Indagine di bio-energetica di Candida albicans utilizzando extracellulare Flux analisi Real-Time

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo graduale per studiare la respirazione mitocondriale e la funzione glicolitica in Candida Albicans utilizzando un analizzatore di flusso supplementare.

Abstract

I mitocondri sono organelli essenziali per il metabolismo cellulare e la sopravvivenza. Una varietà di eventi chiave si svolgono nei mitocondri, come la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi. Di conseguenza, la disfunzione mitocondriale è segnalata per svolgere un ruolo importante nella tolleranza al farmaco antifungino e virulenza dei patogeni fungini. Dati recenti hanno anche portato al riconoscimento dell'importanza dei mitocondri come un importante contributo alla patogenesi fungine. Nonostante l'importanza dei mitocondri in biologia fungina, sono scarsamente sviluppati metodi standardizzati per capire la sua funzione. Qui, presentiamo una procedura per studiare il tasso di consumo di ossigeno basale (OCR), una misura della respirazione mitocondriale e tassi di acidificazione extracellulare (ECAR), una misura della funzione glicolitica in ceppi di c. albicans . Il metodo descritto qui può essere applicato per eventuali ceppi Candidaspp. senza la necessità di purificare i mitocondri da cellule fungine intatte. Inoltre, questo protocollo può anche essere personalizzato alla schermata per inibitori della funzione mitocondriale in ceppi di c. albicans .

Introduzione

Infezioni fungine invasive uccidono oltre 1,5 milioni di persone ogni anno in tutto il mondo. Questo numero è in aumento a causa di un aumento del numero di persone che vivono con immunità compromessa, inclusi i neonati prematuri, anziani, destinatari del trapianto e cancro pazienti¹. C. albicans è un patogeno opportunista di fungo umano che fa parte della microflora umana. Abita anche le superfici mucose e il tratto gastrointestinale come un organismo commensale. C. albicans produce malattia sistemica grave in persone che hanno deficit immunitari, che hanno subito la chirurgia, o che sono state trattate con lunghi cicli di antibiotici. Il rango di specie di Candida tra le tre cause principali di malattie infettive nosocomiali (NID) in esseri umani^2,3,4,5,6,7. Il numero globale annuale delle infezioni da Candida flusso sanguigno è stimata intorno a ~ 400.000 casi, con mortalità associata di 46-75%¹. La mortalità annua a causa della candidosi è all'incirca 10.000 negli Stati Uniti da solo. Nella misura del NID causate da funghi si riflette anche nella astronomico spese paziente⁵. Negli Stati Uniti, la spesa annua per il trattamento di infezioni fungine invasive supera $ 2 miliardi, l'aggiunta di uno sforzo enorme per sistema sanitario già oberati di lavoro. Attualmente, le terapie antifungine standard disponibili sono limitate a causa di tossicità, sempre più diffuso di farmacoresistenza e interazioni farmaco-farmaco. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di identificare nuovi bersagli di farmaco antifungino che si tradurrà in migliori opzioni di trattamento per pazienti ad alto rischio. Tuttavia, la scoperta di nuovi farmaci che agiscono su bersagli fungine è complicata perché i funghi sono eucarioti. Questo limita notevolmente il numero di bersagli farmacologici specifici fungine.

Recenti studi hanno indicato che i mitocondri sono un contributo critico alla virulenza fungina e la tolleranza alle droghe antifungose poiché i mitocondri sono importanti per la respirazione cellulare, il metabolismo ossidativo, trasduzione del segnale e apoptosi^{8 ,9,10,11}. Metabolismo glicolitico sia non-glicolitico sono essenziali per la sopravvivenza dei albicans del c. nel mammifero ospite^{12,13,14,15,16}. Inoltre, diversi mutanti di c. albicans carente di proteine mitocondriali, come Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 ecc. sono stati indicati per essere difettoso in filamentazione, un fattore di virulenza importante di albicans del c.^{17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22}. Inoltre, questi mutanti inoltre sono stati indicati per essere attenuato per virulenza in un modello murino di diffusi candidosi^{17,18,19,20,21 ,22}. Così, i mitocondri fungini rappresentano un obiettivo attraente per la scoperta di nuovi farmaci. Tuttavia, lo studio della funzione mitocondriale in c. albicans è impegnativo, perché c. albicans è petite negativo²³, che significa che essa non può sopravvivere senza il genoma mitocondriale.

Qui, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per studiare la funzione mitocondriale e glicolitica a albicans del c. senza la necessità di purificare i mitocondri. Questo metodo può anche essere ottimizzato per studiare l'effetto della manipolazione genetica o modulatori chimici sulle vie mitocondriale e glicolitiche in c. albicans.

