ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול stepwise לחקור את הנשימה מיטוכונדריאלי והתפקוד glycolytic ב קנדידה אלביקנס באמצעות עם מנתח נוסף השטף.

Abstract

המיטוכונדריה הם organelles חיוני כדי להפוך את חילוף החומרים הסלולר הישרדות. מגוון רחב של אירועי מפתח יתקיים המיטוכונדריה, כגון נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות אפופטוזיס. כתוצאה מכך, תפקוד מיטוכונדריאלי הוא דיווח יש תפקיד חשוב סבילות נגד פטריות, התקפה אלימה של פטריות פתוגניים. נתונים עדכניים הובילו גם ההכרה על החשיבות של המיטוכונדריה כמו תורם חשוב בפתוגנזה פטרייתי. למרות החשיבות של המיטוכונדריה בביולוגיה פטרייתי, שיטות מתוקננים כדי להבין את הפונקציה שלה הן מפותחות. כאן, אנו מציגים את הליך ללמוד שיעור צריכת החמצן הבזליים (OCR), מידת הנשימה מיטוכונדריאלי, ו המחירים חוץ-תאית acidification (ECAR), מדד של פונקציית glycolytic אלביקנס ג זנים. השיטה המתוארת במסמך זה ניתן ליישם כל זני Candidaspp. ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה מתאי פטרייתי ללא פגע. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם אישית עבור מעכבי של פונקציית מיטוכונדריאלי זנים אלביקנס ג מסך.

Introduction

זיהומים פטרייתיים פולשנית להרוג מעל 1.5 מיליון אנשים בשנה ברחבי העולם. המספר הזה הוא בעלייה בשל עלייה במספר האנשים החיים עם חסינות פרוץ, לרבות תינוקות קשישים, מוקדמת, השתלת הנמענים, חולי סרטן¹. ג אלביקנס הוא הזדמנותית פטריות פתוגניות זה חלק microflora האדם. הוא שוכן גם ומשטחים הרירית של מערכת העיכול כאורגניזם commensal. אלביקנס ג מייצרת מחלה מערכתית קשה אצל אנשים שיש להם ליקויים החיסונית, אשר עברו ניתוח, או מי שטופלו עם קורסים ארוכים של אנטיביוטיקה. הדרגה מינים קנדידה בין הגורמים המובילים שלושה או ארבעה nosocomial מחלות זיהומיות (ניד) ב בני אדם^2,3,4,5,6,7. מספר זיהומים קנדידה למחזור הדם העולמי השנתי מוערך ~ 400,000 מקרים, עם בהירושימה המשויך של 46-75%¹. התמותה השנתי עקב קנדידה הוא בערך 10,000 בארצות הברית לבדה. היקף ניד הנגרמת על ידי פטריות משתקפת גם הוצאות אסטרונומיות החולה⁵. בארצות הברית, על הטיפול של זיהומים פטרייתיים פולשנית הוצאות שנתי עולה 2 מיליארד דולר, הוספת זן ענק כבר עומס מערכת הבריאות. כיום, טיפולים נגד פטריות סטנדרטיים זמינים מוגבלות בשל רעילות, תרופתיים נפוץ יותר ויותר, סמים-תרופתיות. לכן, יש צורך דחוף לזיהוי מטרות תרופה נגד פטריות חדש זה יביא באפשרויות טיפול טוב יותר לחולים בסיכון גבוה. עם זאת, הגילוי של תכשירים חדשים על מטרות פטרייתי הוא מסובך כי פטריות פרוקריוטים. זה מאוד מגביל את מספר מטרות ספציפיות פטרייתי סמים.

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המיטוכונדריה הם תורם קריטי לאלימות ולגרימת פטרייתי עמידות לתרופות נגד פטריות מאז המיטוכונדריה חשובים נשימה תאית, מטבוליזם חמצוני, אותות של אפופטוזיס^{8 ,9,10,11}. מטבוליזם glycolytic והן הלא-glycolytic חיוניים להישרדותה של אלביקנס ג המארח בתרבית של^{12,13,14,15,16}. יתר על כן, מספר מוטציות אלביקנס ג חסר חלבונים מיטוכונדריאלי, כגון Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 וכו ' הוכחו להיות פגום בתוך filamentation, גורם חשוב התקפה אלימה של אלביקנס ג^{17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22}. בנוסף, המוטנטים האלה הוצגו גם כדי להיות הקלוש של התקפה אלימה במודל של עכברים של המופץ קנדידה^{17,18,19,20,21 ,22}. לפיכך, המיטוכונדריה פטרייתי מייצגים ליעד אטרקטיבי עבור גילוי תרופות. עם זאת, המחקר של פונקציית מיטוכונדריאלי אלביקנס ג הוא מאתגר כי אלביקנס ג פטיט שלילי²³, מה שאומר כי זה לא יכול לשרוד בלי גנום מיטוכונדריאלי.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את פונקציית מיטוכונדריאלי, glycolytic אלביקנס ג ללא צורך לטהר את המיטוכונדריה. ניתן למטב בשיטה זו גם כדי לחקור את ההשפעה של מניפולציה גנטית או מאפננים כימי על מסלולים מיטוכונדריאלי ו glycolytic ב ג אלביקנס.

