Bio-Energetik-Untersuchung von Candida Albicans mittels Real-Time extrazelluläre Flux Analyse

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine schrittweise Protokoll um die mitochondriale Atmung und glykolytische Funktion in Candida Albicans untersuchen mit ein zusätzliches Flussmittel-Analyzer.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind wesentliche Organellen für den Zellstoffwechsel und das Überleben. Eine Vielzahl von wichtigen Veranstaltungen finden statt in den Mitochondrien, z. B. oxidativen Stoffwechsel, Zellatmung, Signaltransduktion und Apoptose. Infolgedessen wird die mitochondriale Dysfunktion berichtet, eine wichtige Rolle in der pilzbefallverhütende Droge Toleranz und Virulenz von pathogenen Pilzen. Die jüngsten Daten führten auch die Anerkennung der Bedeutung der Mitochondrien als ein wichtiger Faktor für Pilz Pathogenese. Trotz der Bedeutung der Mitochondrien in Pilz-Biologie sind standardisierte Methoden, um seine Funktion zu verstehen schlecht entwickelt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Verfahren um die basalen Sauerstoff-Verbrauch (OCR), ein Maß für die mitochondriale Atmung und extrazelluläre Übersäuerung Preise (ECAR), ein Maß für die glykolytischen Funktion in C. Albicans -Stämmen zu studieren. Die hier beschriebene Methode kann auf alle Candidaspp. Stämme ohne Mitochondrien von den intakten Pilzzellen zu reinigen angewendet werden. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch angepasst werden zum Bildschirm für Inhibitoren der mitochondrialen Funktion in C. Albicans -Stämmen.

Einleitung

Invasive Pilzinfektionen töten mehr als 1,5 Millionen Menschen pro Jahr weltweit. Diese Nummer ist auf dem Vormarsch durch eine Erhöhung der Anzahl der Menschen, die mit infizierten Immunität, einschließlich älterer, vorzeitige Säuglinge, Transplantationspatienten und Krebs Patienten¹. C. Albicans ist eine opportunistische menschlichen pilzliche Erreger, die ein Teil der menschlichen Mikroflora ist. Er bewohnt auch Schleimhaut-Oberflächen und den Magen-Darm-Trakt als Kommensalen Organismus. C. Albicans produziert schwere systemische Erkrankung bei Menschen mit Immunschwäche, die Operation unterzogen haben, oder wer mit langen Kurse der Antibiotika behandelt wurden. Der Candida Spezies zählen zu den Top drei bis vier Ursachen nosokomialer Infektionskrankheiten (NID) in Menschen^2,3,4,5,6,7. Die jährliche globale Anzahl von Candida -Infektionen Blutkreislauf wird voraussichtlich ~ 400.000 Fälle mit damit verbundenen Todesfälle von 46-75 %¹. Die jährliche Sterblichkeit wegen Candidiasis ist etwa 10.000 in den Vereinigten Staaten allein. Das Ausmaß der durch Pilze hervorgerufenen NID spiegelt sich auch im astronomischen Patienten Kosten⁵. In den USA übertrifft die jährlichen Kosten für die Behandlung von invasiven Pilzinfektionen $ 2 Milliarden, bereits überlasteten Gesundheitssystem eine große Belastung hinzufügen. Derzeit verfügbare standard antimykotische Therapien begrenzt wegen der Toxizität, immer häufiger Resistenzen und Wechselwirkungen. Daher ist dringend erforderlich, neue Angriffspunkte für antimykotische Medikamente zu identifizieren, die bessere Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit hohem Risiko führt. Die Entdeckung neuer Medikamente auf Pilz Ziele ist jedoch komplizierter, weil Pilze Eukaryoten sind. Dies schränkt erheblich die Zahl der Pilz-spezifische Drogeziele.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass Mitochondrien einen kritischen Beitrag zu den Pilz Virulenz und Toleranz gegenüber Antimykotika da Mitochondrien wichtig für die Zellatmung, oxidativen Stoffwechsel, Signaltransduktion und Apoptose^{8 sind ,9,10,11}. Glykolytische und nicht glykolytischen Stoffwechsel sind essentiell für das Überleben von C. Albicans im Säugetier-Wirt^{12,13,14,15,16}. Darüber hinaus haben mehrere C. Albicans Mutanten fehlt mitochondrialen Proteine, wie z.B. Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. erwiesen, in Filamentierung, einem wichtigen Virulenzfaktor von C. Albicans^17, defekt ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22}. Darüber hinaus diese Mutanten zeigten auch abgeschwächt werden, denn in einem Mausmodell der Virulenz Candidiasis^{17,18,19,20,21 verbreitet ,22}. Pilze Mitochondrien stellen somit, ein attraktives Ziel für die Arzneimittelforschung. Die Untersuchung der Funktion der Mitochondrien in C. Albicans ist jedoch schwierig, da C. Albicans ist petite negative²³, was bedeutet, dass es ohne das mitochondriale Genom nicht überleben kann.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, zu untersuchen, mitochondriale und glykolytische Funktion in C. Albicans ohne die Notwendigkeit, die Mitochondrien zu reinigen. Diese Methode kann auch optimiert werden, um die Auswirkungen der Genmanipulation oder chemische Modulatoren auf mitochondriale und glykolytische Wege in C. Albicansuntersuchen.

