칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사

요약

여기, 선물이 미토 콘 드리 아 호흡 및 Candida Albicans 에 glycolytic 기능 조사 stepwise 프로토콜 추가 유출 분석기를 사용 하 여.

초록

미토 콘 드리 아 세포 물질 대사 및 생존을 위한 필수적인 세포입니다. 미토 콘 드리 아, 세포 호흡, 산화 물질 대사, 신호 변환, apoptosis 등 다양 한 주요 행사 개최. 따라서, 미토 콘 드 리아 기능 장애는 항진균 약물 내성 및 병원 성 곰 팡이의 독성에 중요 한 역할을 보고 됩니다. 최근 데이터는 또한 곰 팡이 병의 중요 한 기여자는 미토 콘 드리 아의 중요성의 인식을 이끌어 냈다. 곰 팡이 생물학에서 미토 콘 드리 아의 중요성에도 불구 하 고 표준화 된 방법의 기능을 이해 하는 가난 하 게 개발 되었다. 여기, 기저 산소 소비 속도 (OCR), 미토 콘 드리 아 호흡의 측정 및 extracellular 산성화 요금 (ECAR), C. albicans 긴장 glycolytic 기능 측정 연구 절차 선물이. 여기 설명 하는 방법은 그대로 곰 팡이 세포에서 미토 콘 드리 아를 정화 하는 필요 없이 긴장 Candidaspp. 어떤에 적용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 또한 사용자 정의할 수 있습니다 C. albicans 긴장에 미토 콘 드리 아 기능 억제제에 대 한 화면으로.

서문

침입 균 감염 전세계 1 년 이상의 1.5 백만 명 죽 일. 이 번호는 손상 된 면역, 암 환자¹, 이식 받는 사람, 노인, 조기 유아를 포함 하 여 생활 하는 사람들의 숫자에 증가 때문에. C. albicans 는 기회주의적 인간의 곰 팡이 병원 체 인간 microflora의 일부입니다. 그것은 또한 공생 생물으로 점 막 표면 및 위장에 서식. C. albicans 심각한 조직 질병 면역 결핍증, 누가 수술을 받은 또는 누가 항생제의 긴 과정을 함께 취급 하 고 있는 사람들을 생성 합니다. 병원내 감염 증 (NID) 인간^2,3,4,5,,67의 상위 3 ~ 4 원인 중 칸디 다 종 차수입니다. 칸디 다 혈 류 량 감염의 연례 글로벌 수 ~ 400000 경우, 46-75¹의 연결된 mortalities로 추정 된다. 칸디 다 증 때문에 연간 사망률 약 미국 에서만 10, 000입니다. 곰 팡이로 인 한 NID의 범위는 천문 환자 비용⁵에 반영 됩니다. 미국에서는, 침입 균 감염의 치료에 대 한 연간 비용 $2 십억, 이미 overburdened 의료 시스템을 거 대 한 긴장을 추가 능가 한다. 현재, 사용할 수 있는 표준 항진균 치료 독성, 점점 널리 약물 저항, 및 약물-약물 상호 작용으로 인해 제한 됩니다. 따라서, 고 위험 환자에 대 한 더 나은 치료 옵션 귀 착될 것 이다 새로운 항진균 약물 목표를 식별 하는 긴급 한 필요가 있다. 그러나, 곰 팡이 목표에 행동 하는 새로운 약물의 발견은 곰 팡이 진핵생물 복잡 합니다. 이 크게 특정 곰 팡이 약물 목표의 수를 제한합니다.

최근 연구는 미토 콘 드리 아는 곰 팡이 독성에 중요 한 기여자 및 항진균 약물에 내성 때문에 미토 콘 드리 아는 세포 호흡, 산화 물질 대사, 신호 변환 및 apoptosis^{8에 대 한 중요 한 표시 ,9,,1011}. Glycolytic 및 비 glycolytic 대사는 포유류 호스트^{12,,1314,,1516} C. albicans 의 생존을 위해 필수적입니다. 또한, Goa1, 같은 미토 콘 드리 아 단백질 부족 여러 C. albicans 돌연변이 Srr1, Gem1, Sam37 등 표시 되었습니다 filamentation, C. albicans^17, 의 중요 한 독성 요소에에서 결함이 있는 것을 ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22}. 또한, 이러한 돌연변이 또한 독성의 마우스 모델에서 칸디 다^{17,,1819,20,21 전파에 대 한 감쇠를 표시 했다 ,22}. 따라서, 곰 팡이 미토 콘 드리 아 약물 발견에 대 한 매력적인 대상을 나타냅니다. 그러나, C. albicans 에 미토 콘 드리 아 기능 연구는 C. albicans 는 몸집이 작은 부정적인²³, 미토 콘 드리 아 게놈 없이 살아남을 수 없다 의미 때문에 도전적 이다.