Protocol

הערה: פרוטוקול stepwise מפורט וזמינותו היא כמפורט להלן, פרוטוקול סכמטית מוצג באיור1.

1. ג אלביקנס זנים ותנאי גידול

1. גדלים זנים אלביקנס ג נוזלי בינוני תמצית-Peptone-Dextrose שמרים (YPD) ב- 30 °C ב שייקר אינקובטור בן לילה.
   הערה: לשמור על זנים של קנדידה מניות קפוא ולגדול על אגר YPD (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, דקסטרוז 2% ו- 2% אגר).

2. הכנת נוגדנים

1. הכן את המדיום assay כדלקמן:
   1. עבור הפונקציה מיטוכונדריאלי assay, לפזר אבקת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) 1.04 g, 2 גרם גלוקוז (2%) 90 מ ל מים סטרילי, חמים התקשורת 37 מעלות צלזיוס. להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 5 M NaOH ובצע את עוצמת הקול 100 מ ל מים סטריליים.
   2. עבור מתח glycolytic assay, להמיס 1.04 גרם אבקת RPMI 1640 לבד במים סטריליים 90 מ ל, לחמם את המדיה 37 ° C ולהתאים את ה-pH ל 7.4. לבצע את עוצמת הקול 100 מ ל מים סטריליים. אבקת RPMI 1640 יש אין ביקרבונט, אשר חיוני לעקוב אחר השינוי pH כאמצעי של גליקוליזה במהלך וזמינותו.
2. הזרקת תרכובות.
   1. להכין 1 מ' מניות גלוקוז במים סטריליים, חנות ב-20 ° C.
   2. להכין 100 מ מ oligomycin מניות של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), aliquot בכמויות קטנות ולאחסן ב-20 ° C.
   3. להכין מניות A antimycin 100 מ מ של דימתיל סולפוקסיד, aliquot בכמויות קטנות ולאחסן ב-20 ° C.
   4. הכן 100 מ מ שאם המניה (חומצה salicylhydroxamic) אתנול ביום של וזמינותו.
   5. להכין 1 מ' KCN במים סטריליים ביום וזמינותו.

3. ציפוי של צלחת assay עם פולי-D-ליזין (PDL)

הערה: לבצע את כל להלן השלבים ברדס למינריות.

1. להמיס ליזין פולי-D במים כיתה תרביות רקמה כדי להפוך 50 הריכוז הסופי של µg/mL. לערבב את זה טוב, aliquot לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL ולאחסן ב-20 ° C לטווח ארוך.
   הערה: יש צורך µL 50 לכל טוב, עבור 24 וולס, מ ל 1.2 נדרש. לכן, aliquot לפחות 1.3 mL למחזור microcentrifuge.
2. הוסף µL 50 לכל טוב, דגירה בטמפרטורת החדר עם המכסה מכוסה במשך 1-2 h.
3. האחות הפתרון ולשטוף פעם אחת עם 500 µL תרביות רקמה סטרילי כיתה מים.
4. פותחים את המכסה ולאפשר הבארות מהאוויר היבש. שימוש לצלחת באותו יום או חנות ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר 2-3 ימים.

4. הידרציה של חיישן מחסנית

הערה: לבצע שלב זה יום אחד לפני הניסוי.

1. פתח את שטף נוספת Assay ערכת ולהסיר את התוכן. מקם את מחסנית חיישן הפוך ליד הלוחית השירות (איור 2).
2. מלא כל טוב של צלחת השירות עם 1 מ ל calibrant, למקם את חיישן מחסנית בחזרה. ודא החיישנים המכילים fluorophores (כדי למדוד את חמצן ו- pH) הם שקועים את calibrant.
3. דגירה את המחסנית חיישן בן לילה חממה-CO₂ ב 37 º C.

5. זריעת תאי הלוחות מצופים PDL וגדל

1. לחסן אלביקנס ג במרק YPD ולגדול בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס ב שייקר ב 200 סל ד.
   הערה: מבוסס על העיצוב assay, הריבית, אלביקנס ג ניתן גם לגדל YPG או בינונית מזערי.
2. ביום של assay, לדלל את המספר המתאים של תאים המדיום assay להניב ריכוז סופי של 100,000 תאים לכל 100 µL.
3. להוסיף 100 µL של התאים מדולל לבאר כל צלחת assay חוץ בארות A1, B4, C3 ו- D6, שבו הוסף רק 100 µL של המדיום assay לתיקון רקע (איור 3).
4. להעביר את הצלחת חממה-CO₂ ב 37 מעלות צלזיוס, תקופת דגירה של 60 דקות, אשר יאפשר את התאים לדבוק פני השטח צלחת.

