Enquête bio-énergétique en temps réel à l’aide de Candida albicans analyse extracellulaire de Flux

Résumé

Nous présentons ici un protocole par étapes pour étudier la respiration mitochondriale et la fonction glycolytique chez Candida Albicans à l’aide d’un analyseur de flux supplémentaires.

Résumé

Les mitochondries sont des organites essentiels pour le métabolisme cellulaire et la survie. Une variété d’événements importants se déroulent dans les mitochondries, telles que la respiration cellulaire, métabolisme oxydatif, transduction du signal et l’apoptose. Par conséquent, dysfonctionnement mitochondrial est signalé à jouer un rôle important dans la tolérance des médicaments antifongiques et la virulence des champignons pathogènes. Des données récentes ont également conduit à la reconnaissance de l’importance des mitochondries comme un important contributeur à la pathogénèse fongique. Malgré l’importance des mitochondries en biologie fongique, des méthodes normalisées pour comprendre sa fonction sont peu développés. Nous présentons ici une procédure afin d’étudier le taux de consommation d’oxygène basale (OCR), une mesure de la respiration mitochondriale et taux d’acidification extracellulaire (ECAR), une mesure de la fonction glycolytique chez les souches de c. albicans . La méthode décrite ci-après peut être appliquée à n’importe quel Candidaspp. souches sans la nécessité de purifier les mitochondries des cellules fongiques intacts. En outre, ce protocole peut également être personnalisé pour dépister les inhibiteurs de la fonction mitochondriale chez les souches de c. albicans .

Introduction

Infections fongiques invasives tuent plus 1,5 millions de personnes par an dans le monde entier. Ce chiffre est en hausse en raison d’une augmentation du nombre de personnes vivant avec l’immunité compromise, y compris les nourrissons prématurés âgés, receveurs et cancer patients¹. C. albicans est un pathogène opportuniste qui fait partie de la microflore humaine. Il habite également les surfaces muqueuses et le système gastro-intestinal comme un organisme commensal. C. albicans produit une maladie systémique grave chez les personnes ayant des déficiences immunitaires, qui ont subi une chirurgie, ou qui ont été traités avec longs cours des antibiotiques. Le rang d’espèce Candida parmi les causes de trois à quatre premiers nosocomiales maladies infectieuses (NID) sur les êtres humains^2,3,4,5,6,7. Le nombre global annuel des septicémies à Candida est estimé à ~ 400 000 cas, avec des taux de mortalité associé de 46 à 75 %¹. La mortalité annuelle à cause de la candidose est d’environ 10 000 dans les seuls États-Unis. L’ampleur du NID causée par des champignons se reflète également dans astronomique dépenses patient⁵. Aux États-Unis, les dépenses annuelles pour le traitement des infections fongiques invasives dépasse $ 2 milliards, ajoutant une énorme souche au système de santé déjà surchargé. Actuellement, les traitements antifongiques standards disponibles sont limitées en raison de la toxicité, la résistance aux médicaments de plus en plus répandue et interactions médicament-médicament. Par conséquent, il y a un besoin urgent d’identifier de nouvelles cibles de médicaments antifongiques qui seront traduira par meilleures options de traitement pour les patients à haut risque. Toutefois, la découverte de nouveaux médicaments agissant sur les cibles fongiques est compliquée car les champignons sont des eucaryotes. Ce qui limite considérablement le nombre de cibles thérapeutiques spécifiques fongiques.

Des études récentes ont montré que les mitochondries sont un facteur critique de la virulence fongique et la tolérance aux médicaments antifongiques puisque les mitochondries sont importants pour la respiration cellulaire, métabolisme oxydatif, transduction du signal et l’apoptose^{8 ,9,10,11}. Le métabolisme glycolytique et non-glycolytiques sont essentiels pour la survie de c. albicans dans le mammifère hôte^{12,13,14,15,16}. En outre, plusieurs mutants de c. albicans , manque de protéines mitochondriales, tels que Goa1, Srr1, Gem1, etc. Sam37 montrent défectueux dans la filamentation, un facteur de virulence important de c. albicans^{17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22}. en outre, ces mutants ont été également montrés pour être atténuée pour virulence dans un modèle murin de diffusé la candidose^{17,18,19,20,21 ,},²². Ainsi, des mitochondries fongiques représentent une cible attractive pour la découverte de médicaments. Cependant, l’étude de la fonction mitochondriale chez c. albicans est difficile parce que c. albicans est petite négative²³, ce qui signifie qu’il ne peut survivre sans le génome mitochondrial.