여기, 우리는 미토 콘 드리 아를 정화 하는 필요 없이 C. albicans 에 glycolytic 미토 콘 드리 아 기능을 조사 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 또한 C. albicans에 미토 콘 드리 아와 glycolytic 경로에 유전자 조작 이나 화학 변조기의 효과 조사 하기 위해 최적화할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 분석 결과의 상세한 stepwise 프로토콜은 아래, 설명 하 고 도식 프로토콜 그림 1에 표시 됩니다.

1. C. albicans 긴장 및 성장 조건

1. C. albicans 긴장 성장 30 °C에서 인큐베이터 쉐이 커에 액체 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 매체에서 하룻밤.
   참고: 냉동된 주식으로 칸디 다 긴장을 유지 하 고 YPD agar (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, 및 2 %agar)에 성장.

2입니다. 시 약의 준비

1. 다음과 같이 분석 결과 매체를 준비:
   1. 미토 콘 드리 아 기능 분석 결과 대 한 해산 1.04 g 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 분말과 포도 당 2 세대 (2%) 90 살 균 물과 따뜻한 37 ° c 미디어 7.4 5 M NaOH를 사용 하 여에 pH를 조정 하 고 메 마른 물 100 mL에는 볼륨을 구성 하.
   2. Glycolytic 스트레스 분석 결과 대 한 1.04 g RPMI 1640 분말 90 살 균 물 혼자를 분해 하 고 따뜻한 미디어 37 ° C를 pH 7.4에 조정. 멸 균 물 100 mL에 볼륨을 확인 합니다. RPMI 1640 파우더는 중요 한 분석 결과 중 분해의 pH 변화를 모니터링 하는 아무 중 탄산염.
2. 사출 화합물입니다.
   1. 1 M 포도 당 주식 살 균 물에-20 ° c.에가 게를 준비
   2. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 작은 볼륨에서 aliquot에 oligomycin 주식 100 mM를 준비 하 고-20 ° c.에 저장
   3. DMSO, 작은 볼륨에서 aliquot에 100 m m antimycin A 재고를 준비 하 고-20 ° c.에 저장
   4. 에탄올에 가짜 (salicylhydroxamic 산) 주식 분석 결과 하루에 100 mM를 준비 합니다.
   5. 분석 결과의 날에 1 M 메 마른 물에 KCN을 준비 합니다.

3. 분석 결과 플레이트와 폴 리-D-라이 신 (PDL)의 코팅

참고: 모든 수행은 층 류 후드에서 단계 아래.

1. 50 µ g/mL 최종 농도 만들기 위해 조직 문화 학년 물에 폴 리 D Lysine을 디졸브. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 잘 그리고 aliquot 그것을 혼합 하 고 오랜 기간 동안-20 ° C에서 저장.
   참고: 잘 당 50 µ L이 필요, 그리고 24 웰 스, 1.2 mL이 필요. 따라서, microcentrifuge 튜브 당 약 1.3 이상 수 mL.
2. 잘 당 50 µ L을 추가 하 고 뚜껑을 1-2 h 동안 실 온에서 품 어.
3. 솔루션을 발음 하 고 500 µ L 무 균 조직 문화 학년 물으로 한 번 씻어.
4. 뚜껑 열고 건조 공기를 우물을 허용 합니다. 같은 날에 4 ° C에 게 접시를 사용 하 여 최대 2-3 일에 대 한.

4입니다. 수 분이 센서 카트리지

참고: 하루는 실험 전에이 단계를 수행 합니다.

1. 분석 결과 키트 추가 유출 열고 내용을 제거 합니다. 거꾸로 유틸리티 플레이트 (그림 2) 옆 센서 카트리지를 놓습니다.
2. 각 유틸리티 접시의 calibrant의 1 mL와 함께 고 센서 카트리지를 다시 배치 작성. (측정 하기 위해 산소와 pH) fluorophores 포함 하는 센서는 calibrant에 잠긴 다는 것을 확인 하십시오.
3. 37 ° c.에 비 CO₂ 배양 기에서 하룻밤 센서 카트리지를 품 어

5. 성장 및 PDL 코팅 판에 셀 시드

1. C. albicans YPD 국물에 접종 하 고 하룻밤 200 rpm에서 통에 30 ° C에서 성장.
   참고: 분석 결과 설계 및 관심에 따라, C. albicans 수 YPG 또는 최소 매체 또한 성장 수 있다.
2. 분석 결과의 날, 적절 한 수를 100 µ L 당 100, 000 셀의 최종 농도 분석 결과 중간에 셀의 희석.
3. 웰 스 A1, B4, c 3와 D6, 있는 배경 보정 (그림 3)에 대 한 분석 결과 매체의 100 µ L를 추가 제외 하 고 분석 결과 플레이트의 각 음에 희석 셀 100 µ L를 추가 합니다.
4. 37 ° C에서 비 CO₂ 인큐베이터에 접시를 전송 하 고 플레이트 표면에 고착 하는 세포에 게 할 것 이다 60 분 동안 품 어.