Protocollo

Nota: Il protocollo dettagliato e graduale del dosaggio è descritto di seguito, e il protocollo schematico è illustrato nella Figura 1.

1. ceppi di c. albicans e le condizioni di crescita

1. Crescono i ceppi di c. albicans in terreno liquido di lievito estratto-Peptone-destrosio (YPD) a 30 °C in un agitatore incubatore durante la notte.
   Nota: Mantenere ceppi di Candida come gli stock congelati e crescono sull'agar YPD (1% di Estratto di lievito, 2% di peptone, destrosio di 2% e 2% agar).

2. preparazione dei reagenti

1. Preparare il supporto di test come segue:
   1. Per l'analisi di funzione mitocondriale, sciogliere la polvere di 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g e 2 g di glucosio (2%) in 90 mL di acqua sterile e caldo i media a 37 ° C. Regolare il pH a 7.4 utilizzo 5 M NaOH e portare il volume a 100 mL con acqua sterile.
   2. Per l'analisi di stress glicolitico, sciogliere 1,04 g polvere di RPMI 1640 sola in 90 mL di acqua sterile, caldo i media a 37 ° C e regolare il pH a 7,4. Portare il volume a 100 mL con acqua sterile. Polvere di RPMI 1640 non ha nessun bicarbonato, che è fondamentale per monitorare il cambiamento di pH come misura della glicolisi durante il dosaggio.
2. Composti di iniezione.
   1. Preparare 1 M brodo di glucosio in acqua sterile e conservare a-20 ° C.
   2. Preparare 100 mM oligomycin stock in dimetilsolfossido (DMSO), aliquota in piccoli volumi e conservare a-20 ° C.
   3. 100 mM antimycin A stock in DMSO, aliquota in piccoli volumi di preparare e conservare a-20 ° C.
   4. Preparare 100 mM SHAM (acido salicylhydroxamic) magazzino in etanolo il giorno del test.
   5. Preparare 1 M KCN in acqua sterile il giorno del test.

3. rivestimento della piastra dosaggio con poli-D-lisina (PDL)

Nota: Eseguire tutti i passaggi in una cappa laminare qui sotto.

1. Sciogliere Poly-D lisina in acqua di grado di coltura del tessuto per ottenere la concentrazione finale di 50 µ g/mL. Mescolare bene e aliquota in una microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-20 ° C per il lungo termine.
   Nota: 50 µ l per pozzetto è necessaria, e per 24 pozzetti, sono necessari 1,2 mL. Di conseguenza, aliquota almeno 1.3 mL / tubo del microcentrifuge.
2. Aggiungere 50 µ l per pozzetto e incubare a temperatura ambiente con il coperchio coperto per 1-2 h.
3. Aspirare la soluzione e sciacquare una volta con acqua grado di 500 µ l sterili per coltura.
4. Aprire il coperchio e lasciare asciugare i pozzetti per aria. Utilizzare la piastra sullo stesso giorno o conservare a 4 ° C per un massimo di 2-3 giorni.

4. idratazione della cartuccia sensore

Nota: Eseguire questo passaggio un giorno prima dell'esperimento.

1. Aprire il flusso supplementare Assay Kit e rimuovere il contenuto. Posizionare la cartuccia sensore testa in giù accanto alla piastra di utilità (Figura 2).
2. Riempire ciascun pozzetto della piastra utilità con 1 mL di calibratore ed inserire la cartuccia sensore indietro. Assicurarsi che i sensori contenenti fluorofori (per misurare l'ossigeno e pH) sono sommerse nel calibratore.
3. Incubare la cartuccia sensore durante la notte in un non-CO₂ in incubatore a 37 ° C.

5. la coltivazione e semina di cellule nelle piastre rivestite con PDL

1. Inoculare i albicans del c. nel brodo YPD e crescere durante la notte a 30 ° C in un agitatore a 200 giri/min.
   Nota: In base alla progettazione di dosaggio e l'interesse, albicans del c. possono anche essere coltivate in YPG o terreno minimo.
2. Il giorno del test, diluire un numero adeguato di cellule in medium di analisi per ottenere una concentrazione finale di 100.000 cellule per 100 µ l.
3. Aggiungere 100 µ l delle cellule diluite in ciascun pozzetto della piastra saggio tranne che nei pozzetti A1, B4, C3 e D6, in cui aggiungere solo 100 µ l di medium di analisi per la correzione del fondo (Figura 3).
4. Il piano di trasferimento per un non-CO₂ incubatore a 37 ° C ed incubare per 60 min, che vi permetterà le cellule di aderire alla superficie della placca.