Protokoll

Hinweis: Das detaillierte schrittweise Protokoll des Assays ist weiter unten beschrieben und die schematische Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.

1. C. Albicans -Stämme und Wachstumsbedingungen

1. Wachsen Sie C. Albicans -Stämme in flüssige Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Medium bei 30 °C in einem Inkubator-Shaker über Nacht.
   Hinweis: Candida -Stämme als gefrorene Bestände zu erhalten und wachsen auf YPD-Agar (Hefeextrakt 1 %, 2 % Pepton, 2 % Traubenzucker und 2 % Agar).

2. Vorbereitung der Reagenzien

1. Der Assay-Medium wie folgt vorbereiten:
   1. Lösen Sie für die Funktion der Mitochondrien-Assay auf, 1,04 g Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Pulver und 2 g Glukose (2 %) in 90 mL sterilem Wasser und Warm die Medien auf 37 ° C. Passen Sie den pH auf 7,4 mit 5 M NaOH und stellen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit sterilem Wasser.
   2. Glykolytischen Stress Test 1,04 g RPMI 1640 Pulver allein in 90 mL sterilem Wasser auflösen, die Medien auf 37 ° C warm und den pH-Wert 7,4 passen. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit sterilem Wasser. RPMI 1640 Pulver hat keine Bikarbonat, die entscheidend für die pH-Änderung als Maß für die Glykolyse während des Tests zu überwachen ist.
2. Injektion-Verbindungen.
   1. Bereiten Sie 1 M Glukose Lager in sterilem Wasser und Speicher bei-20 ° C.
   2. Bereiten Sie 100 mM Oligomycin Lager in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), aliquoten in Kleinmengen und Lagerung bei-20 ° C.
   3. 100 mM Antimycin A Lager in DMSO, aliquoten in kleinen Mengen zubereiten und Lagerung bei-20 ° C.
   4. Bereiten Sie 100 mM SHAM (Salicylhydroxamic Säure) Lager in Ethanol, am Tag des Tests.
   5. 1 M KCN in sterilem Wasser am Tag des Tests vorbereiten.

3. Beschichtung der Assay-Platte mit Poly-D-Lysin (PDL)

Hinweis: Führen Sie alle der folgenden Schritte in eine laminare Kapuze.

1. Lösen Sie Poly-D-Lysin in Gewebekultur Grade Wasser zu 50 µg/mL Endkonzentration auf. Mischen Sie es gut und aliquoten in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und langfristig bei-20 ° C lagern.
   Hinweis: 50 µL pro Bohrloch wird benötigt, und für 24 Vertiefungen, 1,2 mL erforderlich. Daher Aliquot mindestens 1,3 mL pro Microcentrifuge Schlauch.
2. Fügen Sie 50 µL pro Bohrloch und mit dem Deckel abgedeckt für 1-2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Aspirieren Sie die Lösung und spülen Sie einmal mit 500 µL steriler Gewebekultur Grade Wasser.
4. Öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Brunnen an der Luft trocknen. Verwenden Sie die Platte am gleichen Tag oder Shop bei 4 ° C für maximal 2-3 Tage.

4. die Hydratation der Sensorkassette

Hinweis: Führen Sie diesen Schritt eines Tages vor dem Experiment.

1. Öffnen Sie das extra Flussmittel Assay Kit und entfernen Sie den Inhalt. Setzen Sie die Sensor-Patrone Kopf neben der Dienstprogramm-Platte (Abbildung 2).
2. Füllen Sie jeweils gut der Dienstprogramm-Platte mit 1 mL der Kalibrator und legen Sie die Sensor-Steckmodul zurück. Stellen Sie sicher, dass die Sensoren die Fluorophore (um den Sauerstoff und pH-Wert messen) enthalten in der Kalibrator untergetaucht sind.
3. Inkubieren Sie der Sensorkassette über Nacht in einem nicht-CO₂ -Inkubator bei 37 ° c

5. Anbau und Aussaat Zellen in die PDL-beschichtete Platten

1. C. Albicans in der YPD Brühe zu impfen und wachsen über Nacht bei 30 ° C in einem Shaker bei 200 u/min.
   Hinweis: Basierend auf das Test-Design und das Interesse, kann C. Albicans auch in YPG oder minimaler Medium gezüchtet werden.
2. Am Tag des Tests verdünnen Sie eine entsprechende Anzahl von Zellen im Assay Medium um eine Endkonzentration von 100.000 Zellen pro 100 µL zu erzielen.
3. Fügen Sie 100 µL der verdünnten Zellen in jede Vertiefung der Assay-Platte mit Ausnahme von Brunnen A1, B4, C3 und D6, in dem nur 100 µL des Mediums Assay für Hintergrundkorrektur (Abbildung 3) hinzufügen.
4. Übertragen Sie die Platte in ein nicht-CO₂ -Inkubator bei 37 ° C und inkubieren Sie für 60 min, die die Zellen an der Plattenoberfläche halten lassen.