Nous décrivons ici un protocole qui peut être utilisé pour étudier la fonction mitochondriale et glycolytique chez c. albicans sans la nécessité de purifier des mitochondries. Cette méthode peut également être optimisée pour étudier l’effet de la manipulation génétique ou les modulateurs chimiques sur des voies mitochondriales et glycolytiques chez c. albicans.

Protocole

Remarque : Le protocole détaillé par étape du dosage est décrit ci-dessous, et le protocole schématique est illustré à la Figure 1.

1. les souches de c. albicans et de conditions de croissance

1. Cultiver les souches de c. albicans dans un milieu liquide levure extrait-Peptone-Dextrose (DPJ) à 30 °C dans un agitateur incubateur du jour au lendemain.
   Remarque : Maintenir des souches de Candida comme stocks congelés et croître sur gélose YPD (1 % d’extrait de levure, peptone de 2 %, 2 % de dextrose et 2 % d’agar).

2. préparation des réactifs

1. Préparer le milieu comme suit :
   1. Pour l’analyse de la fonction mitochondriale, dissoudre la poudre de 1640 de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g et 2 g de glucose (2 %) dans 90 mL d’eau stérile et l’accueil chaleureux des médias à 37 ° C. Ajuster le pH à 7.4 à l’aide de 5 M NaOH et compléter le volume à 100 mL avec de l’eau stérile.
   2. Pour l’analyse de stress glycolytique, dissoudre 1,04 g poudre RPMI 1640 seul dans 90 mL d’eau stérile, réchauffer les médias à 37 ° C et ajuster le pH à 7,4. Compléter le volume à 100 mL avec de l’eau stérile. La poudre de RPMI 1640 a sans bicarbonate, qui est indispensable pour surveiller le changement de pH en guise de glycolyse pendant le test.
2. Composés de l’injection.
   1. Préparer le stock de glucose 1 M dans l’eau stérile et conserver à-20 ° C.
   2. Préparer 100 mM oligomycine stock dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), aliquot dans de petits volumes et conserver à-20 ° C.
   3. Préparation 100 mM l’antimycine A stock dans le DMSO, aliquote dans de petits volumes et conserver à-20 ° C.
   4. Préparer 100 mM stock (acide salicylhydroxamique) SHAM dans de l’éthanol sur le jour du test.
   5. Préparer 1 M KCN dans l’eau stérile, le jour du test.

3. revêtement de la plaque de test avec le Poly-D-Lysine (PDL)

Remarque : Effectuez toutes les étapes dans une hotte laminaire ci-dessous.

1. Dissoudre la Lysine de Poly-D dans l’eau de la culture de tissus qualité afin de rendre la concentration finale de 50 µg/mL. Mélangez-le bien et aliquotes dans des tubes de microcentrifuge 1,5 mL et conserver à-20 ° C pour le long terme.
   Remarque : 50 µL / puits est nécessaire, et pour 24 puits, 1,2 mL est nécessaire. Par conséquent, partie aliquote au moins 1,3 mL par tube microcentrifuge.
2. Ajouter 50 µL / puits et incuber à température ambiante avec le couvercle couvert pendant 1-2 h.
3. Aspirer la solution et rincer une fois avec l’eau la qualité des vitroplants stérile des 500 µL.
4. Ouvrez le couvercle et laissez les puits à l’air sec. Utilisez la plaque sur le jour même ou le conserver à 4 ° C pendant un maximum de 2 ou 3 jours.

4. l’hydratation de la cartouche de sonde

Remarque : Exécutez cette étape un jour avant l’expérience.

1. Ouvrir le flux supplémentaire Kit de dosage et de retirer le contenu. Placez la cartouche de capteur à l’envers à côté de la plaque de l’utilitaire (Figure 2).
2. Remplir chaque puits de la plaque de l’utilitaire avec 1 mL de calibrant et placez la cartouche de capteur retour. Veillez à ce que les capteurs qui contiennent des fluorophores (pour mesurer l’oxygène et du pH) sont submergées dans le degré.
3. Incuber la cartouche de sonde du jour au lendemain dans une étuve de non-CO₂ à 37 ° C.

5. de plus en plus et l’ensemencement des cellules dans les plaques de revêtement PDL

1. Ensemencer c. albicans dans le bouillon de la DPJ et croître durant la nuit à 30 ° C dans un agitateur à 200 tr/min.
   NOTE : Basé sur la conception de l’essai et l’intérêt, c. albicans peut également être cultivé dans GPJ ou un milieu minimal.
2. Le jour du test, diluer un nombre adéquat de cellules dans le milieu pour donner une concentration finale de 100 000 cellules / µL 100.
3. Ajouter 100 µL de cellules dilués dans chaque puits de la plaque d’essai sauf puits A1, B4, C3 et D6, dans lequel ajouter seulement 100 µL de milieu dosage pour une correction de fond (Figure 3).
4. Transférer la plaque dans une étuve à non-CO₂ à 37 ° C et laisser incuber pendant 60 min, ce qui laissera les cellules adhèrent à la surface de la plaque.