6. protocollo di analisi

Nota: Il protocollo descritto qui è per il formato a 24 pozzetti dello strumento. Volumi dovranno essere corretti se viene utilizzato un altro formato.

1. Analisi della funzione mitocondriale
   1. Preparazione di composti
      1. Preparare composti alla concentrazione di 10 x per l'analisi di funzione mitocondriale: preparare 20 mM SHAM, 100 µM Oligomycin, 100mm KCN e 20 µM Antimycin A nel medium di analisi corrispondente.
      2. Aggiungere 50 µ l SHAM in porta A, 55 µ l Oligomycin nella porta B, 62 µ l KCN in porta C e 68 µ l Antimycin A porta D (Figura 4).
2. Analisi di stress glicolitico
   1. Preparazione di composti
      1. Preparare composti alla concentrazione di 10 x per l'analisi di stress glicolitico. Preparare 100 mM glucosio, 100 µM Oligomycin, 500 mM 2-deossi glucosio (2DG) e 20 µM Antimycin A nel medium di analisi corrispondente.
      2. Aggiungere il glucosio di 50 µ l in porta A, 55 µ l Oligomycin nella porta B, 62 µ l 2-DG in porta C e 68 µ l Antimycin A porta D.
3. Impiegano analizzatore di flusso supplementare, che misura il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di cellule vive in un formato di piastra a 24 pozzetti. Impostare il protocollo di dosaggio in anticipo.
4. Aprire l'analizzatore di flusso supplementare e impostare il modello di analisi utilizzando la scheda di analisi guidata e seguire passo per passo le istruzioni per compilare tutte le informazioni che fuoriesce durante l'installazione. Generare il layout del gruppo come simile a illustrato nella Figura 5. Impostare il protocollo, come illustrato nella tabella 1. Impostare questi layout ben in anticipo prima del dosaggio e salvare nel computer. Al momento dell'analisi, è necessario ripristinare il protocollo salvato aprendo il file corrispondente nell'opzione Apri file nella scheda di creazione guidata di dosaggio (Figura 5).
5. I composti di 10 volte le rispettive porte della cartuccia sensore idrata contenente il calibratore di caricare e caricare nel vassoio portante dell'analizzatore flusso supplementare. Avviare la calibrazione premendo il tasto Start sullo schermo.
6. Aggiungere 350 µ l di medium di analisi delicatamente alla piastra cellulare lungo il lato dei pozzetti per ridurre al minimo la dispersione delle cellule per portare il volume finale a 450 µ l.
7. Sostituire la piastra di utilità che contiene il calibratore con la piastra di dosaggio e continuare.
8. Rimuovere la cartuccia del sensore e la piastra una volta completato il test. Salvare il file nella cartella di destinazione appropriata.

7. analisi dei dati

1. Utilizzare l'area sotto la curva - analisi della varianza (AUC-ANOVA) scheda analisi del software per calcolare la differenza significativa tra i gruppi selezionando i rispettivi parametri (OCR o ECAR) come mostrato nella Figura 6.
2. Selezionare i gruppi che devono essere confrontati.
3. Aggiungere ai gruppi di analisi per ANOVA e fare clic su Ok.
   Nota: Questa analisi ANOVA AUC aggiungerà un nuovo foglio del file in cui l'AUC è calcolato per ogni gruppo e rispetto tra di loro mediante ANOVA. Questo vi darà una tabella di valori di p per mostrare il significato.

Risultati

Il fuoco di questo protocollo è quello di determinare le funzioni bioenergetiche di albicans del c. valutata dall'analizzatore di flusso supplementare. Un mutante di albicans del c. che mancano della proteina mitocondriale Mam33 inoltre è incluso insieme al relativo sforzo di complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 per studiare gli effetti dell'eliminazione di una proteina mitocondriale su OCR ed ECAR. MAM33 codifica per una proteina di matrice silicea mitocon...

Discussione

La bioenergetica analisi flusso supplementare serve come un ottimo strumento per leggere la funzione mitocondriale misurando la fosforilazione ossidativa (OXPHOS)-consumo di ossigeno dipendenti in tempo reale. Inoltre, una funzione glicolitica che viene misurata come un tasso di acidificazione extracellulare (cambiamento del pH extracellulare) può anche essere studiata allo stesso tempo nell'analisi in tempo reale.

Placcatura successo di c. albicans nella piastra di dosaggio è uno d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025