.
      2. Adicionar 50 µ l de Souza para o porto A, 55 µ l oligomicina na porta B, 62 µ l KCN a porta C e 68 µ l Antimycin A porta D (Figura 4).
2. Ensaio de stress glicolítico
   1. Preparação de compostos
      1. Prepare compostos na concentração de x 10 para o ensaio do stress glicolítico. Preparar 100 mM de glicose, 100 µM oligomicina, 500 mM 2-Deoxy glicose (DG-2) e 20 µM Antimycin no meio de ensaio correspondente.
      2. Adicionar 50 glicose µ l para o porto A, 55 µ l oligomicina na porta B, 62 µ l 2-DG a porta C e 68 µ l Antimycin A porta D.
3. Emprega o analisador de fluxo extra, que mede a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação do extracelular (ECAR) de células vivas em um formato de placa 24. Configure o protocolo de ensaio com antecedência.
4. Abra o analisador de fluxo extra e configure o modelo de ensaio usando a guia Assistente de ensaio e siga as instruções passo a passo para preencher todas as informações que aparece durante a instalação. Gere o layout de grupo como semelhante ao mostrado na Figura 5. Configurar o protocolo, como mostrado na tabela 1. Definir esses layouts bem à frente antes do ensaio e salvar no computador. Na época do ensaio, restaure o protocolo salvo, abrindo o arquivo correspondente na opção Abrir arquivo na guia Assistente de ensaio (Figura 5).
5. Carregar os compostos de 10x nos respectivos portos do cartucho sensor hidratado contendo o calibrant e carregar na bandeja do analisador fluxo extra do portador. Inicie a calibração pressionando o botão Start na tela.
6. Adicione lentamente a 350 µ l do meio de ensaio para a placa de células ao longo do lado dos poços para minimizar a perturbação da célula para o volume final para 450 µ l.
7. Substitua a placa de utilitário que contém o calibrant com a placa de ensaio e continuar.
8. Remova o cartucho do sensor e a placa quando o ensaio for concluído. Salve o arquivo na pasta de destino apropriado.

7. análise de dados

1. Use a área sob a curva - análise de variância (ANOVA-AUC) análise guia no software para calcular a diferença significativa entre os grupos, selecionando os respectivos parâmetros (OCR ou ECAR) conforme mostrado na Figura 6.
2. Selecione os grupos que precisam ser comparados.
3. Adicionar para os grupos de análise para ANOVA e clique Okey.
   Nota: Esta análise de AUC ANOVA irá adicionar uma nova folha para o arquivo no qual o AUC é calculado para cada grupo e comparado entre eles por ANOVA. Isto dará uma tabela dos valores de p para mostrar o significado.

Resultados

O foco do presente protocolo é para determinar as funções bioenergética de c. albicans avaliados pelo analisador de fluxo extra. Um mutante de c. albicans , falta proteína mitocondrial Mam33 também está incluído, juntamente com a sua estirpe de complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 para estudar os efeitos da exclusão de uma proteína mitocondrial em OCR e ECAR. MAM33 codifica para uma proteína putativa matriz mitocondrial de ácidos e sua função na...

Discussão

A bioenergética ensaio de fluxo extra serve como uma excelente ferramenta para ler a função mitocondrial medindo fosforilação oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxigênio dependente em tempo real. Além disso, uma função glicolítico que é medida como uma taxa de acidificação do extracelular (alteração do pH extracelular) também pode ser investigada ao mesmo tempo em análise em tempo real.

Bem sucedido chapeamento de c. albicans em placa de ensaio é um dos passos críticos n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025