6. assay פרוטוקול

הערה: פרוטוקול שמפורטות כאן הוא עבור תבנית 24-טוב של המכשיר. אמצעי אחסון יהיה עליך לכוונן אם נעשה שימוש בתבנית אחרת.

1. וזמינותו של פונקציה מיטוכונדריאלי
   1. הכנת תרכובות
      1. הכנת תרכובות-ריכוז 10 x עבור הפונקציה מיטוכונדריאלי assay: להכין 20 מ מ. המזויפים, 100 מיקרומטר Oligomycin, 100 מ מ KCN, ו- 20 מיקרומטר Antimycin A במדיום assay המתאימים.
      2. להוסיף 50 µL דמה לתוך ה-port A, 55 µL Oligomycin ליציאת B, µL 62 KCN ליציאת C ו- A Antimycin µL 68 ליציאת D (איור 4).
2. מתח glycolytic assay
   1. הכנת תרכובות
      1. הכנת תרכובות-ריכוז 10 x עבור מתח glycolytic assay. להכין 100 מ מ גלוקוז, 100 מיקרומטר Oligomycin, 500 מ מ 2-Deoxy גלוקוז (2 די. ג'י), 20 מיקרומטר Antimycin A במדיום assay המתאימים.
      2. להוסיף 50 µL גלוקוז לתוך ליציאה A, 55 µL Oligomycin ליציאת ב', 2 µL 62-DG ליציאת C ו- A Antimycin µL 68 ליציאת ד
3. מעסיקים מנתח השטף נוספת, אשר מודד את קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב חוץ-תאית acidification (ECAR) של תאים חיים בתבנית 24-ובכן צלחת. להגדיר את פרוטוקול assay מראש.
4. פתח במנתח השטף נוספת, להגדיר את תבנית assay באמצעות הכרטיסיה אשף assay ובצע הדרכה צעד אחר צעד כדי למלא את כל המידע שעובר החוצה במהלך התקנת. ליצור את הפריסה קבוצה כמו דומה המוצג באיור5. להגדיר את הפרוטוקול כפי שמוצג בטבלה 1. להגדיר פריסות אלה מוביל לפני assay ולשמור במחשב. בזמנו של assay, לשחזר את פרוטוקול שנשמרו על-ידי פתיחת הקבצים המתאימים באפשרות ' פתח קובץ ' בכרטיסיה אשף assay (איור 5).
5. לטעון 10 x תרכובות של היציאות המתאימות של מיכל הדיו חיישן רטוב המכיל את calibrant וטען במגש המוביל של מנתח השטף נוספת. התחל את הכיול על ידי לחיצה על לחצן התחל במסך.
6. להוסיף 350 µL של המדיום assay בעדינות לצלחת תא לאורך צדי הבארות כדי למזער את ההפרעה תא כדי להביא את עוצמת הקול הסופי 450 µL.
7. להחליף את הצלחת השירות המכיל את calibrant עם לוחית assay ולהמשיך.
8. להסיר את מחסנית חיישן את הצלחת עם סיום וזמינותו. שמור את הקובץ הנמצא בתיקיית היעד המתאים.

7. ניתוח נתונים

1. להשתמש באזור תחת עקומת - השונות (חאן אל-ANOVA) ניתוח לשונית בתוכנה כדי לחשב את ההבדל המשמעותי בין הקבוצות על-ידי בחירת הפרמטרים המתאימים (OCR או ECAR), כפי שמוצג באיור 6.
2. בחר בקבוצות צריך להשוות.
3. להוסיף קבוצות ניתוח עבור ANOVA ולחץ על אישור.
   הערה: ניתוח חאן אל ANOVA זה יוסיף גיליון חדש קובץ המכיל חאן אל היא מחושבת עבור כל קבוצה להשוות ביניהם על-ידי ANOVA. זה ייתן טבלה של ערכים p כדי להציג את המשמעות.

תוצאות

המוקד של פרוטוקול זה היא לקבוע את הפונקציות bioenergetic של ג אלביקנס מוערך על ידי מנתח השטף נוספת. מוטציה אלביקנס ג חסר חלבון מיטוכונדריאלי Mam33 נכלל גם יחד עם זן המשלים שלו, mam33Δ/Δ::MAM33 לחקור את ההשפעות של המחיקה של חלבון מיטוכונדריאלי OCR, ECAR. MAM33 מקודד על חלבון ...

Discussion

ביואנרגיה השטף נוספת assay משמש כלי מצוין כדי לקרוא את הפונקציה מיטוכונדריאלי על ידי מדידת זרחון חמצוני (OXPHOS)-צריכת חמצן התלויים בזמן אמת. בנוסף, פונקציה glycolytic, אשר נמדד כמו שיעור חוץ-תאית acidification (שינוי ב- pH חוץ-תאית) יכול ייחקרו גם במקביל בניתוח בזמן אמת.

ציפוי מוצלחת של אלבי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025