6. 분석 결과 프로토콜

참고: 여기에 설명 된 프로토콜은 악기의 24-잘 형식입니다. 볼륨은 다른 형식이 사용 되 면 조정 해야 합니다.

1. 미토 콘 드리 아 기능 분석 결과
   1. 화합물의 준비
      1. 미토 콘 드 리아 기능 분석 결과 대 한 10 배 농도에서 화합물을 준비: 20mm 가짜, 100 µ M 준비 Oligomycin, 100 mM KCN, 그리고 해당 분석 결과 매체에서 20 µ M Antimycin A.
      2. 추가 50 µ L 포트 A, 55 µ L로 가짜 Oligomycin 포트 B, 62 µ L KCN 포트 C와 D의 포트 68 µ L Antimycin A (그림 4).
2. Glycolytic 스트레스 분석 결과
   1. 화합물의 준비
      1. Glycolytic 스트레스 분석 결과 대 한 10 배 농도에서 화합물을 준비 합니다. 포도 당, 100 µ M 100 mM를 준비 Oligomycin, 500 m m 2에 의하여 포도 당 (2 DG) 및 해당 분석 결과 매체에서 20 µ M Antimycin A.
      2. 포트 A, 55 µ L로 50 µ L 포도 추가 C와 포트 D. 68 µ L Antimycin A 포트에 포트 B, 62 µ L 2-DG Oligomycin
3. 여분의 플럭스 분석기, 산소 소비 속도 (OCR)와 24-잘 플레이트 형식에 살아있는 세포의 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 측정을 사용 합니다. 사전에 시험 프로토콜을 설정 합니다.
4. 여분의 플럭스 분석기 및 분석 결과 마법사 탭을 사용 하 여 분석 결과 서식 파일 설정 열고 모든 정보를 설치 하는 동안 밖으로 아빠 작성 단계 지시에 따라. 그림 5에 표시 된 유사한 그룹 레이아웃을 생성 합니다. 표 1에 표시 된 대로 프로토콜을 설정 합니다. 분석 결과 전에 잘 앞서 이러한 레이아웃을 설정 하 고 컴퓨터에 저장. 당시 분석 결과, 분석 결과 마법사 탭 (그림 5)에서 파일 열기 옵션에서 해당 파일을 열어서 저장된 프로토콜을 복원 합니다.
5. 10 x 화합물 수산화 센서 카트리지를 포함 하는 calibrant의 해당 포트에 로드 하 고 여분의 플럭스 분석기의 캐리어 트레이 로드 하십시오. 화면에서 시작 버튼을 눌러 보정을 시작 합니다.
6. 450 µ L를 최종 볼륨을가지고 셀 소요를 최소화 하기 위해 웰 스의 측면을 따라 셀 플레이트를 부드럽게 분석 결과 매체의 350 µ L를 추가 합니다.
7. 분석 결과 플레이트 calibrant를 포함 하는 유틸리티 플레이트를 장착 하 고 계속.
8. 분석 결과 완료 되 면 센서 카트리지 및 플레이트를 제거 합니다. 적절 한 대상 폴더에 파일을 저장 합니다.

7. 데이터 분석

1. 탭의 곡선-분산 분석 (ANOVA AUC) 분석 소프트웨어에서 영역을 사용 하 여 그림 6에서 같이 각 매개 변수 (OCR 또는 ECAR)를 선택 하 여 그룹 간의 중요 한 차이 계산.
2. 비교할 필요가 있는 그룹을 선택 합니다.
3. ANOVA에 대 한 분석 그룹에 추가 하 고 확인을 클릭 합니다.
   참고:이 AUC ANOVA 분석 AUC는 각 그룹에 대 한 계산 고 있는 ANOVA에 의해 그들 사이 비교 파일에 새 시트를 추가 합니다. 이 중요성을 보여 p 값의 표를 줄 것 이다.

결과

이 프로토콜의 추가 유출 분석기에 의해 평가 되는 C. albicans 의 bioenergetic 기능을 결정 하는. C. albicans 돌연변이 미토 콘 드리 아 단백질 Mam33 부족의 보완 스트레인, OCR 및 ECAR 미토 콘 드리 아 단백질의 삭제의 효과 공부 mam33Δ/Δ::MAM33 함께 포함 되어 있습니다. MAM33 상 상속 미토 콘 드 리아 산 성 매트릭스 단백질 인코딩하고 칸디 다 에 그것...

토론

생체 외 유출 분석 결과 산화 인 산화 (OXPHOS)를 측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 읽을 수 있는 훌륭한 도구 역할-실시간으로 종속 산소 소비. 또한, extracellular 산성화 속도 (extracellular pH 변화)로 측정 한 glycolytic 기능 또한 실시간 분석에 동시에 조사 수 있습니다.

PDL 코팅 접시에 셀의 인큐베이션 허용 시험 접시에 셀 시험 접시에 C. albicans 의 성공적인 도금 분석 결과에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025