6. Test-Protokoll

Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll ist für das 24-Well-Format des Instruments. Volumina müssen angepasst werden, wenn ein anderes Format verwendet wird.

1. Mitochondriale Funktion assay
   1. Herstellung von Verbindungen
      1. Verbindungen bei 10 X-Konzentration für die Funktion der Mitochondrien-Test vorbereiten: bereiten Sie 20 mM SHAM, 100 µM Oligomycin, 100 mM KCN, und 20 µM Antimycin A in der entsprechenden Assay-Medium.
      2. Fügen Sie 50 µL SHAM in Port A, 55 µL Oligomycin in Port B 62 µL KCN in Port C und 68 µL Antimycin A in Port D (Abbildung 4).
2. Glykolytischen Stress-Test
   1. Herstellung von Verbindungen
      1. Verbindungen bei 10 X-Konzentration für glykolytischen Stress Test vorzubereiten. Bereiten Sie 100 mM Glukose, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-Deoxy Glucose (2DG) und 20 µM Antimycin A in der entsprechenden Assay-Medium.
      2. Fügen Sie 50 µL Glukose in Port A, 55 µL Oligomycin in Port B 62 µL 2-DG in Port C und 68 µL Antimycin A in Port D.
3. Beschäftigen Sie zusätzliches Flussmittel Analyzer, der Sauerstoff-Verbrauch (OCR) und extrazelluläre Übersäuerung Rate (ECAR) von lebenden Zellen in einem 24-Well-Platte-Format misst. Richten Sie das Test-Protokoll im Voraus.
4. Den zusätzliche Flussmittel Analyzer öffnen und der Assay-Vorlage mithilfe der Registerkarte Assay-Assistent eingerichtet und folgen Sie Schritt für Schritt Anleitung zum ausfüllen, alle Informationen, die während des Setups herausspringt. Generieren der Gruppenlayout als ähnlich wie in Abbildung 5dargestellt. Richten Sie das Protokoll wie in Tabelle 1dargestellt. Diese Layouts gut im Voraus vor Assay einzurichten und auf dem Computer speichern. Zum Zeitpunkt des Tests wiederherstellen Sie das gespeicherte Protokoll durch Öffnen der entsprechenden Datei in der Datei öffnen Option in der Registerkarte Assay-Assistent (Abbildung 5).
5. 10 X Verbindungen in den jeweiligen Häfen mit den Kalibrator hydratisiert Sensorkassette laden und laden in das Fach der Träger des zusätzliches Flussmittel Analyzer. Starten Sie die Kalibrierung durch Drücken der Start Taste auf dem Bildschirm.
6. Hinzu kommt 350 µL des Mediums Assay sanft Zellplatte entlang der Seite der Brunnen zu Zelle Störungen um 450 µL Endvolumen bringen zu minimieren.
7. Ersetzen der Dienstprogramm-Platte mit den Kalibrator mit der Assay-Platte und weiter.
8. Der Sensorkassette und der Platte zu entfernen, sobald der Test abgeschlossen ist. Speichern Sie die Datei im entsprechenden Zielordner.

7. die Datenanalyse

1. Verwenden Sie die Fläche unter der Kurve - Varianzanalyse (AUC-ANOVA) Registerkarte Analyse in der Software zur Berechnung des wesentlichen Unterschied zwischen den Gruppen durch Auswahl der entsprechenden Parameter (OCR oder ECAR) wie in Abbildung 6dargestellt.
2. Wählen Sie die Gruppen, die verglichen werden müssen.
3. Die Analysegruppen für die ANOVA hinzu, und klicken Sie auf Ok.
   Hinweis: Diese AUC ANOVA-Analyse wird ein neues Blatt der Datei hinzufügen, die AUC berechnet für jede Gruppe und untereinander durch ANOVA verglichen. Dies wird eine Tabelle der p-Werte zeigen die Bedeutung geben.

Ergebnisse

Im Mittelpunkt dieses Protokolls ist zu bestimmen, der bioenergetischen Funktionen von C. Albicans durch zusätzliches Flussmittel Analyzer bewertet. Eine mitochondriale Protein Mam33 fehlt C. Albicans -Mutante ist auch zusammen mit seiner Ergänzung Belastung, mam33Δ/Δ::MAM33 Studie zu den Auswirkungen der Löschung eines mitochondrialen Proteins auf OCR und ECAR enthalten. MAM33 kodiert für eine vermeintliche mitochondriale sauren Matrix-Protein un...

Diskussion

Die Bioenergetik zusätzliches Flussmittel Assay dient als ein hervorragendes Tool zum Auslesen der mitochondrialen Funktion durch Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) messen-abhängige Sauerstoffverbrauch in Echtzeit. Darüber hinaus kann eine glykolytische Funktion, die als eine extrazelluläre Übersäuerung Rate (Veränderung des extrazellulären pH) gemessen wird auch gleichzeitig in Echtzeit-Analyse untersucht werden.

Erfolgreiche Beschichtung von C. Albicans in der Assay-Platte ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025