6. protocole

Remarque : Le protocole décrit ici est pour le format 24-puits de l’instrument. Volumes devront être ajustées si l'on utilise un autre format.

1. Test de la fonction mitochondriale
   1. Préparation de composés
      1. Préparer les composés à concentration de x 10 pour l’analyse de la fonction mitochondriale : 20 mM SHAM, 100 µM de préparer l’Oligomycine, 100 mM KCN et 20 µM l’Antimycine A dans le milieu d’essai correspondant.
      2. Ajouter 50 µL SHAM dans le port A, 55 µL Oligomycine au port B, 62 µL de KCN dans port C et 68 µL l’Antimycine A port D (Figure 4).
2. Test de stress glycolytiques
   1. Préparation de composés
      1. Préparer les composés à concentration de x 10 pour l’analyse de stress glycolytique. Préparer 100 mM glucose, 100 µM l’Oligomycine, 500 mM 2-désoxy Glucose (2DG) et 20 µM l’Antimycine A dans le milieu d’essai correspondant.
      2. Ajouter 50 glucose µL dans le port A, 55 µL Oligomycine au port B, 62 µL 2-DG dans port C et 68 µL l’Antimycine A port D.
3. Employer l’analyseur de flux supplémentaires, qui mesure le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) de cellules vivantes dans un format de plaque 24 puits. Mettre en place le protocole d’essai à l’avance.
4. Ouvrez l’analyseur de flux supplémentaires et mis en place le modèle de test en utilisant l’onglet assistant de dosage et suivre les instructions étape par étape pour remplir toutes les informations qui saute dehors pendant l’installation. Générer la mise en page de groupe comme semblable à illustré à la Figure 5. Mettre en place le protocole tel qu’illustré dans le tableau 1. Mis en place ces mises en page très avancée avant le dosage et l’enregistrer dans l’ordinateur. Au moment du test, restaurer le protocole sauvé en ouvrant le fichier correspondant à l’option ouvrir le fichier dans l’onglet assistant de dosage (Figure 5).
5. Charger les composés 10 x dans les ports respectifs de la cartouche de capteur hydraté contenant le degré et la charger dans le bac de transporteur de l’analyseur de flux supplémentaires. Commencer le calibrage en appuyant sur le bouton Start à l’écran.
6. Ajouter 350 µL du milieu dosage doucement jusqu'à la tôle de la cellule le long du côté des puits pour minimiser la perturbation de la cellule pour porter le volume final à 450 µL.
7. Replacez la plaque de l’utilitaire contenant le degré avec la plaque de test et continuer.
8. Retirez la cartouche de la sonde et la plaque une fois le test terminé. Enregistrez le fichier dans le dossier de destination approprié.

7. analyse de données

1. L’aire sous la courbe - analyse de variance (ANOVA-AUC) analyse tab dans le logiciel permet de calculer la différence significative entre les groupes en sélectionnant les paramètres respectifs (OCR ou ECAR) comme illustré à la Figure 6.
2. Sélectionnez les groupes qui doivent être comparées.
3. Ajouter à des groupes d’analyse pour l’analyse de la variance, puis cliquez sur Ok.
   Remarque : Cette analyse ANOVA AUC ajoutera une nouvelle feuille au fichier dans lequel les AUC est calculé pour chaque groupe et comparé entre eux par l’analyse de la variance. Cela vous donnera une table des valeurs de p pour montrer l’importance.

Résultats

L’objectif de ce protocole consiste à déterminer les fonctions bioénergétiques c. albicans , évaluée par l’analyseur de flux supplémentaires. Un mutant de c. albicans dépourvus de protéines mitochondriales Mam33 est également inclus avec sa souche de complément, mam33Δ/Δ::MAM33 pour étudier les effets de la suppression d’une protéine mitochondriale sur OCR et ECAR. MAM33 code pour une protéine de la matrice acides mitochondriale pu...

Discussion

La bioénergétique test flux supplémentaire est un outil excellent pour donner lecture de la fonction mitochondriale en mesurant la phosphorylation oxydative (OXPHOS)-dépendante d’oxygéne en temps réel. En outre, une fonction glycolytique qui est mesurée sous forme d’un taux d’acidification extracellulaire (modification du pH extracellulaire) peut également être étudiée en même temps dans l’analyse en temps réel.

Électrodéposition réussie de c. albicans dans la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025